原花青素對體外培養綿羊卵泡顆粒細胞增殖的影響

楊小峰 秦小偉 郭澤媛 呂麗華

（1. 山西農業大學動物科學學院，太谷 030801；2. 忻州師范學院生物系，忻州 034000）

卵巢中的顆粒細胞（granulosa cells，GCs）是卵泡形成和發育過程中的主要功能細胞，能為卵母細胞的生長和成熟提供必要的營養和RNAs，自身也進行著增殖和分化，因此，探究顆粒細胞增殖和分化的影響因素對雌性繁殖性能的提高有很重要的意義。

原花青素（proanthocyanidins，PC）是植物中常見的一類多酚化合物，是公認的天然抗氧化劑，通常以黃烷-3-醇單體為基本單位構成聚合體［1］。自然界中原花青素來源較廣，沙棘果、藍莓、葡萄籽、火龍果、黑玉米、黑枸杞等植物中原花青素含量較為豐富［2-3］。原花青素具有很強的清除自由基、抗氧化、抗衰老、調節血脂等生理活性［4-5］。有研究表明，原花青素能促進雌性生殖干細胞的增殖［6］。細胞的增殖受細胞周期相關基因和細胞凋亡相關基因的調控。細胞周期調控分子包括細胞周期蛋白（cyclin）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDKI）三大類。氨基末端結構及功能高度相似的p21和p27都是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CDKIs）。p21蛋白可通過抑制CDK活性而阻滯細胞進入S期，p27則是通過與CyclinD-CDK4或CyclinE-CDK2復合物結合在靜止細胞和G1期細胞發揮作用［7］。p21、p27基因表達量上調可以引起周期阻滯在G1期［8］。半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族是導致細胞凋亡的蛋白酶系統，在細胞凋亡機制中居關鍵地位［9］。在Fas引發的凋亡反應中，半胱氨酸蛋白酶級聯式地活化，其中caspase-8的活化是第一步反應。活化后的caspase-8會引發下游的caspase活化，誘導細胞凋亡［10］。

本試驗旨在研究原花青素對體外培養綿羊卵巢顆粒細胞增殖的影響，并找出促進顆粒細胞增殖的最佳時間和最適濃度，在此濃度和時間下培養顆粒細胞，測定細胞周期相關基因和細胞凋亡相關基因的表達量，以此進一步佐證原花青素對體外培養綿羊卵泡顆粒細胞的增殖效應。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗以山西省太谷縣綿羊屠宰場性成熟綿羊的健康卵巢為研究對象。本試驗使用的主要試劑 為 ：PC（Solarbio）、MTT 試 劑 盒（Solarbio）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa）、TB Green?TMPremix Ex TaqTMⅡ 試 劑 盒（TaKaRa）、DMEM基礎培養基、DMSO、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、雙抗、PBS、臺盼藍。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

1.2.1.1 綿羊卵巢顆粒細胞的收集 將在屠宰場采集的卵巢浸泡在滅菌的杜氏磷酸緩沖鹽溶液（DPBS）中，置于冰上迅速帶回實驗室。用滅菌過的眼科剪剪離卵泡，選取大小適中的卵泡（3 mm＜直徑＜5 mm）在75%的酒精中浸洗幾秒，轉至超凈工作臺中。剪開卵泡，用刮刀刮卵泡內壁，將刮取的顆粒細胞收集至培養基中。用細胞過濾篩過濾，去除雜質。收集含有顆粒細胞的培養液，在4℃，1 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，加入完全培養液重懸細胞并在37℃，5% CO2的條件下培養。

1.2.1.2 活細胞密度測定 顆粒細胞鋪滿培養皿約80%-90%時，用胰蛋白酶消化細胞3-5 min，終止消化后離心，棄上清，再用完全培養液重懸細胞。取少量細胞懸液用等體積0.4%的臺盼藍染色1 min，用血球計數板計數活細胞數量，計算細胞濃度。用完全培養液稀釋并調整細胞懸液濃度約為5×104個/mL。

1.2.2 MTT試驗 將上述細胞懸液接種至3個96孔板中，每孔200 μL，每孔大約1×104個細胞。剩余細胞冷凍保存，備用。將96孔板置于37℃，5%CO2的條件下培養至細胞數量大約到整個孔的50%左右時，棄去原培養液，添加含有不同濃度（20、30、40、50、60、70和 80 μg/mL）PC的完全培養液并設置對照組（0 μg/mL），每個濃度的培養孔做3個重復，分別繼續培養24、48和72 h。吸去上清液，每孔加入90 μL完全培養液，再加入10 μL MTT溶液，繼續培養4 h。再次棄去培養液，每孔加入110 μL Formazan溶解液，低速震蕩10-15 min，使結晶物溶解充分。在酶聯免疫檢測儀上，震蕩15 s，然后在490 nm測量吸光值（OD值）［11］，OD值的高低可間接反映細胞數量多少。

