乳酸菌產γ-氨基丁酸及生物合成技術研究進展

李朔，李瀟，張曉黎，賈瑤，吳興壯*

(1.沈陽農業大學 食品學院，沈陽 110866；2.遼寧省農業科學院 食品與加工研究所，沈陽 110161)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是一種重要的非蛋白氨基酸，具備多種用途。研究表明，GABA不僅在農業中被用于調節植物生長、發育和應激反應，還在化學工業中作為前體物質用于合成可生物降解尼龍[1]。同時，作為哺乳動物中樞神經系統的主要抑制性神經遞質，GABA對健康的益處已被充分證實，其在治療高血壓、緩解壓力和預防糖尿病等方面起到了良好的治療效果。鑒于GABA在食品和醫藥領域具有重要用途，我國衛生部于2009年正式批準GABA為新資源食品的生產原料。近年來，人們將其作為生物活性因子，已開發出富含GABA的醬油、豆豉、食醋、豆醬、海鮮調味料等調味品以及發酵腌制品和奶制品[2]。然而，GABA在自然生物中濃度很低且不易提取，因此，為了實現GABA的有益功能，GABA的高效合成受到了極大關注。

谷氨酸脫羧酶(GAD)是生物體催化谷氨酸或鈉鹽經過脫羧生成GABA的唯一關鍵酶。乳酸菌(LAB)作為一種公認安全的細菌被廣泛應用于食醋、腐乳、泡菜等食品生產中[3]，已有許多科學研究證實，乳酸菌存在谷氨酸脫羧酶活性，能夠催化谷氨酸脫羧生成GABA。目前，GABA主要通過生物合成法來生產，如在生物轉化方法中使用分離的GAD或在微生物直接發酵法中利用具有GAD活性的各種微生物菌株，這是因為該法具有反應程序簡單、催化效率高、反應條件溫和以及環境兼容性等優點[4]。因此，通過利用食品安全級乳酸菌生物合成達到更高GABA生產目標、開發更多富含GABA種類的功能性食品正在吸引著世界各地的科學工作者。

1 γ-氨基丁酸的生理作用

GABA作為哺乳動物的一種抑制性神經遞質，起到分子信號的作用，并具有許多生理功能?？茖W研究已經證實，GABA不但有降低神經元活力、避免神經細胞過熱、降血壓的功效，還可作為肝、腎和腸道的保護劑以及預防毒素引起的損傷，同時GABA對癲癇發作、驚厥、帕金森病等多種精神疾病都有一定的治療效果[5]。雖然GABA有多種生理功能，但由于人們壓力的增加和年紀的增長，身體中的GABA含量也日益減少。因此，在飲食中補充GABA對人體保健具有很重要的意義。

GABA對生物體的影響主要通過其與相應的受體融合而產生。

GABA受體一般有3類：(1)GABAA受體主要分布在神經元細胞膜上，且具有高度敏感性。其被激活后使得突觸后電位發揮作用，抑制神經元的興奮，保持大腦自我調節。因此，調節不平衡也可引起精神疾病、創傷后應激功能障礙 (PTSD) 綜合征、癲癇等病癥，此外，與女性生殖周期及相關抑郁癥發作也有著密切的關系[6]。(2)GABAB受體主要產生在神經元的突觸前、后部位，且在非突觸部位也有其存在。其受體被激活后，通過突觸后膜使得K+形成輸出電導，從而形成長抑制性突觸后電位，相反，突觸前膜則抑制鈣離子電導，使興奮性或抑制性遞質的釋放量降低，另外，該受體被激活后還與消化系統功能調節等許多作用有關[7]。(3)GABAC受體和GABAA受體相似，主要存在于視網膜雙極細胞中，另外也有研究表明，其在視網膜中視桿通路的信息傳導與調控中起重要作用[8]。

