GeneXpert MTB/RIF檢測技術在肺結(jié)核診斷及利福平耐藥分析中的應用研究

胡曉蓉，宋江勤

全球結(jié)核病患病率高，社會負擔重，我國是位列全球第二的結(jié)核病高負擔國家。WHO全球結(jié)核病報告顯示，2020年全球病原學陽性證據(jù)率為58%，我國為55%，低于全球水平，誤診和漏診率較高[1]。傳統(tǒng)的痰涂片、痰培養(yǎng)、傳統(tǒng)核酸擴增等方法周期較長。目前綜合醫(yī)院逐漸將快速分子生物學方法如GeneXpert MTB/RIF檢測法作為涂片的替代方法用于結(jié)核病及耐藥結(jié)核病病原學檢查的首選方法，而且也作為診斷結(jié)核病的金標準之一[1]。本研究分析了GeneXpert MTB/RIF檢測技術在肺結(jié)核診斷中的應用，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象 本研究為回顧性分析，收集2020年7月—2021年6月在天門市第一人民醫(yī)院就診疑似肺結(jié)核患者120例作為研究對象，其中男性患者59例，女性患者61例，年齡在29～59歲，平均年齡為（44.29±2.67）歲，體質(zhì)量指數(shù)平均為（24.58±2.06）kg/m2。所有患者均簽署知情同意書，并經(jīng)我院倫理委員會論證通過。患者入選標準：①所有研究對象均診疑似肺結(jié)核進我院治療；②所有患者均知情同意。排除標準：①合并自身免疫性疾病；②合并腫瘤疾病；③合并精神異常患者。

1.2 方法 所有患者均留取呼吸道痰標本，進行痰涂片、痰培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF檢測及比例法藥物敏感試驗（藥敏試驗）。GeneXpert MTB/RIF試劑盒購自美國Cepheid公司。

痰涂片：參照《中國結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》[2]萋-尼抗酸染色要求操作，并按照文獻規(guī)定的光學顯微鏡報告標準進行報告。

痰培養(yǎng)：羅氏固體培養(yǎng)法按照《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[3]對痰標本進行前期處理、固體培養(yǎng)操作。將患者的痰液接種到羅氏培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。每周觀察結(jié)果并報告陽性結(jié)果，若滿8周仍未有菌落生長，則報告培養(yǎng)陰性。

GeneXpert MTB/RIF檢測：按照GeneXpert MTB/RIF試劑盒操作手冊進行操作。取患者的痰液標本1 ml，向其中加入2 ml的樣本處理液，劇烈振蕩20次，或渦旋振蕩10 s，室溫孵育10 min，再重復振蕩10 s，室溫孵育5 min，使用新的移液管，將2 ml經(jīng)過處理的樣本加入GeneXpert MTB/RIF反應盒中進行反應，反應時間為2 h，觀察結(jié)果。

比例法藥敏試驗：用接種環(huán)取培養(yǎng)基或痰涂片上的菌落，研磨后與標準麥氏管比對，制成1 mg/ml菌懸液，接種到含利福平的羅氏固體培養(yǎng)基和空白對照管培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果。

1.3 觀察指標 計算Xpert MTB/RIF檢測MTB的診斷效能。靈敏度=真陽性病例數(shù)/（真陽性病例數(shù)+假陰性病例數(shù)）×100%；特異度=真陰性病例數(shù)/（真陰性病例數(shù)+假陽性病例數(shù)）×100%；一致率=（真陽性病例數(shù)+真陰性病例數(shù)）/總病例數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計算GeneXpert MTB/RIF檢測MTB的靈敏度和特異度；并計算GeneXpert MTB/RIF檢測與固體培養(yǎng)法、比例法藥敏試驗結(jié)果的一致率。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 120例疑似肺結(jié)核患者經(jīng)檢測，痰涂片陽性42例（35.00%），痰涂片陰性78例（65.00%）；痰涂片陰性患者中最后確診為肺部腫瘤、肺炎、支氣管擴張者7例。42例痰涂片陽性患者中，3例GeneXpert MTB/RIF檢測MTB結(jié)果為無效，無效率為7.14%。78例痰涂片陰性患者中，7例GeneXpert MTB/RIF檢測MTB結(jié)果為無效。最終可進行GeneXpert MTB/RIF檢測者110例；其中痰涂片陰性患者中3例GeneXpert MTB/RIF檢測利福平耐藥結(jié)果無法判斷，即最終可進行對比分析者107例。

