利用沼蝦廢棄物制備富含蝦青素的食用油和蝦露調味液的工藝研究

錢建瑛，王雨露，李恒，王元才，陳學義，史勁松*

(1.江南大學,江蘇 無錫 214122；2.高郵市元鑫冷凍有限公司,江蘇 揚州 225600)

淡水蝦是我省傳統養殖品種，其中，羅氏沼蝦作為高產、優質特色品種，其養殖量占全國一半以上[1]，高郵地區是沼蝦養殖的集中區，養殖量占全省的60%，僅里下河地區各種淡水蝦年養殖量就達10萬噸以上，社會綜合產值在50億元以上[2]。但與產業集群不相適應的是配套的加工業發展滯后，顯著存在加工品比例低、高附加值產品少、技術含量低、廢棄物多等共性問題[3]，亟待研發精深加工及高效利用技術，開發新型優質深加工產品。

羅氏沼蝦頭部大，蝦仁加工過程中的剩余物較多，約占35%以上，這些邊角料作為加工廢棄物可能對環境造成污染，目前的處理方法是用作飼料、肥料、甲殼素的生產原料等。利用先進的加工設備、分離技術、生物技術，可以對蝦頭、蝦殼中一些營養價值高的物質進行提取分離，進而加工成高附加值的食品或配料，如蝦黃，含有大量的不飽和脂肪酸，不僅味道鮮美，而且含有較多的蝦青素[4]，如果能夠進行有效分離，則可以獲得高蝦青素的蝦油產品。由于不飽和脂肪酸、蝦青素相對含量低，且容易變質，因此需要在較為溫和的條件下進行提取。蝦頭、蝦殼中還含有一些結構性蛋白，與蝦殼結合緊密，不容易剝落，但可以采用蛋白酶進行水解，通過生物抽提予以提取。將這些蝦頭、蝦殼中殘留的蛋白進行回收，可以制備風味優美的蝦肽調味品[5]。因此，本研究以羅氏沼蝦加工廢棄物蝦頭、蝦殼為原料，通過生物酶法和超聲波輔助法提取蝦青素；以蛋白水解物為原料，通過熱反應增香，獲得蝦露風味的調味液；將蝦頭、蝦殼廢棄物中的脂質和蛋白質充分利用，拓展了沼蝦精深加工技術，減少了資源浪費。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮沼蝦蝦頭、蝦殼：高郵市元鑫冷凍有限公司；木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶：南寧東恒華道生物科技有限責任公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶：江蘇博立生物科技有限公司；花生油、大豆油、葵花籽油：金太陽糧油股份有限公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷(均為色譜純)：賽默飛世爾科技公司；蝦青素標準品(HPLC≥98%)：北京索萊寶科技有限公司；其他試劑：國藥集團化學試劑(上海)有限公司。

1.2 試驗儀器

SHJ-4A磁力攪拌水浴鍋 常州金壇良友儀器有限公司；KQ500E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；20R離心機 美國貝克曼庫爾特公司；L2000液相色譜儀 日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

以沼蝦廢棄物蝦頭、蝦殼為原料，通過添加蛋白酶有效降解和蝦青素結合的蛋白質，實現脂質的較好分離，通過超聲波輔助萃取，用食用油在較低溫度下萃取，減少蝦青素的氧化損失；蛋白水解物進一步通過美拉德反應增香消除不良風味，并通過復配提高感官指標，最終獲得富含蝦青素的食用油和蝦露調味液兩種產品。

1.3.2 樣品處理

將沼蝦加工中剝除的蝦頭、蝦殼用清水洗滌2～3次，瀝干后稱重，按料液比1∶1加入純水，粉碎打漿。

1.3.3 酶解工藝

分別按蝦頭、蝦殼質量的2.5%、5.0%、10.0%、20.0%加入木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，水浴35，40，45，50，55 ℃下酶解2，3，4，5，6 h?？疾斓鞍酌阜N類、加酶量、酶解溫度和時間對蝦青素得率的影響。