2 生產GABA乳酸菌的種類

乳酸菌是各種食品原料發酵過程中最重要的微生物之一，乳酸則是在發酵過程中形成的主要代謝產物之一，影響乳酸菌的生理活動。許多原料或食品中都含有大量的谷氨酸，乳酸菌則可以利用谷氨酸來提高其對酸性條件的耐受性，這是因為在酸性條件下，一些乳酸菌啟動了不同的耐酸系統來維持細胞活力，如生產GABA則是利用了其體內的GAD抗酸系統[9]。GAD是一種依賴5′-磷酸吡哆醛(PLP)的細胞內酶，其催化谷氨酸向GABA的轉化，需要通過與H+結合將底物脫羧成中性化合物GABA，進而保護乳酸菌不受酸脅迫的傷害[10]。目前，許多生產GABA的乳酸菌已從廣泛的發酵食品中分離出來，包括奶酪、酸奶、酸菜、泡菜、發酵香腸以及各種發酵魚制品[11]。生產GABA乳酸菌的起始菌株是影響GABA生產的最主要原因，具備合成GABA能力的乳酸菌較多，乳酸桿菌屬也被列為生產GABA的最主要種類，包括短乳桿菌、副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、布氏乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌等，而在這些具備產GABA能力的乳酸菌株中，異型發酵的短乳桿菌是目前研究最佳的菌株，在適當條件下可生產大量的GABA[12]。

表1 不同乳酸菌的發酵特性

3 提高GAD活性和GABA產量方法

3.1 通過優化培養基及發酵條件提高GABA生物合成產量

菌株間生成GABA的能力差異較大，同時菌株也受到碳氮源、底物濃度、起始pH值、培養溫度、培養時間和輔酶因子等因素的影響。因此，通過優化實驗條件可以提高菌株生產GABA的效率。周青[20]的研究表明，在優化碳氮源及添加量的條件下，植物乳桿菌WZ011能產生1.261 g/L的GABA。谷氨酸鈉(MSG)或L-谷氨酸是使用純化酶或產GABA能力的菌株來生產GABA的主要合成底物，其濃度能夠控制GAD的活性，進而影響GABA的產量[21]，添加0.5%的MSG增加了屎腸球菌JK29的GABA產量，培養48 h后達到14.9 mmol/L。當L-谷氨酸以10～20 g/L的濃度添加到嗜熱鏈球菌的生長培養基中時，不能有效增加GABA的產量，表明該菌株不能耐受高濃度的L-谷氨酸，這是因為高濃度的底物會增加細胞滲透壓，干擾細菌代謝，影響GAD的活性[22]。因此，增加底物濃度的策略不能用于全部菌株。因為PLP是GAD必需的輔酶，所以產生GAD活性的乳酸菌還必須在培養基中添加PLP以增加GABA的產量，Komatsuzaki等[23]研究證實，將PLP添加到初始培養基中可以極大地促進副干酪乳桿菌的GABA生成。但是Yang等[24]研究表明，在初始發酵時加入PLP無法有效地提高唾液鏈球菌嗜熱亞種GABA的產生，然而在發酵進行48 h后，添加PLP在提高GABA生產方面卻表現出了有效的功能，推測這或許是游離PLP在培養過程中很容易變性，失去了作為GAD輔酶的作用，因此補充PLP可以部分恢復GAD活性，增加GABA產量。發酵時間和溫度也是影響菌株生產GABA的關鍵因素，溫度過低或過高都會抑制菌株的生長速度和產GABA能力，一般來說，在25～45 ℃范圍內，菌株產生GABA的含量最高[25]。Villegas等[26]通過短乳桿菌CRL1942研究了GABA的形成，結果發現，在30 ℃條件下使用270 mmol/L的MSG發酵48 h,MRS培養基中GABA的最大產量為255 mmol/L，表明GABA的產生有時間依賴性。這是因為由MSG向GABA轉化需要菌株生長，產生較高的細胞密度和合適的培養溫度[27]，另外，乳酸菌在發酵過程中會形成乳酸，導致發酵液pH下降，當發酵液pH降至GAD活性范圍時，培養基中GABA才開始出現。微生物中GAD的活性主要由pH值調節，pH值的升高或降低會造成GAD活性部分失活，從而影響GABA產量，由于各菌株GAD生化特性有所不同，所以不同菌株之間的GAD活性最佳pH值也不相同，總體來說，GAD的最適pH值為4.0～5.0[28]。例如，pH為5.0時，布氏乳桿菌產生最多的GABA，產量達251 mmol/L；pH為6.5時，植物乳桿菌IFK10產GABA最多，達2.68 g/L。

