不同取樣方式對臭鱖魚細菌多樣性分析的影響

錢曉慶，張楠，李佳鵬，馮悅虎，張玉*

(1.湖北工業大學 生物工程與食品學院 發酵工程教育部重點實驗室，武漢 430068；2.工業發酵省部共建協同創新中心，武漢 430068；3.工業微生物湖北省重點實驗室，武漢 430068；4.武漢和平生物環保有限公司，武漢 430068)

高通量測序技術是一種在較短的時間內對數千至數億條核酸分子進行序列檢測，快速分析出待測樣本中群落結構及多樣性的新技術。此前，研究微生物多樣性的方法主要包括傳統分離培養法[1]、變性梯度、溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)法等。然而這些方法都存在局限性，如傳統分離培養法無法將樣品中的微生物全部分離，且時間成本高[2]；變性梯度、溫度梯度凝膠電泳法的分辨率較低[3]。而高通量測序技術能夠檢測出存活率低和能存活但不可培養的微生物，使得待測樣本的微生物群落信息更為全面有效，在環境[4]、醫學[5]、發酵食品[6-8]等領域都有廣泛應用。

臭鱖魚是一種將新鮮鱖魚經鹽腌、短期自然發酵而成的發酵水產品，風味獨特、味道鮮美，廣受消費者喜愛。現有研究表明，臭鱖魚特征風味的形成與發酵過程中微生物多樣性息息相關。Yang等[9]取鱖魚發酵后期的發酵液用于16S rRNA測序，發現了發酵后期Psychrilyobacter、梭桿菌屬、弓桿菌屬(Arcobacter)和Oceanisphaera等微生物通過影響蛋白質水解促進臭鱖魚風味物質的形成和釋放，改善了產品的整體風味和香氣。柯澤華[10]采用魚肉組織取樣，微生物多樣性分析結果表明乳桿菌、乳球菌等是臭鱖魚風味的主要貢獻者。Wang等[11]對比研究了臭鱖魚背部肉樣和腹部肉樣，其微生物多樣性和風味存在顯著差異。目前，不同取樣方法(滲出液、魚體外表面擦拭物及魚肉組織)對臭鱖魚微生物多樣性的影響尚未見報道。

本研究采用3種取樣方式(滲出液、魚體外表面擦拭物和魚肉組織)對臭鱖魚樣本進行取樣，利用高通量測序技術對取得的樣品進行細菌多樣性分析，明確了不同取樣方式下臭鱖魚樣品的優勢菌群及差異。本研究結果可為分析發酵產品微生物多樣性在選擇取樣方式方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

臭鱖魚(500±50) g購于安徽老徽鄉食品有限公司，帶制冷劑運輸至實驗室，貯藏于-18 ℃冰箱中備用。

1.2 試劑

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒:美國Omega公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒:美國Axygen Biosciences公司；氯化鈉(分析純):國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

JE2002G型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；YLY-100BU型超純水機 深圳市億利源水處理設備有限公司；SCI-VS型旋渦混勻儀 北京海天友誠科技有限公司；DSX-24L型手提式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；BCM-1000型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；Himac CF16RN型多功能離心機 日立(中國)有限公司；BCD-520WDPD型冰箱 海爾智家股份有限公司；DW-86L828W型海爾超低溫冰箱 青島海爾生物醫療股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 微生物取樣

滲出液樣品的取樣：將帶包裝的臭鱖魚置于4 ℃冰箱中至完全解凍，在無菌超凈工作臺上打開包裝，取內包裝袋滲出液5 mL于無菌離心管中，12000 r/min離心10 min，棄去上清液，所得沉淀為臭鱖魚滲出液樣品(以下簡寫為J樣品)。

魚體外表面擦拭物樣品的取樣：在無菌超凈工作臺上將上述臭鱖魚從內包裝袋中取出，用潤濕無菌生理鹽水的無菌棉簽擦拭魚體外表面，得魚體外表面擦拭物樣品(以下簡寫為W樣品)。

魚肉樣品的取樣：在無菌超凈工作臺上，將上述臭鱖魚去皮后，取5.0 g背部魚肉組織并剪碎于無菌離心管中，加入50 mL無菌生理鹽水，渦旋混勻10 min。棄去大塊魚肉后以12000 r/min離心10 min，所得沉淀為魚肉樣品(以下簡寫為R樣品)。

1.4.2 DNA提取和PCR擴增

按照細菌DNA試劑盒使用說明書提取細菌DNA，并用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA的提取純度和濃度[12]，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。以338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)作為引物對細菌的16S rDNA基因V3～V4區域[13]進行PCR擴增，PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進行回收，并用DNA熒光定量系統對PCR產物進行檢測定量。

