HBV感染免疫耐受期孕婦分娩前后臨床指標(biāo)及細(xì)胞因子水平變化特征

魯俊鋒，祖紅梅，王莉林，劉 丹，馬麗娜，鄭素軍，陳新月，胡中杰

母嬰傳播是我國(guó)HBV感染的主要傳播途徑，約占全部HBV感染的40%[1]。根據(jù)國(guó)內(nèi)外最新的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）防治指南，對(duì)免疫耐受期、高病毒載量的HBV感染孕婦在妊娠晚期均推薦抗病毒干預(yù)，但這些患者分娩后肝功能并非依然呈“耐受狀態(tài)”[2-4]。既往有研究發(fā)現(xiàn)，部分CHB孕婦分娩后可出現(xiàn)氨基轉(zhuǎn)移酶升高或伴有自發(fā)的HBeAg清除/轉(zhuǎn)換[5-7]。然而，HBV感染免疫耐受期孕婦分娩后臨床指標(biāo)的變化仍缺少相關(guān)的研究，具體免疫學(xué)機(jī)制仍不清楚。為此，本研究對(duì)HBV感染免疫耐受期孕婦分娩前后的生化、病毒學(xué)、血清學(xué)等臨床指標(biāo)以及細(xì)胞因子的變化進(jìn)行分析，探討潛在的免疫學(xué)影響因素，為產(chǎn)后抗病毒治療提供理論基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇2015年1月—2017年12月就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院的52例HBV感染免疫耐受期孕婦作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往未接受過抗病毒治療；②妊娠前、妊娠期間至少2次血清ALT和AST在正常范圍；③HBeAg≥500 COI，HBV DNA ≥ 6 lg IU/ml。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并HAV、HCV、HEV等病毒感染者；②合并自身免疫性肝病者；③代償或失代償期肝硬化患者；④妊娠期合并產(chǎn)科并發(fā)癥如先兆子癇、肝內(nèi)膽汁淤積等；⑤妊娠期并發(fā)其他疾病，需服用藥物者。所有患者于妊娠28周給予替比夫定（telbivudine, LdT）抗病毒干預(yù)，分別于干預(yù)前（基線）、分娩前2周、分娩后6周進(jìn)行生化、血清學(xué)及病毒學(xué)檢測(cè)，同步留取相應(yīng)節(jié)點(diǎn)外周靜脈血標(biāo)本，-80℃保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法 HBV血清學(xué)檢測(cè)采用羅氏Elecsys HBsAgⅡ試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，HBsAg定量檢測(cè)下限為0.05 IU/ml，HBeAg＞1.0 COI為陽性。HBV DNA檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)，檢測(cè)下限為20 IU/ml（COBAS Taqman，羅氏診斷公司）。肝功能檢測(cè)采用OLYMPUSAU5400生化檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，ALT正常值上限（upper limit of normal, ULN）為 40 U/L。細(xì)胞因子采用多細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒（Bio-Plex Pro Assays），包括 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和 TNF-α。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示。不同時(shí)間點(diǎn)的ALT、HBV DNA、HBeAg、HBsAg比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較采用 LSD-t檢驗(yàn)。不同組間細(xì)胞因子比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或2樣本比較秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況 52例患者均為HBeAg陽性CHB，平均年齡為（29.3±4.3）歲，ALT基線平均水平為（18.4±7.6）U/L，HBsAg基線中位水平為4.6 lg IU/ml，HBeAg基線平均水平為（3.3±0.1）lg COI，HBV DNA 基線中位水平為8.2 lg IU/ml。16例患者的HBV為基因B型，36例患者的HBV為基因C型。

2.2 分娩前后生化、病毒學(xué)及血清學(xué)指標(biāo)的變化 52例患者LdT干預(yù)前、分娩前ALT水平均在正常值范圍，分娩后ALT≥2倍ULN者占28.8%（15/52），ULN＜ ALT＜ 2倍 ULN者占26.9%（14/52），ALT水平正常者占44.2%（23/52）。由于妊娠晚期LdT抗病毒治療，分娩前HBV DNA水平較LdT干預(yù)前顯著降低，平均降幅達(dá)（3.68±0.79） Ig IU/ml，但分娩后6周HBV DNA水平明顯高于分娩前（P均＜0.05）；LdT干預(yù)前、分娩前、分娩后HBeAg和HBsAg水平均無明顯變化。52例患者中，35例分娩后即刻停用LdT，17例分娩后6周停用LdT，中位ALT水平分別為32.8（21.45，70.25）U/L 和37.2（26.5，86.4）U/L，在分娩后無明顯差異（Z=0.664，P=0.507）；分娩后即刻停藥的患者，71.4%（25/35）HBV DNA水平在分娩后6周完全恢復(fù)至LdT干預(yù)前水平。見表1。

