經典血清分型法與分子分型法對肺炎鏈球菌血清分型的檢測結果比較

柳青 李云慧

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae,SP)是一種常見致病菌,屬于革蘭陽性雙球菌,對兒童和老年人的損傷最大,可導致兒童和成人發生社區獲得性肺炎。我國發病率約是全世界的15%左右,而且6 歲以下兒童因為感染肺炎鏈球菌后死亡的人數也是最多的［1］。肺炎鏈球菌已成為重要的全球公共衛生問題,除疫苗外,目前沒有公共衛生策略可減少其發病率［2］。肺炎鏈球菌的外囊多糖可以使體內產生保護性抗體,并用于制備疫苗。對肺炎細菌的血液進行監測,為肺炎細菌疫苗的制備和疾病預防提供重要的科學依據。經典莢膜腫脹法是肺炎鏈球菌的血清分型方法,雖然其發揮著重要作用,但也有一些局限性,例如低分辨率、復雜的操作步驟和主觀判斷結果。隨著莢膜多糖基因序列(CPS)的出現,分子分類技術以其靈敏度高、快速、準確、分辨率高、質量好等優點逐漸得到廣泛應用。本文使用經典的莢膜腫脹方法和多重PCR 方法用于相同標本的血清分型,為建立快速準確的血清分型方法提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2019 年1 月～2020 年12 月在北部戰區總醫院住院患者中分離的50 株肺炎鏈球菌作為研究對象,排除相同患者同一部位重復分離菌株。

1.2 方法 分別采用經典莢膜腫脹法與多重PCR 法進行血清分型檢測。

1.2.1 試劑與儀器 哥倫比亞血平板,VITEK compack 型全自動分析系統,棋盤式分型系統(pneumotest kit)試劑盒(丹麥國家血清研究所)0.1 g/dl的亞甲藍溶液,Leica DM2000 顯微鏡,QIAamp⑧DNA Mini Kit 核酸提取試劑盒,肺炎鏈球菌血清型分型引物,Taq DNA 聚合酶,PCR 擴增儀等。

1.2.2 試驗操作過程 細菌分離培養按《全國臨床檢驗操作規程》進行,挑取待測菌落在血平板上作奧普托欣(Optochin)試驗。經35℃10 ml/dl CO2過夜孵育,若Optochin 紙片周圍抑菌環直徑＞14 mm 判為Optochin試驗敏感,可以確定該檢測菌株為肺炎鏈球菌。若抑菌環直徑為9～13 mm 時應參照膽汁溶菌試驗,其他草綠色鏈球菌的抑菌圈直徑為＜8 mm。不敏感的就可以確診為非肺炎鏈球菌。所有菌株經VITEK2 compack 型全自動微生物分析系統加以鑒定。選取標準菌株美國模式菌種收集中心(ATCC) 49619(已知血清型為19F)作為質控菌株。50 株肺炎鏈球菌菌株均以濕牛奶冷凍法置于-76℃冰箱保存。試驗時將肺炎鏈球菌凍存管從-76℃冰箱取出至室溫,挑取3～5 μl 菌液接種于哥倫比亞血平板上,35℃,5 ml/dl CO2培養18～24 h。

經典莢膜腫脹法：①原理利用：棋盤式分型系統(pneumotest kit)分型［3］的經典莢膜腫脹方法。實驗原理是肺炎鏈球菌特異性抗血清與莢膜抗原結合形成復合物,經染色后鏡下可見細菌莢膜顯著增大或出現凝集；②操作步驟：挑取肺炎鏈球菌菌落放入小試管中,制成菌懸液約0.5 麥氏單位溶液；挑取約3 μl 菌懸液放入載玻片上,分別加入3 μl 縱列和橫行分型血清池,與菌懸液充分混勻。加入血清池的具體操作順序從上到下、從左到右(嚴格按產品說明書操作)；在上述混懸液中加入一接種環0.1 g/dl 的亞甲藍溶液,放入載玻片上與抗血清混勻1 min,蓋上蓋玻片,在顯微鏡下觀察是否有莢膜或凝集出現。

多重PCR 法：①DNA 提取：用QIAamp⑧DNA Mini Kit 核酸提取試劑盒提取細菌DNA,一切操作按照試劑說明書進行；②引物合成：肺炎鏈球菌血清型分型引物(http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/pcr.htm)上提供的,由上海生工生物工程有限公司合成；③PCR血清分型方案：基于美國目前主要流行血清型的肺炎鏈球菌PCR 血清分型方案；④PCR 擴增：PCR 反應體系為25 μl：Premix Taq(日本Takara 公司)12.5 μl,引物10 μl,dd H2O 1 μl、DNA 模 板1.5 μl。PCR 擴增條件：94℃ 4 min 預變性,94℃45 s 變性,54℃45 s 退火,72℃ 2 min延伸30個循環,最后72℃2 min作末端延伸。PCR 產物電泳后觀察結果。