1.2.3 增殖基因表達量的檢測

1.2.3.1 總RNA的提取 將1.2.2冷凍保存的細胞復蘇后接種到6孔板中，細胞分為對照組（A組）和實驗組（B組），每組3個重復（A1、A2、A3/B1、B2、B3），繼續在 37℃，5% CO2的條件下培養 48 h。棄去原培養基，實驗組（B組）添加濃度為50 μg/mL PC的完全培養基（依據1.2.2的實驗結果），同時，對照組（A組）添加不含PC的完全培養基。然后用 Trizol法提取總 RNA［12］。

1.2.3.2 cDNA的合成 將對照組和實驗組（A1、A2、A3/B1、B2、B3）按照 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書分兩步進行反轉錄。第一步，去除基因組DNA反應，按照以下體系配制反應液 ：1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1 μL RNA，RNase Free dH2O 定容到 10 μL。反應條件為42℃，2 min，然后置于冰上。第二步，反轉錄反應，在第一步反應液的基礎上依次加入下列液體 ：1 μL PrimeScript RT Enzyme MixI，1 μL RT Prime Mix，4 μL 5×PrimeScript Buffer2，4 μL RNase Free dH2O，共計20 μL。反應條件為37℃，15 min；85℃，5 s；然后置于冰上。反應結束后，檢測產物純度以及濃度，于-20℃冰箱備用。

1.2.3.3 引物的設計與合成 依據NCBI上綿羊的預測序列（登錄號：XM027973596），利用Primer 5.0和Oligo 6軟件設計目的基因的引物，由上海生物工程股份有限公司合成。以綿羊18S基因作為內參基因，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences of RT-qPCR

1.2.3.4 RT-qPCR反應 依據TB Green?TMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書，以cDNA為模板，構建10 μL RT-qPCR反應體系：PCR上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 5 μL，cDNA 模板 2 μL，RNase Free dH2O 2.2 μL。反應條件為 95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s，共45個循環。擴增后生成擴增曲線、溶解曲線，利用其CT值分析結果。

1.2.4 數據分析統計 實驗數據利用SPSS 22.0進行分析，采用單因素方差分析和顯著性檢驗的方法。使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。RT-qPCR相對表達量檢測結果采用2-ΔΔCt法計數，各基因表達量均經過內參18S校正。

2 結果

2.1 不同濃度PC處理GCs不同時間后生長狀況

培養48 h后，與對照組（A1）相比，添加一定濃度PC的實驗組（B1、B2、B3）均可促進細胞增殖，濃度為50 μg/mL（B2）時細胞數量最多，增殖較為明顯。C為培養24 h，濃度為50 μg/mL時細胞數量圖，與對照組（A2）相比細胞數量增多，但是與培養48 h的B2圖相比，細胞數量較少。D為培養72 h，濃度為50 μg/mL時細胞數量圖，與對照組（A3）相比細胞數量明顯增多，與培養48 h的B2圖相比，細胞數量有一定的增加（圖1）。

圖1 不同濃度PC處理體外培養綿羊卵泡顆粒細胞不同時間后的生長狀況 （100×）Fig. 1 Growth status of sheep follicular granulosa cells in vitro cultured with different concentrations of PC for different time（100×）

2.2 MTT檢測不同濃度PC處理GCs不同時間后細胞數量變化

由圖2可知，體外培養綿羊顆粒細胞時，添加一定濃度的PC在一定時間內可以促進細胞增殖。當培養基中PC濃度為50 μg/mL時，培養24 h、48 h和72 h的OD值均為最大，細胞數量最多，24 h和48 h時顯著度高于其它濃度（P＜0.05）。隨著濃度的增高，對細胞促進增殖效應減弱。

圖2 不同濃度PC處理體外培養顆粒細胞24、48、72 h后的OD值Fig. 2 OD values of granulosa cells cultured in vitro after 24，48 and 72 h treatment with different concentration of PC

由于細胞處理48 h后的OD值較24 h高，且顯著度高于其它濃度（P＜0.05），因此后期實驗組處理條件為PC濃度為50 μg/mL，處理48 h。

2.3 特定濃度PC處理GCs增殖相關基因表達差異

由圖3可知，在PC濃度為50 μg/mL時，體外培養綿羊顆粒細胞48 h后，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27 mRNA的表達量顯著降低（P＜0.01），同時，半胱氨酸蛋白酶（caspase）家族中的caspase-8 的mRNA表達量顯也顯著降低（P＜0.01）。

