煙曲霉A-16產纖維素酶工藝優化及酶學特性

張開平 劉燕麗 涂綿亮 李繼偉 吳文標

（1. 百色學院，百色 533000；2. 西南大學食品科學學院，重慶 400716）

盡管經濟在快速發展和社會在不斷進步，但是全球仍然面臨著能源危機、糧食短缺和環境惡化等嚴峻挑戰，采用適當的生物催化劑將綠色、可持續、可再生且尚未利用的生物質轉化為高附加值產品已成為當前國內外關注的焦點［1］。纖維素是由β-1,4葡萄糖苷鍵連接而成的線性多聚糖［2］，是自然界中分布最廣［3］、含量最多、最清潔的可再生資源［4］，具有很高的利用價值［5］。復雜的結構特征［6］使纖維素分子的生物降解效率低［7］；目前其大多用于燃燒或直接廢棄，這造成了極大的資源浪費和環境污染。如果能通過纖維素酶將纖維素進行高效降解得到可進一步開發利用的產品，則對緩解全球面臨的能源與糧食危機、環境污染等問題具有重要的意義。

相對于具有成本昂貴、設備要求嚴格、產物提取困難和二次污染嚴重等缺陷［8］的化學降解法而言，纖維素酶降解法具有反應條件溫和、操作簡單、糖化率高、成本低、副產物少且無污染等優點［9-10］。雖然纖維素酶來源廣泛（例如細菌、放線菌和絲狀真菌均可分泌纖維素酶［11-13］），但是目前國內外研究最多的是絲狀真菌，如木霉屬、根霉屬、曲霉屬等［14-15］。然而在生產技術上仍然面臨纖維素酶活力低、熱穩定性差、最適pH范圍較窄的難題，這嚴重限制了其在工業化生產中的應用［16-18］。

本研究采用剛果紅染色法從土壤中篩選出一株性能優良、高產纖維素酶的真菌煙曲霉，對該菌發酵稻草秸稈生產纖維素酶的工藝參數進行了優化，并對所產纖維素酶的特性進行了研究，旨在為纖維素類農業廢棄物的開發利用提供有效的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 從百色市大王嶺自然保護區常年堆積的腐敗木質下的土壤中采集土樣，保存在4℃冰箱備用。

1.1.2 培養基 參照文獻［19-20］，作綜合調整。

（1）富集培養基（g/L）：CMC-Na 20.00、KH2PO41.00、Na2CO30.50、MgSO4·7H2O 0.20、FeSO40.05、MnSO40.05、蛋白胨 10.00、牛肉膏 10.00，pH自然。

（2） 篩 選 培 養 基（g/L）：CMC-Na 20.00、MgSO4·7H2O 0.20、KH2PO41.00、（NH4）2SO42.00、FeSO40.05、MnSO40.05、瓊脂 15.00，pH自然。

（3）種子培養基（g/L）：CMC-Na 20.00、MnSO40.05、蛋白胨 10.00、MgSO4·7H2O 0.20、KH2PO41.00、（NH4）2SO40.50，pH自然。

（4）復篩液體培養基（g/L）：CMC-Na 20.00、MgSO4·7H2O 0.20、KH2PO41.00、（NH4）2SO42.00、FeSO40.05、MnSO40.05，pH自然。

（5）搖瓶發酵培養基（g/L）：稻草粉5.00、蔗糖5.00、蛋白胨10.00、酵母膏3.00、吐溫-80 2.00 mL、KH2PO41.00、MgSO4·7H2O 0.20、MnSO40.05、（NH4）2SO40.50、CaCl20.40、FeSO40.05，pH 自然。

（6）斜面保藏培養基：PDA培養基。

1.1.3 主要試劑與儀器 剛果紅、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉等均為國產分析純，稻草粉（經清洗、干燥、粉碎、過120目篩，待用）；ThermoTaq DNA Polymerase（#EP0402） 和 dNTP Mix（R0192）購至Thermo公司，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（SK8131）和Ezup 柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（B518259）購至上海生工。

DNA電泳槽（H6-1），上海精益有機玻璃制品儀器廠；穩壓電泳儀（DYY-8），上海琪特分析儀器有限公司；電子分析天平（BSll0S），上海一恒科學儀器有限公司；顯微鏡（YS 100），日本Nikon；紫外可見分光光度計（UV-2700），日本島津；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D），上海森信實驗儀器有限公司；凝膠成像儀（SC850），上海山富科學儀器有限公司；PCR儀（2720 thermal cycler），美國 Applied Biosystems公司；可控恒溫搖床（HZQ-F160），上海躍進醫療器械廠；生化培養箱（SPX-300B），上海博泰實驗設備有限公司；高速離心機（YXJ-2），湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；測序儀（3730XL），美國Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶產生菌的篩選 富集培養：取5.0 g土樣置于45 mL生理鹽水中，加入無菌玻璃珠充分振蕩混勻，用濾紙過濾除去固體雜質得樣品液。取每種樣品液1.0 mL加入盛有30 mL富集培養基的250 mL錐形瓶中，置于45℃、150 r/min的恒溫搖床中培養5 d，得到第一代菌群。取1.0 mL一代菌液轉入30 mL新鮮富集培養基中，在45℃、150 r/min條件下培養5 d，得到第二代菌群；相同條件下重復富集培養8輪，得到熱穩定性纖維素酶產生菌群。