2.2 GeneXpert MTB/RIF診斷肺結(jié)核的效能 107例疑似肺結(jié)核患者中，痰培養(yǎng)MTB陽性48例，其中GeneXpert MTB/RIF檢測MTB陽性41例；痰培養(yǎng)MTB陰性59例，其中GeneXpert MTB/RIF檢測MTB陰性52例。以痰培養(yǎng)結(jié)果為金標準，GeneXpert MTB/RIF檢測MTB的靈敏度為85.42%（41/48），特異度為88.14%（52/59）。GeneXpert MTB/RIF與痰培養(yǎng)診斷一致率為86.92%（93/107）。見表1。

表1 痰培養(yǎng)與GeneXpert MTB/RIF檢測MTB結(jié)果（例）Table 1 Results of sputum culture MTB and GeneXpert MTB/RIF detection MTB (cases)

進行GeneXpert MTB/RIF檢測107例疑似肺結(jié)核患者中，痰涂片陽性39例（36.45%），痰涂片陰性68例（63.55%）。以痰培養(yǎng)結(jié)果為金標準，痰涂片陽性患者中，GeneXpert MTB/RIF檢測MTB的靈敏度為97.22%（35/36），特異度為33.33%（1/3）（表2）；痰涂片陰性患者中，GeneXpert MTB/RIF檢測MTB的靈敏度為50.00%（6/12），特異度為91.07%（51/56）（表3）。

表2 痰涂片陽性患者痰培養(yǎng)與GeneXpert MTB/RIF檢測MTB結(jié)果（例）Table 2 Results of sputum culture and GeneXpert MTB/RIF detection in sputum smear positive patients (cases)

表3 痰涂片陰性患者痰培養(yǎng)與GeneXpert MTB/RIF檢測MTB結(jié)果（例）Table 3 Results of sputum culture and GeneXpert MTB/RIF detection in sputum smear negative patients (cases)

2.3 GeneXpert MTB/RIF藥敏試驗檢測效能 比例法藥敏試驗確認痰培養(yǎng)陽性36例患者中利福平耐藥者有4例（11.11%），敏感者有32例（88.89%）。以比例法藥敏結(jié)果為金標準，GeneXpert MTB/RIF檢測痰培養(yǎng)陽性患者利福平耐藥的靈敏度為75.00%（3/4），特異度為93.75%（30/32）。同時，對GeneXpert MTB/RIF與比例法藥敏試驗進行一致性檢驗，一致率為91.67%（33/36），2者具有較好的一致性。見表4。

表4 GeneXpert MTB/RIF藥敏試驗與比例法藥敏試驗結(jié)果（例）Table 4 Results of GeneXpert MTB/RIF drug sensitivity test and proportional drug sensitivity test (cases)

3 討 論

GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)是一種能夠快速診斷結(jié)核病并檢測結(jié)核桿菌耐藥性的全新系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要針對MTB的位于RpoB基因81 bp區(qū)域（密碼子426—452）的利福平耐藥突變區(qū)（該區(qū)域被稱為利福平耐藥決定區(qū)）設定引物、探針并進行擴增檢測，并根據(jù)其是否發(fā)生基因突變而確定被檢測樣本中是否含有MTB，而且也能檢測其是否對利福平耐藥[4]。該系統(tǒng)能夠?qū)颖具M行全自動的核酸提取、純化及濃縮，而且2 h便可出結(jié)果，是全自動的半定量巢式實時聚合酶鏈反應，具有更高的靈敏度和特異度，而且該系統(tǒng)的檢測過程是在完全封閉的檢測盒中進行的，因此該方法不僅具有操作簡單、高度全自動化的優(yōu)點，而且還有很好的生物安全性。該技術已被WHO和我國推薦作為用于快速診斷成人和兒童肺結(jié)核和肺外結(jié)核以及利福平耐藥，具有確診的作用[1]。

