丙戊酸鈉對嚴重燙傷合并海水浸泡損傷大鼠延遲補液時腹腔臟器功能和血流量的影響

孟祥熙，田雨沫，胡森，王莉莉，張慧蘋，鐘毓賢，王燕，王宏偉，孫奎，丁宇

1 承德醫學院附屬醫院 燒傷整形科，河北承德 067000；2 解放軍總醫院醫學創新研究部 創傷修復與組織再生研究中心，北京 100853；3 解放軍總醫院第六醫學中心 康復醫學科，北京 100048；4 承德醫學院附屬醫院 病理科，河北承德 067000；5 解放軍總醫院第四醫學中心 病理科，北京 100037；6 解放軍總醫院第六醫學中心 骨傷科，北京 100048

我國海洋活動和海上軍事活動日益頻繁，海上船舶人員意外燒傷后不可避免合并有海水浸泡，海上環境特殊，有效救治常需要間隔一段時間，如果能實施有效的自救互救措施，維持身體內環境穩定，就能為后續系統治療爭取時間，提高救治成功率。以往研究表明，組蛋白去乙酰化酶抑制劑具有細胞保護、抗氧化、抗炎等作用[1-3]。丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，在嚴重燙傷大鼠模型中，丙戊酸鈉能改善心臟、肺、腸道等重要臟器功能，延長存活時間[4-6]。嚴重燒傷后合并海水浸泡，因海水低溫、高滲透壓、細菌含量高等特點，救治難度更大[7]。以往這方面研究較少，因此本實驗模擬大鼠嚴重燙傷后合并海水浸泡，傷后立即給予抗休克維持藥物丙戊酸鈉，觀察其較單純延遲補液復蘇對臟器功能和生存率的影響。

材料與方法

1 實驗動物 180 只清潔級雄性SD 大鼠，60～70 d 齡，體質量250～ 300 g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2019-0010。購進后適應性飼養1 周以上，室溫維持在22℃～25℃，自由飲食。實驗前12 h 禁食、自由飲水。本研究經解放軍總醫院實驗動物倫理委員會批準。

2 主要儀器和試劑 丙戊酸鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；戊巴比妥鈉(SIGMA 公司)；丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、肌酐(creatinine，Cr)、二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO) ELISA 檢測試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)。DI PowerLab 多導生理記錄儀(澳大利亞ADInstruments)；RAPIDPoint500 血氣分析儀(德國西門子公司)；CKX53 型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；科華ST360 酶標儀(上海科華生物工程股份有限公司)；激光多普勒血流儀(瑞典PERIMED 公司)。

3 人工海水配置 實驗用人工海水按照國家海洋局第三海洋研究所提供海水主要成分配制(鹽度2.54%，滲透壓1 250～ l 350 mmol/L，pH 8.2)。實驗時人工海水的溫度為(23±1)℃。

4 動物模型制備和分組 大鼠按照隨機數字表法分為單純燙傷+延遲補液組(S 組)、燙傷+海水浸泡+延遲補液組(SS 組)、燙傷+海水浸泡+VPA +延遲補液組(SSV 組)，每組60 只。術前禁食12 h、自由飲水，動物稱重后給予戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔麻醉，固定、消毒、解剖分離一側頸總動脈、靜脈，分別插管，剪除頸背部和臀部的毛發，浸泡于100℃沸水中15 s 造成35% 總體表面積Ⅲ度燙傷(燙傷深度經病理組織切片檢查證實)，SS 組和SSV 組傷后立即浸泡于人工海水中(23℃，30 min)。SSV 組出水后即刻皮下注射VPA(300 mg/kg)。各組傷后2 h 按1/2 Parkland 公式靜脈輸入乳酸鈉林格注射液(30 min 完成)。

5 生存率觀察 每組取20 只大鼠，觀察24 h，記錄動物死亡時間，計算各組大鼠生存率。

6 相關指標及病理檢測 各組于傷前、海水浸泡后即刻、海水浸泡后2 h、海水浸泡后5 h 選取10 只大鼠，采用ADI PowerLab 多導生理記錄儀測定平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)，數字測溫儀插入肛門10 cm 處，測定直腸溫度(rectal temperature，RT)，血氣分析儀測定血乳酸(lactic acid，Lac)，Elisa 法測定丙氨酸氨基轉移酶、肌酐、二胺氧化酶含量，激光多普勒血流儀檢測肝、腎、小腸黏膜血流量，取肝、腎、小腸組織，HE 染色后，顯微鏡(400×)下觀察和拍照。

