秋水仙素對(duì)桃金娘種子的誘變效應(yīng)

孫利娜，吳林巧，李 冰，李進(jìn)華，孫開(kāi)道，張照遠(yuǎn)，林 茂

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530002；2.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)勘測(cè)設(shè)計(jì)院，廣西南寧 530011）

桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）為桃金娘科（Myrtaceae）桃金娘屬植物?；ㄓ虚L(zhǎng)梗，常單生，紫紅色；花期4— 5月；漿果呈卵狀壺形，熟時(shí)呈紫黑色；在我國(guó)，主要生長(zhǎng)在臺(tái)灣、福建、廣東、廣西、云南、貴州及湖南南部等地；生于丘陵坡地，為酸性土指示植物。桃金娘果可食用；全株可供藥用，有活血通絡(luò)、收斂止瀉和補(bǔ)虛止血的功效；常被應(yīng)用在園林綠化和生態(tài)環(huán)境建設(shè)中，是進(jìn)行山坡復(fù)綠和水土保持的常綠灌木[1-2]。

秋水仙素是多倍體育種中常用的化學(xué)誘變劑之一，能使特異性細(xì)胞中微管的蛋白質(zhì)元件相結(jié)合，抑制紡錘體的運(yùn)動(dòng)，使染色體數(shù)目倍增，形成同源多倍體。目前，秋水仙素已在曼陀羅（Datura stra?monium）、杜仲（Eucommia ulmoides）、毛白楊（Popu?lus tomentosa）、白花泡桐（Paulownia fortunei）和葡萄（Vitis vinifera）等植物中應(yīng)用，成功培育出多倍體品種[3]。桃金娘的研究主要集中在有性繁殖[4-6]、無(wú)性繁殖[7-11]及藥用和食用[12-17]等方面，未見(jiàn)使用秋水仙素對(duì)桃金娘種子進(jìn)行誘變的相關(guān)報(bào)道。本研究以桃金娘種子為材料，設(shè)置不同秋水仙素濃度和浸泡時(shí)間，研究各處理對(duì)桃金娘種子發(fā)芽、幼苗移栽成活及變異的影響，探索秋水仙素對(duì)桃金娘的誘變效應(yīng)，為桃金娘種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年8月21日，在廣西防城港上思縣那琴鄉(xiāng)采收桃金娘種子，處理后立即播種；2020年8月23日—8月29日，將種子播種在廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院園林花卉所苗圃?xún)?nèi)。

1.2 方法

1.2.1 種子與基質(zhì)處理

將桃金娘果肉碾碎，用沙粒與果肉反復(fù)摩擦，直到果肉與種子完全分離，用清水反復(fù)沖洗種子，直到清洗干凈。在遮光和常溫條件下，采用5 000 mg/L 硝酸鉀溶液浸泡種子12 h，再根據(jù)試驗(yàn)方案開(kāi)展試驗(yàn)。

以河沙為基質(zhì)；將河沙裝入無(wú)孔穴盤(pán)（60 cm ×30 cm×10 cm）；基質(zhì)厚度5 cm。

1.2.2 誘變處理與播種

先用少量無(wú)水酒精溶解秋水仙素，再用蒸餾水稀釋。設(shè)置6 個(gè)秋水仙素濃度，分別為0、0.5、1、3、5和10 mg/mL；設(shè)置4 個(gè)浸泡時(shí)間，分別為12、24、36和48 h，共24 個(gè)處理（表1）。每處理300 粒種子，3次重復(fù)，共21 600 粒種子。完成浸種處理后，用蒸餾水沖洗種子5 次，然后播種。均勻地把種子播種在河沙基質(zhì)中，再覆蓋2 cm 河沙，用手輕輕壓緊，最后用1 000 倍多菌靈水溶液淋透基質(zhì)。播種后，基質(zhì)濕度保持在60%～70%，環(huán)境溫度為25～30 ℃。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Experimental design

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

播種后，連續(xù)觀測(cè)桃金娘種子發(fā)芽情況，持續(xù)90天。每15天為1個(gè)時(shí)間段，統(tǒng)計(jì)15、30、45、60、75和90天時(shí)的發(fā)芽率，分析種子發(fā)芽趨勢(shì)。

播種后，每天觀察并記錄種子發(fā)芽情況。桃金娘種子發(fā)芽勢(shì)不整齊，連續(xù)1周無(wú)種子發(fā)芽時(shí)，結(jié)束觀察，計(jì)算發(fā)芽率。