本研究結(jié)果顯示，以痰培養(yǎng)結(jié)果為金標準，GeneXpert MTB/RIF檢測TBM的靈敏度為85.42%，特異度為88.14%，GeneXpert MTB/RIF與痰培養(yǎng)診斷一致率為86.92%。這與國內(nèi)其他同行研究結(jié)果一致[1，4]。因此GeneXpert MTB/RIF檢測技術可有效的篩檢出肺結(jié)核陽性患者，且具備快速便捷的特征，彌補痰培養(yǎng)周期長的缺陷。值得注意的是，本研究所納入的107例患者為疑似肺結(jié)核病例，患者標本的低質(zhì)量或者弱陽性均會使得GeneXpert MTB/RIF檢測技術出現(xiàn)弱信號，從而得出錯誤的結(jié)論。同時，本研究對2種方法分析結(jié)果不一的病例進行分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)病例存在臨床特征不明顯、采集樣本較少的現(xiàn)象，這可能導致了GeneXpert檢測技術結(jié)果的誤判。

本研究進一步分析了GeneXpert MTB/RIF檢測技術分別在痰涂片陽性和陰性患者中對肺結(jié)核的診斷價值，結(jié)果顯示，痰涂片陽性患者中，GeneXpert MTB/RIF檢測MTB的靈敏度為97.22%，特異度為33.33%；痰涂片陰性患者中，GeneXpert MTB/RIF檢測MTB的靈敏度為50.00%，特異度為91.07%。這說明了人群發(fā)病率或病原體感染率的高低對某一診斷技術靈敏度和特異度的影響，即人群發(fā)病率越高，該診斷技術靈敏度越高，特異度越低，反之則靈敏度越低，特異度越高[5]。

在對患者的GeneXpert MTB/RIF檢查中，主要是將標本的處理、DNA提取以及核酸擴增等工作集于一體，在對患者進行病原微生物檢測過程中，及時有效對患者的耐藥基因進行檢測，在實際的檢測過程中，通過多通道的檢測，一般可在2 h之內(nèi)即可得到結(jié)果。在整個檢測過程中，其較高的封閉性以及自動化，在臨床檢測中的外部影響較小，降低手動操作中可能的誤差，提升檢測的準確性[6]。

本研究顯示，以比例法藥敏結(jié)果為金標準，GeneXpert MTB/RIF檢測痰培養(yǎng)陽性患者利福平耐藥的靈敏度為75.00%，特異度為93.75%，對GeneXpert MTB/RIF與比例法藥敏試驗進行一致性檢驗，一致率為91.67%（33/36），2者具有較好的一致性。這與國內(nèi)研究結(jié)果一致[1]。RpoB基因中的81bp耐藥基因的突變是造成肺結(jié)核患者利福平耐藥的重要原因。本研究將GeneXpert MTB/RIF中加入利福平耐藥的基因片段檢測試劑，將RpoB基因作為利福平耐藥檢測的靶基因，在檢測中，使用引物探針對RpoB基因中的81bp片段進行選擇性覆蓋，通過其檢測的陽性與否，進一步對患者的耐藥情況進行分析[7-8]。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)GeneXpert MTB/RIF檢測MTB有較高的靈敏度和特異度，對于利福平耐藥的檢測與比例法藥敏試驗有較高的一致性，可以作為結(jié)核病診斷和利福平耐藥檢測的金標準。但是本研究還存在一定的局限性，由于納入的樣本量較少，研究數(shù)據(jù)需要大樣本量進一步支持。