1.3.4 超聲輔助萃取工藝

將酶解液用紗布過濾，按濾液體積1∶1分別加入花生油、葵花籽油和大豆油，以超聲功率100，200，300，400，500 W輔助萃取10，20，30，40，50 min，離心取油層，得到富含蝦青素的食用油?？疾燧腿∮檬秤糜偷姆N類、超聲功率、萃取時間對蝦青素得率的影響。

1.3.5 美拉德反應增香及復配工藝

將1.3.4離心后的水層進行美拉德反應，按酶解液體積添加5%還原糖(木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖)、1%氨基酸(天冬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸)和0.3%抗壞血酸進行美拉德反應，分別以95，100，105，110，115，120 ℃反應10，20，30，40，50，60 min，考察還原糖、氨基酸的種類、反應溫度和時間對反應產物風味的影響；在美拉德反應產物中添加0.5%核苷酸二鈉、5%谷氨酸鈉、5%食鹽、1%麥芽糊精以及1%白砂糖，制成蝦露調味液，考察調味對終產品感官評價的影響。

1.3.6 蝦青素含量的檢測方法

采用高效液相色譜法檢測食用油中蝦青素的含量，色譜柱：Waters XBridge BEH C18(4.6 mm×250 mm×5.0 μm)，流動相為乙腈∶二氯甲烷∶甲醇∶水為5∶5∶85∶5，流速：1.0 mL/min，檢測波長：470 nm，進樣量：10 μL，柱溫：25 ℃[6]。

蝦青素標準曲線的測定：準確稱取蝦青素標準品2.5 mg，加入5 mL二氯甲烷和0.1 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液5 mL，充分混勻后避光4 ℃靜置12 h待皂化完全。定容至25 mL，得到濃度為100 μg/mL的母液。分別量取0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mL，定容至50 mL，用0.45 μm濾膜過濾后進樣，根據峰面積和樣品濃度計算標準曲線。

根據高效液相色譜法測得的峰面積與濃度的線性方程為y=38727x+216604，R2=0.9998，結果表明蝦青素在1～16 μg/mL范圍內線性關系良好(見圖2)，該標準曲線可用于本試驗所提取到的蝦青素含量的確定。

圖2 蝦青素標準曲線

樣品制備方法：準確稱取0.5 g根據1.3.4制備的富含蝦青素的食用油，加入5 mL二氯甲烷和0.1 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液5 mL，充分混勻后避光4 ℃靜置12 h待皂化完全，用0.45 μm濾膜過濾后進樣，根據峰面積和標準曲線計算樣品中蝦青素的含量。

1.3.7 感官評定方法[7]

在60 ℃的溫水中加入10%的蝦露調味液，攪拌均勻。邀請經過訓練、有評定經驗的10位感官評定員(5男5女)進行品評。簡單描述法：感官評定員對構成樣品特征的各個指標進行定性描述，盡量完整地描述出樣品的品質。評分檢驗法：評定員根據樣品的咸味、鮮味、醇厚味、甜味、酸味、苦味、焦糊味、腥味進行評定，采用10分制，將添加了0.5%核苷酸二鈉、5%谷氨酸鈉、5%食鹽、1%麥芽糊精以及1%白砂糖的空白液作為對照溶液設定為0分，分值越高表明感官刺激越強，逐項評分后進行分析。

2 結果與分析

2.1 富含蝦青素的食用油的制備

2.1.1 蛋白酶種類對蝦青素得率的影響

按蝦頭、蝦殼質量的5.0%加入木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，水浴45 ℃下酶解5 h，蛋白酶種類對蝦青素得率的影響見圖3。

圖3 蛋白酶種類對蝦青素得率的影響

由圖3可知，不同種類的蛋白酶酶解對蝦青素的提取得率具有不同的效果，采用木瓜蛋白酶酶解后，蝦青素的得率最高。蝦青素為脂溶性物質，游離型的蝦青素可以采用低極性溶劑或油脂進行萃取；但在蝦殼中大多數蝦青素與蛋白質、甲殼素形成結合型復合物，無法直接萃取，得率較低；采用蛋白酶酶解后，蝦青素與蛋白質分解開，更易于溶劑萃取[8]。木瓜蛋白酶可以水解蛋白質和多肽中精氨酸和賴氨酸的羧基端，同時還能選擇性降解甲殼素的GlcNAc-GlcN糖苷鍵，因此能獲得更高的蝦青素得率[9]。