表1 52例患者LdT干預(yù)前、分娩前、分娩后生化、血清學(xué)、病毒學(xué)指標(biāo)變化（±s）Table 1 Changes of biochemical, serological and virological markers levles in 52 patients before LdT intervention, ante partum and post partum (±s)

表1 52例患者LdT干預(yù)前、分娩前、分娩后生化、血清學(xué)、病毒學(xué)指標(biāo)變化（±s）Table 1 Changes of biochemical, serological and virological markers levles in 52 patients before LdT intervention, ante partum and post partum (±s)

注：*. M（P25，P75）

指標(biāo) LdT干預(yù)前 分娩前 分娩后 F時(shí)間 P值A(chǔ)LT (U/L) 18.44±7.59 17.95±8.20 33.2 (22.85, 75.80)* 44.470 0.000 HBV DNA (Ig IU/ml) 8.08±0.39 4.40±0.98 6.77±1.73 108.410 0.000 HBeAg (Ig COI) 3.30±0.05 3.28±0.18 3.26±0.21 0.560 0.509 HBsAg (Ig IU/ml) 4.50±0.26 4.47±0.28 4.48+0.28 0.840 0.373

2.3 分娩前后細(xì)胞因子水平的變化 對(duì)52例患者在LdT干預(yù)前、分娩前、分娩后細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α在分娩前后均呈動(dòng)態(tài)變化，其中，IL-2中位水平在分娩前與LdT干預(yù)前無明顯變化，分娩后明顯低于分娩前（P＜0.05）；TNF-α中位水平在分娩前明顯低于LdT干預(yù)前（P＜0.05），分娩后較分娩前無明顯變化；余細(xì)胞因子水平在分娩前后的變化差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 52例患者LdT干預(yù)前、分娩前、分娩后細(xì)胞因子水平的變化Figure 1 Changes of cytokine levels in 52 patients before LdT intervention, ante partum and post partum

2.4 分娩后ALT≥2倍ULN組和ALT＜2倍ULN組間細(xì)胞因子水平比較 根據(jù)分娩后ALT水平的不同，分為ALT≥2倍ULN組和ALT＜2倍ULN組，對(duì)2組之間細(xì)胞因子水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，在LdT干預(yù)前，ALT≥2倍ULN組IFN-γ中位水平明顯低于ALT＜2倍ULN組，（Z=2.284，P=0.022），而IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α在2組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）；分娩后，ALT≥2倍ULN組患者中位IFN-γ水平明顯高于ALT＜2倍ULN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.223，P=0.026），余細(xì)胞因子水平在2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表2 LdT干預(yù)前ALT≥ 2倍ULN組與ALT＜2倍ULN組細(xì)胞因子水平比較（pg/ml）Table 2 Cytokine levels between ALT ≥ 2 times ULN group and ALT ＜ 2 times ULN group before LdT intervention (pg/ml)

3 討 論

所謂免疫耐受期是指HBsAg、HBeAg陽性，HBV DNA高載量，血清ALT和AST在正常值范圍，肝組織學(xué)檢查炎癥不明顯[2]。免疫耐受期患者不是抗病毒治療的適宜人群[2]。妊娠晚期抗病毒治療的目的是降低HBV母嬰傳播風(fēng)險(xiǎn)，并非針對(duì)HBV感染的孕婦本人進(jìn)行治療。然而，這些孕婦產(chǎn)后并非依然處于“免疫耐受”狀態(tài)。從既往文獻(xiàn)報(bào)道看，HBV感染孕婦產(chǎn)后可出現(xiàn)2種情況，一是產(chǎn)后較高比例的患者出現(xiàn)不同程度的氨基轉(zhuǎn)移酶升高或伴有自發(fā)的HBeAg清除/轉(zhuǎn)換[5-9]；二是產(chǎn)后出現(xiàn)肝炎發(fā)作的患者，采用以IFN為基礎(chǔ)方案抗病毒治療療效顯著好于一般CHB人群[10]。本研究中入組患者HBeAg≥500 COI且HBV DNA≥6 lgIU/ml，明顯為機(jī)體免疫耐受狀態(tài)，產(chǎn)后6周觀察到ALT≥2倍ULN者占28.8%，產(chǎn)后即刻停藥組與產(chǎn)后6周停藥組分娩后ALT水平無明顯差異。這些臨床現(xiàn)象間接提示產(chǎn)后ALT水平的升高可能與機(jī)體免疫功能的變化相關(guān)。