圖3 綿羊顆粒細胞中增殖相關基因mRNA的表達Fig. 3 mRNA expression of proliferation-related genes in sheep granulosa cells

3 討論

原花青素是一種良好的抗氧化劑，其抗氧化能力比常見的抗氧化劑如VC、VE等還強［13］。原花青素具有抗腫瘤［14］、降血壓［15］、防治老年性疾病［16］、增強免疫功能［17］、抗輻射［18］等功效，還可以緩解女性更年期癥狀［19］。其在防止卵巢衰老中具有重要的作用，研究表明原花青素對生殖干細胞增殖具有促進作用，與長壽基因SIRT1有關［6］。沉默信息調節因子相關酶類（sir2基因家族）是一類依賴于NAD+的高度保守去乙酰化酶，其同源性最高的同系物SIRT1參與調控哺乳動物的生殖功能［20］。SIRT1可以依賴NAD+在C-末端賴氨酸-382殘基處的p53脫乙酰化，降低p53介導的轉錄活性，進而降低下游蛋白質的表達，如p21、p27等。通過去乙酰化作用，SIRT1可以抑制p53調控的細胞周期阻滯和細胞凋亡，增強DNA修復機制，促進基因組完整性的維持，促進細胞存活及增殖［6，21］。

caspase-8以酶原形式（procaspase-8）形式存在于許多組織中。procaspase-8由479個氨基酸構成，8種同分異構體中有2種有酶活性，能啟動受體介導的細胞凋亡。這2種酶原的N-端的兩個串聯的70個氨基酸左右死亡效應結構域與適配蛋白N-端的DED同源，所以procaspase-8可與FADD結合。在哺乳動物中，caspase的活化途徑主要有細胞外和細胞內途徑［10］。在凋亡的細胞內途徑中，效應蛋白在線粒體外膜透性的信號級聯后被激活，導致膜間蛋白的釋放，促進“凋亡小體”的形成，以及介導細胞死亡的caspases的激活；外部細胞凋亡依賴于死亡誘導信號復合物（DISC）的形成，DISC通常包括FADD和caspase-8。在這兩種凋亡形式中，細胞的死亡都是通過效應物caspase誘導的細胞水泡、DNA碎片化、磷脂酰絲氨酸外化和“凋亡小體”的形成來實現的［22］。本研究表明，添加原花青素的細胞培養基培養顆粒細胞可以使得caspase-8表達量下調。

體內研究表明，原花青素毒性較小，安全性較高。陳會從等［23］用原花青素對大鼠灌胃26周，劑量為 42、214、428 mg/（kg·d），大約相當于人日用量的10、50、100倍，過程中試驗動物沒有不良反應。停藥觀察幾周，未發現蓄積毒性反應。Huang等［24］在研究葡萄籽原花青素對大鼠血壓的影響時，未報到有不良反應。Rodriguez等［25］綜述了原花青素在動物體內毒性較小。本試驗對體外培養的綿羊卵泡顆粒細胞進行研究，發現原花青素可以促進卵泡顆粒細胞的增殖，一定程度上填補了原花青素對離體細胞生理機能影響的研究空白。

研究表明，通過抑制SIRT1的表達發現顆粒細胞凋亡率和卵泡閉鎖數增多，造成卵巢功能下降［26］。在小鼠實驗上發現可通過提高SIRT1的表達來提升卵泡的質量與數量，達到延緩卵巢衰老的作用［27］。原花青素促進雌性生殖干細胞增殖與其調控SIRT1對下游底物p53去乙酰化使之轉錄活性失活，進而無法激活下游基因p21，其機制與SIRT1-p53-p21信號通路有關［6］。本研究從基因mRNA表達量水平做了分析，可以進一步從蛋白質水平作分析研究；此外，原花青素促進GCs增殖的機理有待進一步證實。

卵巢衰老表現為卵泡的不斷喪失和卵泡質量持續下降，導致雌性動物失去生育機能［28］。卵巢衰老及病變嚴重影響雌性動物的生殖機能，而卵巢衰老與GCs的衰老和凋亡有密切的聯系。研究表明原花青素可以促進體外培養的卵泡顆粒細胞增殖，為抗卵巢衰老機能乃至促進動物繁殖提供一定的理論研究支持。

4 結論

添加一定濃度的原花青素可以促進體外培養的綿羊卵泡顆粒細胞的增殖，培養48 h，在原花青素濃度為50 μg/mL時，促進效果最明顯，顆粒細胞的增殖可能與周期相關基因和凋亡相關基因表達量的變化有關，其機制可能與SIRT1-p53-p21信號通路有關。雌性動物的顆粒細胞在卵巢形成和發育過程中起著重要的作用，原花青素可能對雌性綿羊的生殖起到積極的作用。