3.2 采用補料分批發酵技術提高GABA生物合成產量

各菌株產生GABA的能力差異很大，一些產生GABA的菌株在大規模發酵生產GABA方面顯示出巨大的潛力。由于發酵的主要目的是成本效益以及提高生產生物產品的效率，所以選擇適當的發酵工藝來提高目標產品的產量非常重要。在分批發酵時，底物通常在發酵罐中只放置1次，產生的主要問題是較高的發酵底物初始濃度會抑制細胞生長，而較低的底物濃度則無法適應高生產的要求[29]，然而補料分批培養能夠克服這一問題，已廣泛應用于各種生物制品的生產中，在補料分批培養過程中，可選用不抑制細胞生長的適宜的初始底物濃度，隨著發酵時間的延長，一個或多個營養成分被供應到發酵罐中，產物則留在發酵罐中直到發酵結束，這種方法可以獲得高產量的目標產物。Li等[30]設計了一種簡單的分批補料發酵方法，當菌株生長至對數生長期時，在溫度32 ℃、攪拌速度100 r/min、pH 5.0、發酵時間48 h的條件下進行補料發酵，且在12 h和24 h分別向發酵罐中加入280.70 g和224.56 g的谷氨酸，結果顯示，48 h 后GABA濃度達到(1005.81±47.88)mmol/L。由于GAD主要在酸性條件下具有活性且發酵液pH值會隨著時間的變化而變化，所以應及時調整pH值，使菌株在最適宜pH值下生產GABA。李勝男[31]通過恒定pH分批補料發酵建立了高效合成GABA的發酵工藝體系，在恒定pH 5.0條件下，GABA的產量由不控制pH的30.34 g/L增加到44.73 g/L，增長了47.43%，且發酵后期的培養液中仍保持著較高的細胞濃度，另外發現與未控制pH相比，發酵液中的葡萄糖以及底物幾乎被耗盡，表明恒定pH分批補料發酵有利于提高GAD的活性，進一步提高GABA的產量。

3.3 復合菌培養提高GABA生物合成產量

復合菌培養旨在提高GABA的產量。不同菌株可以相互利用各自的發酵特性，克服單一菌株發酵的缺點，已在食品、農業、醫藥等行業中得到廣泛應用[32]。Kim等[33]將產GABA的短乳桿菌GABA 100與不產GABA的雙歧桿菌BGN4復合培養發酵天麻，培養過程中觀察到的GABA產量高于只接種短乳桿菌GABA 100，在報道中，并未闡明復合培養對GABA產生影響的確切機制，推測雙歧桿菌BGN4在復合培養過程中降低pH值的幅度大于短乳桿菌GABA 100單獨培養，從而導致GABA產量增加。張恕銘等[34]通過植物乳桿菌BC112與屎腸球菌AB157復合培養并優化試驗條件提高了GABA產量。Kwon等[35]以水芹菜為主要原料，采用腸膜明串珠菌與植物乳桿菌復合發酵，并通過優化增加了水芹中GABA的含量，成功生產了這種同時富含葡聚糖和GABA的新型功能性水芹。

另外，微生物復合培養技術不僅有利于食品生產，而且有利于人類健康，這是因為動物腸道內存在大量的微生物，不同的微生物通過合作執行重要的生物學功能。然而，人們對復合培養機制的了解很少。因此，不同微生物復合培養的機理有待探索，研究結果可推廣到工業應用和改善人類健康方面。

3.4 實施現代生物技術提高GABA生物合成產量

研究表明，GABA是利用生物體內的谷氨酸脫羧酶作為催化劑對谷氨酸進行脫羧反應而產生的，許多細菌的GAD在pH為4.0～5.0時表現出最優活性，而在近中性pH時，活性急劇下降。在大多數情況下，直接發酵法的GABA產量相對較低，前期的研究者主要通過優化培養基組成和培養條件來提高GABA含量，因此，GABA的生物合成通過基因工程、代謝工程以及純化或固定化GAD等生物技術的研究越來越受到人們的關注[36]。