桃金娘植株株高2～3 cm、含有4～6張葉片時(shí)，進(jìn)行移栽。2021年6月，統(tǒng)計(jì)幼苗移栽成活數(shù)，計(jì)算成活率；2021年12月，統(tǒng)計(jì)變異數(shù)，計(jì)算變異率。測(cè)定表型變異株的株高和地徑，觀察葉形、株型和葉色等指標(biāo)；分別采用卷尺（精度為0.01 cm）、數(shù)顯游標(biāo)卡尺（精度為0.01 mm）和比色卡（皇家園藝出版）測(cè)定株高和地徑及對(duì)比葉色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；采用SPSS軟件進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下桃金娘種子的發(fā)芽趨勢(shì)

播種15 天時(shí)，所有處理的種子發(fā)芽率均不到1%；播種30、45、60、75 和90 天時(shí)，發(fā)芽率最高的處理分別為 T11（1.78%）、T14（47.67%）、T10（77.00%）、T10（81.89%）和T10（82.33%）處理；發(fā)芽高峰為播種后30～75 天（圖1）。T10 處理前期的發(fā)芽率較低，播種45天后的發(fā)芽率均最高。

圖1 不同處理下桃金娘種子的發(fā)芽趨勢(shì)Fig.1 Effects of different treatments on germination trends of R.tomentosa seeds

2.2 相同濃度不同浸泡時(shí)間對(duì)桃金娘種子發(fā)芽的影響

濃度為0、1、3 和10 mg/mL 時(shí)，浸泡24 h 的種子發(fā)芽率最高；其中，濃度為0 和10 mg/mL 時(shí)，與其他浸泡時(shí)間均差異顯著（P< 0.05）（圖2）。濃度為0.5和5 mg/mL時(shí)，浸泡12 h的發(fā)芽率最高；其中，濃度為5 mg/mL時(shí)，與其他浸泡時(shí)間均差異顯著（P<0.05）。

圖2 相同濃度不同浸泡時(shí)間對(duì)桃金娘的影響Fig.2 Effects of different soaking time at the same concentration on R.tomentosa

2.3 不同處理對(duì)桃金娘種子發(fā)芽及幼苗移栽成活和變異的影響

濃度為0 mg/mL 時(shí)，4個(gè)浸泡時(shí)間的種子發(fā)芽率為57.11% ～ 64.11%；有6 個(gè)處理的發(fā)芽率均高于0 mg/mL 濃度時(shí)的最高發(fā)芽率，分別為T(mén)5、T10、T12、T14、T15 和T17 處理；T10 處理的發(fā)芽率最高（82.33%），其次為T(mén)17 處理（79.67%），T24 處理最低（54.56%）（表2）。浸泡12 h時(shí)，濃度為5 mg/mL處理的發(fā)芽率最高，與其他5 個(gè)濃度處理均差異顯著（P< 0.05）；浸泡24 和48 h 時(shí)，濃度為1 mg/mL 處理的發(fā)芽率最高，與其他5 個(gè)濃度處理均差異顯著（P< 0.05）。總體來(lái)看，濃度為1 和5 mg/mL 及浸泡時(shí)間為12和24 h，發(fā)芽效果較好；其中，T10處理（濃度1 mg/mL，浸泡24 h）效果最好。

表2 不同處理對(duì)桃金娘種子發(fā)芽率及幼苗移栽成活率和變異率的影響Tab.2 Effects of different treatments on germination rates of seeds and transplanting survival rates and variation rates of seedlings of R.tomentosa

濃度為0 mg/mL 時(shí)，4個(gè)浸泡時(shí)間的幼苗移栽成活率為57.84%～71.73%；有8 個(gè)處理的成活率高于0 mg/mL 濃度時(shí)的最高成活率，分別為T(mén)9、T6、T10、T11、T12、T18、T22和T23處理；T11處理的成活率最高（96.09%），其次為T(mén)10 處理（93.39%），T24 處理最低（36.43%）。相同浸泡時(shí)間下，1 mg/mL 濃度處理的幼苗移栽成活率均最高，與其他處理均差異顯著（P<0.05），均在90%以上。

有16 個(gè)處理產(chǎn)生變異，共獲得112 株表型變異株；0 mg/mL 濃度處理均不能產(chǎn)生變異。變異率最高的為T(mén)24 處理（8.50%），其次為T(mén)16、T7 和T10 處理，分別為5.21%、4.81%和3.74%。

2.4 表型變異株的形態(tài)特征

與對(duì)照（處理1）相比，幼苗變異特征主要為株型緊湊或松散、節(jié)間縮短、分枝增多、枝條柔軟、葉片橢圓或邊緣反卷且狹長(zhǎng)和葉片增厚等（表3，圖2）。葉色均為GREEN GROUP 137 Moderate Olive Green B。