1.4.3 微生物樣本高通量測序和數據分析

將所得微生物樣本送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，委托其基于Illumina MiSeq技術測序平臺進行高通量測序，測序結果使用該公司的生信云平臺(https://cloud.majorbio.com/)對數據進行分析處理。使用Usearch(5.2.236)、Uchime(4.2.40)去除非特異性擴增序列及嵌合體。將所有樣本序列按照序列間的距離進行聚類，然后根據序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元(OTU)。通常對97%相似水平下的OTU進行生物信息統計分析。

2 結果與分析

2.1 細菌群落的α多樣性分析

采用3種取樣方式對臭鱖魚進行測序分析，分別得到44411，42852，63678條有效序列。由圖1可知，基于細菌OTU數的各樣品稀釋曲線隨著測序深度的增加逐漸趨于平緩，不同取樣方式樣品中微生物的Coverage指數都為0.99(見表1)，表明測序數據量充分，測序結果能夠真實反映3種樣品細菌的物種信息。

圖1 3種樣品細菌Shannon指數稀釋曲線

表1 3種樣品中細菌的α多樣性分析

可以通過分析α多樣性來評估微生物物種的豐富度和多樣性。Chao1指數和Ace指數描述了不同樣品中微生物群落的豐富度，其數值越大，微生物群落豐富度越高；Simpson指數與Shannon指數描述了不同樣品中微生物群落的多樣性，Shannon指數越大，Simpson指數越小，則微生物多樣性越高；Coverage指數用來反映樣品微生物群落覆蓋率，其數值越高，則樣本中序列被測出的概率越高[14-16]。

由表1可知，臭鱖魚樣品的Chao1指數和Ace指數最大，說明魚肉樣品中細菌豐度最高，這可能是因為臭鱖魚發酵完成后立即包裝并進行速凍，此時所有微生物主要集中在魚肉部分及部分附著在魚體表面。滲出液樣品的Shannon指數和Simpson指數分別為最高和最低，說明滲出液樣品中細菌多樣性更加豐富，這可能是由于在-18 ℃貯藏期間，部分嗜冷菌在魚體表面緩慢生長；而且在解凍時，魚體內部微生物隨滲出液擴散至魚體外部；此外，樣本解凍時間較長，中心溫度從-18 ℃逐漸升高，魚體外表面溫度一直處于4 ℃，且包裝袋內留存有一定量的氧氣，部分微生物在此環境下開始生長。因而滲出液樣品中細菌多樣性比魚肉樣品和魚體外表面擦拭物樣品中細菌多樣性高。

OTU樣本分布韋恩圖見圖2，3種取樣方式樣品的OTUs共有數為56，滲出液樣品、魚肉樣品和魚體外表面擦拭物樣品的OTUs獨有數分別為7，4，1。與其他兩種取樣方式相比，滲出液樣品中細菌OTUs獨有數最大，與其微生物多樣性最高的結果一致。

圖2 3種樣品細菌韋恩圖分析

2.2 基于門水平的細菌群落結構分析

由圖3可知，在門分類水平上，3種樣品的細菌相對豐度>1%的共有菌門為5個，分別為厚壁菌門(Firmicutes，58.28%、11.04%、20.25%)、梭桿菌門(Fusobacteriota，23.40%、68.69%、62.03%)、變形菌門(Proteobacteria，7.78%、6.58%、2.39%)、擬桿菌門(Bacteroidota，5.34%、8.09%、9.44%)和螺旋體門(Spirochaetota，2.25%、4.91%、4.94%)。魚肉樣品和魚體外表面擦拭物樣品主要菌門一致，但在相對豐度上存在差異。此外，滲出液樣品中細菌相對豐度>1%的還有放線菌門(Actinobacteriota，2.86%)，這是因為滲出液樣品中氧氣含量相對較高，而放線菌大多數為好氧菌，因而能更好地生長繁殖。

圖3 門水平上3種樣品的細菌豐度分析

2.3 基于屬水平的細菌群落結構分析

3種樣品在屬水平上細菌菌屬的總體概況見圖4，3種樣品中共有的菌屬主要為Psychrilyobacter(14.24%、46.44%、32.80%)、梭桿菌屬(Fusobacterium，9.15%、22.25%、29.24%)、乳桿菌屬(Lactobacillus，31.65%、7.19%、11.60%)、漫游球菌屬(Vagococcus，17.70%、2.14%、6.62%)、擬桿菌屬(Bacteroides，5.33%、8.08%、9.44%)、球藻菌屬(Sphaerochaeta，2.25%、4.91%、4.94%)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter，7.13%、1.25%、1.31%)、肉食桿菌屬(Carnobacterium，6.97%、0.43%、0.80%)等。滲出液樣品中乳桿菌屬和漫游球菌屬的優勢較為明顯；魚肉樣品與魚肉外表面擦拭物樣品中優勢菌屬一致，為Psychrilyobacter和梭桿菌屬。