1.3 觀察指標 比較兩種方法的血清分型率。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件進行數據統計分析。計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

多重PCR 法血清分型率76.0%高于經典莢膜腫脹法的44.0%,差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 兩種方法對50 株肺炎鏈球菌的血清分型率比較［株(%)］

3 討論

莢膜腫脹試驗(quellung 反應) 是由Neufeld 于1902 年命名的,發現肺炎鏈球菌抗血清可以和同型菌莢膜產生一種腫脹特征。棋盤式分型系統是傳統微生物實驗室進行肺炎鏈球菌血清分型的理想方法,但其操作步驟復雜,血清成本昂貴,而且通常取決于操作員的主觀性解釋結果,需要高專業技能,只能分為群體,細分類型需要單因素抗血清［4］。本研究表明,經典的血清分型方法對類群分類更具意義,但具體結果不明顯。這些因素不僅給血清分型技術的研究帶來困難,而且限制了血清分型技術的推廣。隨著PCR 法的不斷發展,為了成功克服傳統血清分型技術的不足,基于PCR 法的分子分類方法顯得特別重要。2011 年,瑞士學者Gervaix 等［5］在第一屆感染預防和控制國際會議上,報道了以多重PCR 和微陣技術相結合的新方法來自動檢測肺炎鏈球菌的血清分型。這種方法首次利用多重PCR 對肺炎鏈球菌溶血素、自溶素以及其他8 個莢膜操縱子基因進行擴增,相應引物被標記和點到微陣列芯片上,在自動分子診斷系統中使用聚焦激光顯微鏡進行掃描結果并分析,結果顯示這種新技術可準確識別出其中包括結合疫苗中出現的13 個血清型等51 個肺炎鏈球菌血清型。此外,基于PCR 法的分子分類方法可以用于某些直接被血清識別的樣本類型,也可以用于對某些傳統的血清學布局方法不敏感的樣本的檢測。本次研究證實,多重PCR 法比經典夾膜腫脹法分型率高,和李建平等［6］研究的結果相同。原因是莢膜腫脹法主要根據不同的多糖莢膜抗原和特異性血清抗原及特異性血清在肺炎的外層而產生較大的影響。肺炎桿菌株經過反復傳代,由于自身的溶解酶作用,細菌逐漸溶解,有報道稱,普通人工培養基上的莢膜容易丟失,多重PCR 法是由一個典型的引物合成基因簇(CPS)組合提取的DNA 相關莢膜,不受莢膜影響。由于區域、年齡和人口等不同因素的影響,可引起疾病的肺炎鏈球菌的血清型也不同。根據徐飛等［7］研究結果證實,肺炎鏈球菌血清型以19F、23F、6B、4、15B 為主。李馬超等［8］研究了杭州地區肺炎鏈球菌最常見的血清型為19F,其次為19A、6A、23F 和15B。潘芬等［9］分析了的48 株肺炎鏈球菌,以19F、19A、9V、6B、23F 為主。而本次研究發現19F 的比例較高,與劉又寧等［10］的研究結果相似。血清型替代削弱了接種七價肺炎鏈球菌結合疫苗(PCV7)的益處,并對生存率有選擇性壓力。隨著PCV13 增加19A,其為肺炎鏈球菌帶來了更大的預防益處。然而,PCV 由于其莢膜血清型的改變和昂貴的成本,在許多發展中國家并沒有得到廣泛的應用。肺炎鏈球菌的分子分型也存在一些不足,雖然人復合前列腺特異性抗原(CPSA)引物擴增的基因序列高度保守,但由于CPSA 基因的缺失或突變可能導致極少數菌株不能從陽性產物中擴增出來［11］。引物的設計存在一些缺點,首先,以PCR 為基礎的分子分型方法鑒定的肺炎鏈球菌血清型/群有限。肺炎鏈球菌有90 多種血清型,目前僅發表了40 多種血清型序列,但仍有50 多種血清型。部分引物具有血清型特異性而非血清型特異性,6A、6B、6C、6D 引物陽性擴增結果只能細分到6C、6D,其結果可能是血清型6C、6D；15B、15C 引物陽性擴增結果有可能是15B 或15C；不能細分型的還 有15A、15F、35A、35C、42、7C、7B、40、10F、10C、33C、9V、9A、33F、33A、37。另外,多重PCR法鑒定的結果之間存在交叉反應［12］,如7A 與7F、6A與6B 之間存在相似性。

綜上所述,多重PCR 法分子分型技術雖然有一定的局限性,但與經典莢膜腫脹法相比,其具有簡單、分辨率高、靈敏度強、準確可靠等優點,可廣泛應用于肺炎鏈球菌的常規檢測,成為一種可靠的分型方法。