不同來源的乳酸菌的GAD基因已在不同宿主中過度表達，包括大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌以及枯草芽孢桿菌[37]，許多乳酸菌GABA合成的效率基本上取決于GadC和GadB的活性，而GadC和GadB的活性受到培養條件的極大影響。Tajabadi等[38]為了提高GABA的合成，將獲得的GAD基因克隆到pMG36e-LbGAD載體中，并且通過SDS-PAGE和GAD活性證實了在植物乳桿菌Taj-Apis362 細胞中進行過度表達，與原始GAD活性相比，其酶活性提高了7倍，達到了53 kDa蛋白。Yang等[39]將基于大腸桿菌表達乳酸乳桿菌GadB基因的全細胞生物催化劑用于代謝途徑工程方法的起點：(1)通過向GadB中引入突變，使其脫羧活性向中性pH方向轉移，構建了工程菌株；(2)通過修飾谷氨酸/GABA逆向轉運蛋白GadC，促進中性pH下的轉運；(3)通過過度表達GroESL分子伴侶，增強可溶性GadB的表達；(4)通過使大腸桿菌基因組中的gadA和gadB失活來抑制GABA的降解，最終該工程菌株每小時產GABA量為44.04 g/L。Liu等[40]開發了一種乳酸鏈球菌發酵系統，可以同時生產乳酸鏈球菌肽(一種抗菌肽)和 GABA(一種抗氧化劑)，在此研究中通過表達谷氨酸脫羧酶和谷氨酸/GABA逆轉運蛋白代謝工程改造了乳酸鏈球菌素生產菌株L.lactisF44用于 GABA 生產，GABA 生物合成可以通過增強菌株的耐酸性來促進乳酸鏈球菌素的產生，通過采用兩階段 pH 控制發酵策略，工程菌株GABA產量高達9.12 g/L，是恒定pH值發酵的2.2倍。

一些突變方法，如定向進化和定點突變被認為是優化或改善GAD催化活性的有力工具，并應用于全細胞生物催化。谷氨酸棒桿菌是谷氨酸的工業生產菌，且在中性pH值附近生長最好，Shi等[41]為了在擴大的pH范圍內提高短乳桿菌Lb85的GAD活性，通過表達短乳桿菌Lb85 GadB變體獲得重組谷氨酸棒桿菌細胞，由于變體是通過結合GadB的定向進化和位點特異性突變來構建的，通過將這些GadB變體引入該生物體，在簡單的葡萄糖基培養基上無需外源谷氨酸即可生產GABA，產量高達7.13 g/L，且該重組細胞在較高pH值范圍內仍表現出較高的催化能力。GadC對底物運輸具備嚴格的pH依賴性，在pH 6.5及以上時沒有可檢測到的運輸活性，Shin等[42]利用誘變研究了植物乳桿菌GadC的C末端依賴pH的催化作用，通過截短C端區域Ile454-Thr468中的Δ3和Δ11變體，該酶在pH 5～7范圍內增加了活性，其中Δ11變體明顯顯示出更好的結果，在pH值為5.0和7.0時，變體的催化效力分別提高了1.26倍和28.5倍，推測由于pH誘導的構象變化，C端區域通過關閉催化位點，使得植物乳桿菌GAD的活性在較低或較高pH值下增加。Lyu等[43]將短乳桿菌GadC的C末端Δ14變體通過定向突變被截短，使得該變體在較高的中性pH值下表現出更好的活性。這些研究表明，在較高pH值下，GadC的C末端對于改善酶活性位點以及增加活性具有重要影響，因此GadC在波動的pH條件下通過代謝途徑工程是產生GABA的重要途徑。