圖4 屬水平上的3種樣品的細菌豐度分析

3個樣品在屬水平上的差異來源于微生物的生長特異性，乳桿菌是革蘭氏陽性菌，兼性厭氧，有時微好氧，廣泛存在于發酵食品的微生物群落中[17-18]。漫游球菌屬能夠進行發酵代謝，利用一些碳水化合物產生乳酸，能合成蛋白酶、碳水化合物活性酶等，促進蛋白質、碳水化合物的分解[19]。乳桿菌屬和漫游球菌屬能夠加速乳酸積累，降低pH值，抑制其他微生物的生長，因而在滲出液樣品中具有較高的豐度。此外，乳桿菌也能夠產香味化合物，提高臭鱖魚特征風味化合物含量[20]；Psychrilyobacter能夠加速蛋白質水解，釋放游離氨基酸，梭桿菌屬是革蘭氏陽性菌，專性厭氧，Psychrilyobacter和梭桿菌屬在魚肉樣品中均具有較高的豐度，這可能是因為二者都能利用魚肉中豐富的營養物質進行生長繁殖。此外，Psychrilyobacter和梭菌屬是鱖魚發酵后期的優勢微生物，與芳樟醇、乙酸香葉酯、順式香芹醇、吲哚等特征香氣有關。擬桿菌屬(Bacteroides)是革蘭氏陰性厭氧菌，因此在魚肉樣品和表面樣品中相對豐度較高，在滲出液樣品中相對豐度低；肉食桿菌屬在滲出液樣品中相對豐度最高，該菌可產生2,3-丁二酮、2,3-戊二酮等揮發性物質，是鮭魚、蝦等水產品中的主要腐敗菌[21-22]；弧菌屬在魚肉樣品中相對豐度較高，可能是由于弧菌具有較強的蛋白質分解能力，能夠利用魚肉中豐富的蛋白質進行生長繁殖，也是水產品的特定腐敗菌[23]。

由于不同菌屬對氧氣的需求量和營養物質的利用程度不同，因此在滲出液樣品、魚體外表面擦拭物樣品和魚肉樣品中檢測出的優勢菌屬相對豐度有所差異。3種樣品中優勢菌屬對鱖魚的發酵均具有重要意義，取樣方式不同，微生物多樣性存在差異，對后續臭鱖魚風味化合物與其微生物的關聯分析造成影響。

2.4 基于屬水平的主成分分析

由圖5可知，第一主成分的貢獻率為83.70%，第二主成分的貢獻率為16.31%，累計貢獻率約為100%。3種樣品分布于不同區域，滲出液樣品位于PC1的負端區域及PC2的正端區域；魚肉樣品主要分布于PC1的正端區域及PC2的負端區域；魚肉外表面擦拭物樣品主要分布于PC1的正端區域及PC2的正端區域附近。將3種取樣方式樣品向PC1軸投影，魚肉樣品和魚肉外表面擦拭物樣品均位于PC1軸右側，且兩者較為接近，而滲出液樣品位于PC1軸左側，遠離魚肉樣品和魚肉外表面擦拭物樣品位置。由于PC1的貢獻率為83.70%，能夠概括絕大部分的樣品信息，因此魚肉樣品和魚肉外表面擦拭物樣品細菌群落結構相似，與滲出液樣品細菌群落結構差異較大。

圖5 基于屬水平的3種樣品細菌群落結構主成分分析

3 結論

本研究運用高通量測序技術分析了不同取樣方式對臭鱖魚細菌多樣性的影響。結果表明，魚肉樣品和魚體外表面擦拭物樣品中細菌多樣性相似，而與滲出液樣品中細菌多樣性存在差異。魚肉樣品的細菌豐度最高，說明微生物在營養豐富的魚肉中進行厭氧或兼性厭氧生長繁殖，魚肉樣品中Psychrilyobacter和梭桿菌屬為主要菌屬。滲出液樣品中的微生物多樣性最高，這可能與產品包裝時環境情況和人為操作有關，滲出液樣品中乳桿菌屬和漫游球菌屬為主要菌屬。綜合主成分和物種豐度聚類熱圖分析，魚肉樣品和魚體外表面擦拭物樣品細菌群落結構較為相似，與滲出液樣品細菌群落結構差異較大。因此在取樣過程中，可根據實際情況進行選擇。若要保證產品無損，則可選擇魚體外表面擦拭物取樣，方便快捷；若樣本為成品發酵魚，則可選擇魚肉取樣，可得到數量更為豐富的微生物；若樣本為發酵過程中的魚產品，則可選擇發酵液和魚肉取樣，可得到更為全面的微生物多樣性信息，且有助于從中分離得到發酵產品風味化合物形成的核心菌株。