7 統計學處理 SPSS19.0 統計軟件處理數據，檢測各項指標所得的結果均以表示，多組間比較采用單因素方差分析和兩獨立樣本t檢驗，采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，組間比較采用log-rank 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 各組生存率比較 S組傷后24 h 存活數為18 例(18/20)，累計生存率為90%。SS 組大鼠存活數為11 例(11/20)，累計生存率為55%，較S 組明顯降低(χ2=6.6，P＜0.05)。給予VAP 治療后，SSV組存活數為15 例(15/20)，累計生存率為75%，較SS 組明顯提高(χ2=4.3，P＜0.05)。見圖1。

圖1 Kaplan-Meier 生存曲線Fig.1 Kaplan-Meier survival curve

2 各組MAP 和RT 變化 與S 組比較，SS 組和SSV 組傷后0 h、2 h、5 h MAP、RT 明顯降低(P均＜0.05)。與SS 組比較，SSV 組MAP、RT在傷后2 h、5 h 較SS 組明顯升高(P均＜0.05)。見圖2。

圖2 丙戊酸鈉對MAP(A)、RT(B) 的影響(a P＜0.05,vs S 組;bP＜0.05,vs SS 組)Fig.2 Effect of valproic acid on mean arterial pressure (A) and rectal temperature (B) (aP＜0.05,vs group S;b P＜0.05, vs group SS)

3 各組Lac 水平變化 與S 組比較，SS 組傷后0 h、2 h、5 h Lac 水平明顯升高(P均＜0.05)。給予VPA 治療后，在傷后2 h、5 h SSV 組Lac 水平明顯降低，與SS 組比較均有統計學差異(P均＜0.05)。見圖3。

圖3 丙戊酸鈉對血乳酸(Lac)的影響(aP＜0.05,vs S 組;bP＜0.05,vs SS 組)Fig.3 Effect of valproic acid on lactic acid (Lac) (aP＜0.05,vs group S;bP＜0.05,vs group SS)

4 各組肝、腎、小腸黏膜血流量變化 與S 組比較，在傷后0 h、2 h、5 h，SS 組和SSV 組肝、腎、小腸黏膜血流量明顯降低(P均＜0.05)。與SS 組比較，SSV 組在傷后2 h、5 h 肝、腎、小腸黏膜血流量明顯升高(P均＜0.05)。見圖4。

圖4 丙戊酸鈉對肝(A)、腎(B)、小腸黏膜(C)血流量的影響(aP＜0.05,vs S 組;bP＜0.05,vs SS 組)Fig.4 Effect of valproic acid on blood flow of liver (A),kidney (B),intestinal (C) (aP＜0.05,vs group S;bP＜0.05,vs group SS)

5 各組血漿內ALT、Cr、DAO 水平變化 SS 組和SSV 組在傷后0 h、2 h、5 h 的ALT、Cr、DAO水平較S 組均明顯升高(P均＜0.05)。給予VPA處理后，SSV 組ALT、Cr、DAO 水平較SS 組均明顯降低(P均＜0.05)。見圖5。

圖5 丙戊酸鈉對ALT(A)、Cr(B)、DAO(C)的影響(aP＜0.05,vs S 組;bP＜0.05,vs SS 組)Fig.5 Effect of valproic acid on alanine aminotransferase (A),creatinine (B),diamine oxidase (C) (aP＜0.05,vs group S;b P＜0.05,vs group SS)

6 各組肝、腎、小腸病理變化 各組大鼠于傷前和傷后即刻肝、腎、小腸組織結構完整，細胞排列整齊、緊密，在傷后2 h，各臟器組織細胞出現水腫、細胞間隙增寬，隨傷后時間延長，組織損傷程度逐漸加重。傷后2 h、5 h，SS 組各臟器組織水腫和損傷情況較S 組明顯加重。給予VPA 治療后，SSV 組組織損傷情況較SS 組明顯緩解。見圖6、圖7、圖8。

圖6 大鼠肝組織病理變化(HE 染色，400×)Fig.6 Pathomorphological observation of liver tissues of the rats (HE staining,400×)

圖7 大鼠腎病理變化(HE 染色，400×)Fig.7 Pathomorphological observation of kidney tissues of the rats (HE staining,400×)