熱穩定性不足是酶的常見問題，大多數GAD即使在中等溫度下也表現出低穩定性。改進熱穩定性的一個合理策略是通過序列比對來識別關鍵區域或氨基酸殘基，林玲等[44]從短乳桿菌中獲得GAD1407基因，并通過克隆在大腸桿菌中表達，然后將GAD1407的氨基酸序列與擬南芥的GAD1進行比較，發現了一個影響GAD1407催化pH特性的關鍵位點S307，然后對這個關鍵位點進行飽和突變和篩選，最后確定S307N擴大了該酶催化的最佳pH范圍。另外，鑒定共有序列也可以提高蛋白質的熱穩定性，Zhang等[45]對短乳桿菌CGMCC 1306 GAD的基因開發了一種并行策略，通過比較這種嗜熱性GAD與同源嗜熱性酶的序列和結構，確定影響穩定性的氨基酸殘基并獲得了兩種突變酶，結果表明，兩種突變酶的半失活溫度分別比野生型高2.3 ℃和1.4 ℃，表現出較高的熱穩定性，此外，在60 ℃孵育20 min期間，變體的活性增加了1.67倍。汪鐘[46]通過與嗜熱GAD進行多序列比對，首先鑒定出了最有可能提高酶熱穩定性的氨基酸殘基替換位點及類型，然后又計算了這些突變對蛋白質自由能的影響，最后制定了最佳的酶分子改造方法，他推測這種方法是提高GAD熱穩定性的有效工具。

研究表明，通過全細胞將谷氨酸生物催化為GABA有一些不足之處，這是因為GABA在中性環境下經GABA轉氨酶(GABA-T)和琥珀酸半醛脫氫酶(SSADH)連續催化兩步反應后轉變成琥珀酸,從而導致分解[47]。另外，全細胞生物催化需要加入一些緩沖液，使得發酵體系保持一定的酸性條件，這種化學緩沖液不利于后期GABA的純化。由于簡化了從不太復雜的反應混合物中對該化合物的下游純化，因此在生產純GABA時，使用純化或固定化技術似乎比全細胞生物催化更經濟可行。研究表明，許多固定化技術已應用于生物催化劑的重復使用，例如將GadB固定在海藻酸鈣中，然后將其用于生物反應器，將GAD/纖維素融合蛋白固定在纖維素上以及將GAD固定在卡拉膠上[48]。Lin等[49]在補料分批反應器中對固定化GAD的性能進行了評估，結果表明，當培養基中的底物濃度通過添加固體谷氨酸保持恒定時，GABA的產率較高，此外，通過向反應器中添加少量的α-酮戊二酸，避免了催化過程中PLP對琥珀酸半醛的失活反應，從而再生輔助因子PLP，且在反應過程中未觀察到酶活性的顯著降低。Lee等[50]使用共價偶聯多孔硅固定植物乳桿菌GAD，并在酸性和堿性條件下表現出高穩定性，熱穩定性得到改善。這些結果表明，當使用(部分)純化的GAD從谷氨酸生產GABA時，固定化技術為工業應用提供了有利的依據。

4 展望

綜上所述，GABA作為一種抑制性神經遞質，被視為藥物和食品中的生物活性成分，具有促進身體健康的特性。同時生產GABA的乳酸菌也為研發含有GABA的功能性食品創造了有利條件，已受到國內外研究者的重點關注。GAD在GABA的生物合成中起著重要作用，乳酸菌GAD結構信息將有助于酶工程提高GAD的熱穩定性以及在廣泛的pH范圍內提高其活性和催化效率。雖然現在已有研究對部分乳酸菌GAD的結構信息進行了闡明，但是主要集中在對短乳桿菌GAD的研究。然而現代生物技術的發展能夠使我們更深入地了解其他乳酸菌的GAD結構性質和催化特性。未來，GABA資源的開發方向之一是通過對GABA產生的分子機制、調控機制以及對產GABA的細胞生理學的深入研究，使GAD在遺傳和代謝水平上具有較高的轉化效率，從而促進GABA產量的增加。另一方向是開發出不同類型富含GABA的功能性食品，如開發功能性谷薯類食品(面包、饅頭、米胚芽、米糠等)、功能性動物性食品(發酵香腸、發酵酸奶、發酵奶酪等)、功能性蔬菜食品(發酵酸菜、綠豆芽等)、功能性調味品(醬油、腐乳、豆瓣醬、食醋、大豆醬等)，以期在人們的日常飲食中通過攝入富含GABA的食品來達到對人體的保健效果。