妊娠期是一個(gè)具有獨(dú)特且復(fù)雜免疫狀態(tài)的階段，在整個(gè)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育期間，為避免對(duì)胎兒的排異反應(yīng)，機(jī)體免疫功能趨于抗炎內(nèi)環(huán)境，而一旦胎兒發(fā)育完成，機(jī)體由抗炎內(nèi)環(huán)境向促炎內(nèi)環(huán)境的轉(zhuǎn)變對(duì)促進(jìn)分娩是必不可少的[11]。在非HBV感染人群中，文獻(xiàn)報(bào)道，妊娠期間細(xì)胞因子趨于以Th2型為主，而分娩后轉(zhuǎn)換為以Th1類細(xì)胞因子為主[12]。本研究中，雖2類細(xì)胞因子在分娩前后呈動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，但總體未顯示出一致變化的規(guī)律性，可能與HBV感染、機(jī)體的免疫應(yīng)答均有一定的關(guān)系。既往文獻(xiàn)報(bào)道，在HBV感染控制過程中，IFN-γ起到非常重要的作用。首先，IFN-γ可通過多種途徑發(fā)揮重要的作用：①募集和活化T細(xì)胞、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞來發(fā)揮它們的功能；②誘導(dǎo)T細(xì)胞形成抗HBV效應(yīng)細(xì)胞；③上調(diào)感染HBV的肝細(xì)胞上的主要組織相容性復(fù)合體的表達(dá)，促進(jìn)抗原加工和呈遞；④直接抗病毒的作用[13]。其次，在模擬急性HBV感染的小鼠模型中，NK細(xì)胞通過分泌IFN-γ促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的抗病毒活性[14]；在免疫激活的CHB患者中，NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞均可分泌IFN-γ，且與ALT水平的升高呈正相關(guān)[13-16]。HBV特異性CD8+T細(xì)胞可通分泌IFN-γ，抑制HBV的復(fù)制，降低肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA，使部分患者實(shí)現(xiàn)HBV的臨床治愈[15]。因此，IFN-γ在HBV感染過程中免疫激活、抗病毒療效及臨床治愈等多個(gè)方面均起到重要的作用。本研究中，根據(jù)分娩后ALT水平的不同對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行分析，結(jié)果顯示分娩后ALT≥2倍ULN組患者，在妊娠期間中位IFN-γ水平呈低水平表達(dá)，而分娩后呈高水平表達(dá)，這些結(jié)果提示分娩前后IFN-γ水平的變化可能與產(chǎn)后ALT水平的升高有關(guān)。然而，本研究不足之處在于，妊娠期間體內(nèi)多種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子形成復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在不同的妊娠階段，呈現(xiàn)不同的免疫狀態(tài)，以維持正常妊娠[11-12，17-19]。單個(gè)細(xì)胞因子變化尚不足以真實(shí)、完整地反映機(jī)體的免疫功能變化。

結(jié)合本研究團(tuán)隊(duì)前期研究，產(chǎn)后出現(xiàn)ALT升高的患者繼續(xù)采用聚乙二醇IFN為基礎(chǔ)方案抗病毒治療，可獲得較高的HBsAg/HBeAg血清學(xué)清除/轉(zhuǎn)換率[10]，提示HBV感染免疫耐受期孕婦分娩后若出現(xiàn)ALT水平的升高，可能與機(jī)體免疫功能的變化相關(guān)，或?yàn)楫a(chǎn)后的進(jìn)一步抗病毒治療創(chuàng)造合適的時(shí)機(jī)，須要更進(jìn)一步的深入研究。