2.1.2 蛋白酶用量對蝦青素得率的影響

按蝦頭、蝦殼質量的2.5%、5.0%、10.0%、20.0%加入木瓜蛋白酶，水浴45 ℃下酶解5 h，木瓜蛋白酶用量對蝦青素得率的影響見圖4。

圖4 木瓜蛋白酶用量對蝦青素得率的影響

由圖4可知，當木瓜蛋白酶添加量較低時，蝦青素得率隨著木瓜蛋白酶的增加而提高；當木瓜蛋白酶添加量達到5.0%時，蝦青素得率達到最高值(87.2 μg/g)；進一步增加木瓜蛋白酶用量時，蝦青素得率不再提高，甚至略有下降，這是因為當酶添加量增加到一定程度時，所有可以和酶結合的底物都已經反應完全，并且過量的蛋白酶可能導致已經和蝦青素分離的蛋白和多肽進一步水解，影響后續的萃取步驟，反而降低了蝦青素的得率。

2.1.3 酶解溫度對蝦青素得率的影響

按蝦頭、蝦殼質量的5.0%加入木瓜蛋白酶，水浴35，40，45，50，55 ℃下酶解5 h，不同酶解溫度對蝦青素得率的影響見圖5。

圖5 酶解溫度對蝦青素得率的影響

由圖5可知，當酶解溫度低于45 ℃時，蝦青素得率隨著溫度的升高而增加，當酶解溫度為45 ℃時達到最大值。這是因為溫度的升高使酶解反應效率提高，當達到酶促反應的最適溫度時，酶解效果最佳。繼續升高酶解溫度，不再適合酶解反應，同時可能引起蝦青素氧化[10-11]，反而降低了最終得率。

2.1.4 酶解時間對蝦青素得率的影響

按蝦頭、蝦殼質量的5.0%加入木瓜蛋白酶，水浴45 ℃下酶解2，3，4，5，6 h。不同酶解時間對蝦青素得率的影響見圖6。

圖6 酶解時間對蝦青素得率的影響

由圖6可知，蝦青素提取量隨著酶解時間的增加先上升，當達到5 h時得率達到最高值87.2 μg/g；這是因為隨著時間的增長，酶的酶解效果發揮更充分，蛋白質和蝦青素的分離程度更好，蝦青素萃取后得率越高；繼續增加酶解時間后蝦青素提取量降低，可能是因為時間過長導致游離狀態的蝦青素發生氧化、變性。

續 表

2.1.5 萃取用食用油種類對蝦青素得率的影響

已有的文獻報道多采用有機溶劑對蝦青素進行提取，如丙酮、二氯甲烷、正己烷、氯仿等[12]，有機溶劑沸點低，大多具有揮發性和毒性，可能引起食品安全問題。本文采用食用油萃取經過酶解、以游離形式存在的蝦青素，獲得食用安全、富含蝦青素的營養油脂，因此考察常用的不同種類的食用油對蝦青素萃取的影響，結果見圖7。

圖7 食用油種類對蝦青素得率的影響

由圖7可知，使用花生油萃取蝦青素的提取量(87.2 μg/g)顯著優于大豆油和葵花籽油。花生油含不飽和脂肪酸80%以上，還含有軟脂酸、硬脂酸和花生酸等飽和脂肪酸，占19%左右，其特征在于所含十八碳以上的飽和脂肪酸比其他植物油脂多，推測可能是脂肪酸組成上的區別導致不同的植物油對蝦青素的萃取效果有所差異[13]。

2.1.6 超聲功率對蝦青素得率的影響

將酶解液用紗布過濾，按濾液體積1∶1加入花生油，以超聲功率100，200，300，400，500 W輔助萃取30 min，離心取油層，得到富含蝦青素的食用油?？疾觳煌暪β蕦ξr青素得率的影響，結果見圖8。

圖8 超聲功率對蝦青素得率的影響

由圖8可知，隨著超聲功率的增大，蝦青素得率先提高再降低。當超聲功率增大至300 W時，超聲波處理產生的空化效應增強，使蝦殼中的蛋白質暴露更多的反應位點，酶促反應速率提高，從而提高了蝦青素得率。當超聲功率進一步增大時，可能會導致游離蝦青素氧化增加而使得率下降。