圖8 大鼠小腸組織病理變化(HE 染色，400×)Fig.8 Pathomorphological observation of small intestine tissues of the rats (HE staining,400×)

討 論

嚴重燒傷后，皮膚屏障受損，毛細血管通透性增加，組織液大量滲出，有效循環血量銳減，引起低血容量性休克，組織灌注不足，同時伴有乳酸堆積、全身炎癥反應加重和氧自由基損傷[8-9]。燒傷后創面海水浸泡，進一步加劇創面漿液性滲出，導致血流動力學紊亂，加重缺血缺氧性損傷和酸堿失衡，較單純燒傷對機體損傷更重，救治難度更大[10-12]。若傷后即刻或早期皮下注射丙戊酸鈉，可提高機體對休克的耐受能力，對后續治療意義重大。

組蛋白乙酰轉移酶和組蛋白去乙酰化酶在生理狀態下保持高度平衡，當機體在創傷、缺血缺氧的情況下，這種平衡被打破，組蛋白去乙酰化酶抑制劑通過抑制去乙酰化酶活性維持“乙酰化動態平衡”，保護細胞功能[13]。丙戊酸鈉是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，在燒傷、膿毒癥和休克動物模型中，丙戊酸鈉能降低血管通透性，改善能量代謝，抑制炎癥反應，減輕臟器水腫[14-16]。本實驗建立35% TBSAⅢ°燙傷合并海水浸泡延遲補液大鼠模型，觀察丙戊酸鈉對血乳酸、腹腔臟器血流量及功能、生存率的影響。本實驗中S 組24 h 生存率為90%，SS 組生存率為55%，表明燙傷后海水浸泡較單純燙傷生存率明顯降低，給予VPA 治療后，24 h 生存率可提高至75%，較SS組明顯升高。

嚴重燒傷后創面大量漿液性滲出，引起組織和器官灌注不足，細胞缺血缺氧，乳酸代謝紊亂，血乳酸水平升高，導致高乳酸血癥，成為導致多器官功能障礙綜合征的重要因素[17]。因此乳酸水平可作為反映機體組織灌注不足、組織器官缺血缺氧的重要監測指標[18]。通過監測發病早期血乳酸水平計算乳酸清除率，不僅能監測早期組織灌注和細胞代謝情況，而且與預后直接相關[19]。單純海水浸泡后，引起機體低體溫、高滲性脫水、血流動力學紊亂、凝血功能障礙等損傷[11,20]。本實驗研究發現，與S 組比較，SS 組傷后0 h、2 h、5 h 的MAP、RT 明顯降低，Lac 水平明顯升高，表明燙傷后創面海水浸泡較單純燙傷大鼠血流動力學更加不穩定，組織灌注和缺血缺氧更加嚴重。給予VPA 治療后，與SS 組比較，SSV 組MAP、RT 明顯升高，Lac 水平明顯降低，證實VPA 在嚴重燒傷合并海水浸泡的大鼠延遲補液中，能維持有效循環，改善組織灌注和缺血缺氧性損傷，保護組織細胞的正常代謝。

臟器血流量反映臟器灌注情況，Cr、ALT、DAO 是反映肝、腎、腸道功能的重要指標，同時反映臟器功能的損傷程度。各組大鼠在傷后肝、腎和腸道血流量明顯降低，Cr、ALT、DAO 明顯升高，與單純燙傷組比較，SS 組臟器血流量下降水平明顯降低，Cr、ALT、DAO 水平明顯升高，表明傷后創面海水浸泡加重腹腔臟器灌注減少和臟器功能的損傷。而SSV 組在傷后2 h、5 h 較SS 組均臟器血流量明顯提升，Cr、ALT、DAO 水平明顯降低，表明VPA 能改善腹腔臟器血流量和腹腔臟器功能。在嚴重燙傷合并海水浸泡延遲復蘇治療中，傷后即刻給予丙戊酸鈉治療，可提高腹腔臟器血流灌注，保護腹腔臟器功能，增加機體對低血容量休克的耐受能力。

綜上所述，本實驗通過觀察丙戊酸鈉對35%TBSAIII°燙傷大鼠合并海水浸泡后延遲補液時血乳酸、腹腔臟器血流量和臟器功能的影響，證實丙戊酸鈉可改善腹腔臟器血流量和臟器功能，維持血流動力學穩定，提高生存率，但具體機制有待進一步研究。