圖2 桃金娘部分表型變異株Fig.2 Partial phenotypic variants of R.tomentosa

表3 主要變異類(lèi)型的形態(tài)指標(biāo)Tab.3 Morphological indicators of major variant types

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本研究采用秋水仙素處理桃金娘種子，發(fā)現(xiàn)桃金娘種子發(fā)芽勢(shì)不整齊，發(fā)芽持續(xù)周期較長(zhǎng)，發(fā)芽高峰期為播種后30～75天，這與桃金娘自身的種子特性有關(guān)，在前期的播種繁殖時(shí)也出現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象。

濃度及處理時(shí)間是秋水仙素誘導(dǎo)突變必不可少的因素，本研究結(jié)果表明，濃度為0 mg/mL時(shí)，4個(gè)浸泡時(shí)間的種子發(fā)芽率為57.11%～64.11%；有6 個(gè)處理的發(fā)芽率均高于0 mg/mL 濃度時(shí)的最高發(fā)芽率，說(shuō)明一定濃度的秋水仙素和適宜的浸泡時(shí)間對(duì)桃金娘種子萌發(fā)有促進(jìn)作用。徐佳琦[18]研究表明，隨秋水仙素濃度增加，洋紫荊（Bauhinia variegate）種子發(fā)芽率降低；0.5 和1 mg/mL 濃度下處理24 h 有利于種子發(fā)芽。路珂瑀等[19]研究表明，適宜濃度秋水仙素對(duì)小麥（Triticum aestivum）種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，其作用效果與新型植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑蕓苔素內(nèi)酯相當(dāng)，可將秋水仙素作為新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，進(jìn)行開(kāi)發(fā)。

翟秀明等[20]研究指出，茶樹(shù)腋芽成活率隨秋水仙素濃度增加和處理時(shí)間延長(zhǎng)而降低，且不同處理時(shí)間和濃度間，腋芽成活率變異較大。本研究中，所有處理的種子發(fā)芽率和絕大部分處理的幼苗移栽成活率均高于50%，發(fā)芽率和成活率并不隨秋水仙素濃度增加和浸泡時(shí)間延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)。這可能是因?yàn)椴煌锓N對(duì)秋水仙素的敏感性不同；且本研究設(shè)置的浸泡時(shí)間最長(zhǎng)只有48 h，秋水仙素作用時(shí)間較短，可能不能充分發(fā)揮作用。

秋水仙素誘導(dǎo)植物組織材料后，會(huì)出現(xiàn)不同類(lèi)型的變異特征。本研究共獲得112株桃金娘表型變異株，其中采用10 mg/mL濃度秋水仙素處理48 h 可獲得最高的變異率，部分處理未獲得變異株。桃金娘表型變異株以株型緊湊或松散、節(jié)間縮短、分枝增多、枝條柔軟、葉片橢圓或邊緣反卷且狹長(zhǎng)和葉片增厚為主要特征，大部分表型變異株有隨植株生長(zhǎng)變異特征逐漸消失的趨勢(shì)。任雪羽[21]研究發(fā)現(xiàn)，使用0.2%秋水仙素處理木槿（Hibiscus syriacus）種子后，苗木出現(xiàn)株高矮化、莖段增粗、節(jié)間距縮短和葉片長(zhǎng)寬增大等變異現(xiàn)象，與本研究部分變異特征一致；一定濃度的秋水仙素和浸泡時(shí)間可能會(huì)抑制植株節(jié)間伸長(zhǎng)。

之后，可繼續(xù)觀測(cè)表型變異株，并采用組織顯微切片和分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行研究；本研究設(shè)置的秋水仙素濃度和浸泡時(shí)間對(duì)桃金娘種子誘導(dǎo)的變異率較低，需進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)方法；為獲得更多變異株，可用秋水仙素對(duì)桃金娘頂芽進(jìn)行誘變處理。

3.2 結(jié)論

本研究通過(guò)設(shè)置不同秋水仙素濃度和浸泡時(shí)間，研究各處理對(duì)桃金娘種子發(fā)芽及幼苗的影響。采用1 mg/mL 濃度浸泡24 h，種子發(fā)芽率最高，幼苗移栽成活率和變異率均較高，可采用該方法對(duì)桃金娘種子進(jìn)行處理。濃度為1 mg/mL時(shí)，4個(gè)浸泡時(shí)間處理的幼苗移栽成活率均在90%以上，與其他濃度處理差異顯著；其中，浸泡36 h 的成活率最高；有16個(gè)處理產(chǎn)生變異，共獲得112株表型變異株，其中秋水仙濃度為10 mg/mL、浸泡時(shí)間48 h 處理的變異率最高。