2.1.7 萃取時間對蝦青素得率的影響

將酶解液用紗布過濾，按濾液體積1∶1加入花生油，以超聲功率300 W輔助萃取10，20，30，40，50 min，離心取油層，考察不同萃取時間對蝦青素得率的影響，結果見圖9。

圖9 萃取時間對蝦青素得率的影響

由圖9可知，超聲萃取時間適度延長時(10～40 min)，蝦青素得率顯著提高，可能是因為超聲所產生的空化效應隨著萃取時間的延長而不斷加強，暴露了更多蛋白反應位點，使酶與底物結合更方便，酶促反應更迅速。當萃取時間為40 min時，蝦青素得率最高，達到了97.8 μg/g。進一步延長超聲時間時，可能使蛋白質疏水鍵大量暴露而發生凝集和沉淀，使酶解反而受阻，也有可能導致游離蝦青素氧化而變質，從而降低了蝦青素得率[14]。

2.2 蝦露調味液的制備

酶解獲得的水溶性部分富含呈味氨基酸、風味肽，同時夾雜有水產的腥味，因此通過美拉德反應增香[15]，以實現蝦頭、蝦殼資源的完全利用。

2.2.1 還原糖種類對反應產物風味的影響

蝦頭、蝦殼酶解液中含有大量氨基酸和短肽，是美拉德反應的重要前體物質，但只有它們參與還不足以產生良好的風味，因此通過試驗考察添加不同的還原糖和氨基酸對美拉德反應增香效果的影響[16]。按酶解液體積添加5%還原糖(木糖、葡萄糖、果糖、蔗糖)、1%丙氨酸、0.3%抗壞血酸進行美拉德反應，110 ℃反應20 min，反應產物由感官品評員進行描述，結果見表1。

表1 還原糖種類對美拉德反應產物的影響

由表1可知，果糖與蔗糖不適宜在本反應中添加，葡萄糖與木糖產生的風味較好。木糖作為戊糖，其參與美拉德反應的速度較己糖(葡萄糖)更快，但價格較高，與之相比生產上使用葡萄糖更為經濟，且產物風味無明顯差異。

2.2.2 氨基酸種類對反應產物風味的影響

不同的氨基酸與還原糖反應，能夠產生各自不同的特征風味，本試驗選擇了7種氨基酸參與反應，即天冬氨酸、精氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酸。將1.3.4離心后的水層進行美拉德反應，按酶解液體積添加5%葡萄糖、1%氨基酸、0.3%抗壞血酸進行美拉德反應，110 ℃反應20 min，結果見表2。

表2 氨基酸種類對美拉德反應產物的影響

根據表2中感官品評員對美拉德反應產物的描述，在反應中添加丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸有助于美拉德反應增香，而天冬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和精氨酸不適合本反應。因此，將丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸以等比例(1∶1∶1)混合后的復合氨基酸作為美拉德反應的原料進行添加。

2.2.3 美拉德反應溫度對產物風味的影響

將1.3.4離心后的水層進行美拉德反應，按酶解液體積添加5%葡萄糖、1%復合氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸以質量比1∶1∶1混合所得)、0.3%抗壞血酸進行美拉德反應，分別以95，100，105，110，115，120 ℃反應20 min，考察反應溫度對產物風味的影響，結果見表3。

表3 反應溫度對美拉德反應產物的影響

溫度是影響美拉德反應的一個重要因素，溫度過高，最終產物中雜味成分增多，并帶有焦糊味，溫度很高時還會導致炭化；溫度過低，又使最終產物中特征香味較不明顯。由表3可知，當反應溫度為105 ℃時，產物的鮮味、醇厚味和甜味體現得更明顯，而酸味、苦味、焦糊味，尤其是腥味不明顯，說明反應溫度的降低使產物明顯減少，因此選擇該反應條件。

2.2.4 美拉德反應時間對產物風味的影響

將1.3.4離心后的水層進行美拉德反應，按酶解液體積添加5%葡萄糖、1%復合氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸以質量比1∶1∶1混合所得)、0.3%抗壞血酸進行美拉德反應，105 ℃反應10，20，30，40，50 min，考察反應時間對產物風味的影響，結果見表4。

表4 反應時間對美拉德反應產物的影響

在相同的反應溫度下，不同反應時間得到的產物是有差距的，時間過短，反應不完全，時間過長，產生過多的雜味物質。由表4可知，當反應時間為30 min時，反應產物帶給感官品評員更優的嗅覺、味覺感受，其鮮味、醇厚味、甜味明顯，而不良的感覺如酸味、苦味、焦糊味和腥味并不明顯。

2.2.5 美拉德反應及調味對終產品風味的影響

為了使終產品更加鮮美可口，在美拉德反應液中添加0.5%核苷酸二鈉、5%谷氨酸鈉、5%食鹽、1%麥芽糊精以及1%白砂糖，制成蝦露調味液，感官品評員對酶解液、美拉德反應液和蝦露調味液的評分結果見圖10。

圖10 酶解液、美拉德反應液及蝦露調味液的風味描述

由圖10可知，酶解液具有一定的鮮味、咸味，然而其腥味突出，同時稍具苦味和酸味；經過美拉德反應后，腥味顯著降低，同時鮮味和醇厚味進一步增強，苦味和酸味也得到了調整；進一步復配后，蝦露調味液中鮮味和醇厚味最突出，甜味，腥味、焦糊味、苦味和酸味都不明顯，可見美拉德反應和調味獲得了風味良好、可用于烹飪的蝦味調味產品。

3 結果與討論

蝦頭和蝦殼中含有豐富的蛋白質和氨基酸，還有蝦青素和甲殼素等，具有很高的利用價值。蝦青素是一種橙紅色類胡蘿卜素，具有脂溶性，不易溶于水，易溶于有機溶劑，如三氯甲烷、丙酮、苯等。從蝦廢棄物中提取蝦青素的方法主要包括油溶法、有機溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、酶解法[17]。Hooshmand等[18]以蝦廢棄物為原料，用不同的有機溶劑提取蝦中的蝦青素,研究結果表明提取溶劑為丙酮時，提取到的類胡蘿卜素含量最高，為(61.321±2.176) μg/g。孫兆遠等[19]采用酶解處理鰲蝦殼后，用丙酮萃取蝦青素，得率可達到97.26 μg/g。在廢棄物的蛋白質利用方面，王紅麗等[20]采用酶解和熱處理南美白對蝦加工下腳料，獲得了感官評分最高、揮發性風味物質成分與熟蝦肉相近的產物；馮明會等[21]以克氏原螯蝦蝦頭為主要原料，酶解后調配鮮辣椒等進行發酵，制成了香辣口味、風味物質含量豐富的蝦醬調味品；任欣榮等[22]以甜面醬為基礎，添加0.4%克氏原螯蝦粉、白砂糖、食用油、芝麻等，獲得香味濃郁、滋味鮮美、稠度適中的調味醬。以上加工方式都為蝦頭、蝦殼的資源利用提供了思路，在此基礎上，通過酶解、脂質提取、蛋白質和氨基酸調味、增香，可以將廢棄物按營養成分進行分類利用，加工成為高附加值的食品或配料。

本研究以沼蝦加工產生的廢棄物蝦頭、蝦殼為原料，通過添加5%的木瓜蛋白酶、45 ℃酶解5 h，可有效降解結合蛋白，實現蝦青素和蛋白的較好分離；通過花生油萃取蝦青素，采用300 W超聲輔助萃取40 min，可以實現常溫下脂類物質的回收，減少了蝦青素的氧化損失，蝦青素的提取率可達到97.8 μg/g；酶解液中含有大量氨基酸、風味肽，按酶解液體積添加5%葡萄糖、1%復合氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸按1∶1∶1混合)、0.3%抗壞血酸進行美拉德反應，105 ℃反應30 min，消除了不良風味，提高了感官指標；進一步在美拉德反應液中添加0.5%核苷酸二鈉、5%谷氨酸鈉、5%食鹽、1%麥芽糊精以及1%白砂糖，制成了天然的蝦味調味液，實現了資源的全值化利用。