初篩培養：梯度稀釋富集后的培養液10-5-10-7倍，分別取0.1 mL涂布于平板篩選培養基，45℃培養4-5 d后，用剛果紅染色法［20］判斷纖維素酶產量，挑取透明圈較大且生長迅速的菌落劃線分離，直到獲得純培養，編號，保存備用。

復篩培養：將初篩獲得的單菌落轉接到種子培養基中，在45℃、150 r/min條件下培養3 d，制得一級種子液，然后按1%的接種量接入復篩培養基中，于45℃、150 r/min下搖床培養5 d。

1.2.2 纖維素酶活的測定 粗酶液的制備：發酵結束后，發酵液于12 000 r/min、4℃條件下離心15 min，收集上清液得粗酶液。葡萄糖含量的測定：采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定。羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulase，CMCase）及濾紙酶（filter paper activities，FPA）活性的測定分別參照文獻［3，21］。酶活力單位的定義：在45℃條件下，每分鐘催化底物水解釋放1 μmol葡萄糖所需要的酶量，即為1個酶活力單位（U），以U/mL表示。

1.2.3 菌種鑒定 （1）菌株形態觀察：將目標菌株點種至篩選培養基平板上，于45℃條件培養3 d后，觀察其菌落形態，結合《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》等進行分類鑒定。

（2）分子鑒定：從菌株的形態學特征，初步判斷該菌株為真菌。①DNA提取：用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取A-16菌株基因組DNA，置-20℃冰箱保存。②PCR擴增：以提取的DNA為模板，選用真菌18S rDNA通用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和 ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，PCR擴增體系和反應條件參照ThermoTaq DNA Polymerase（#EP0402）試劑說明書進行，擴增結束后將PCR產物于4℃冰箱保存。③PCR產物的檢測：用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對擴增的PCR產物進行檢測。④PCR產物純化：用上海生工的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（SK8131）進行純化回收。⑤測序：純化的目的片段與pMD18-T載體連接，然后轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，篩選并獲得陽性克隆子［21］。擴增產物交由上海生工生物股份有限公司，用BigDyeTr v3.1 Cycle Seq Kit（4336921）對純化后的PCR產物進行測序。⑥構建系統發育進化樹：將測得的18S rDNA序列提交GenBank數據庫中進行BLAST比對，選取相似性高的微生物序列，用Clustal W 2.0軟件進行多重序列比對，用MEGA 7.0軟件中的N-J鄰接法構建系統進化樹。

1.2.4 煙曲霉發酵稻草粉生產纖維素酶條件優化 以CMCase和FPA酶活力為指標，依次研究不同產酶條件［稻草粉添加量（2、4、6、8、10、12 g/100 mL）、產酶培養基初始pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）、發酵溫度（25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃）和發酵時間（2、3、4、5、6、7、8 d）］對纖維素酶活力的影響。在單因素試驗基礎上，以稻草粉添加量、初始pH、發酵溫度和發酵時間為變量，以CMCase酶活力為響應值，設計了4因素3水平共29個試驗點的響應面優化試驗。

1.2.5 數據分析 每個試驗點重復3次，實驗數據用PASW Statistics 18軟件進行單因素方差分析，多重比較用LSD法，結果以平均值±標準偏差表示。響應面試驗數據用Design - Expert 10.0 Trial軟件通過Box-Benhnken組合法進一步優化產酶工藝參數。

1.2.6 纖維素酶酶學特性初步測定 酶反應最適溫度及熱穩定性：分別在30℃-90℃條件下測定CMCase和FPA酶活力，確定最適反應溫度；其中以酶活力最高時所對應的溫度為參照，設定該溫度下的酶活力為相對酶活100%。然后將酶液分別置于不同溫度（30℃-90℃）的恒溫水浴鍋中保溫90 min，保溫結束后快速冷卻，在最適反應溫度條件下測定CMCase和FPA酶的殘余酶活；以未經處理的酶液作對照。

酶反應的最適pH和pH穩定性：以不同pH的緩沖液［檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 3.0-6.0）、磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液（pH 7.0-8.0）、甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0-11.0）］配制1% CMC-Na溶液或濾紙條溶液作為反應底物，在最適反應溫度下測定CMCase和FPA的酶活力，確定CMCase和FPA酶的最佳作用pH，其中以酶活最高時所加的緩沖液pH為標準，設定該pH條件下酶活力為100%。然后將酶液與不同pH（3.0-11.0）緩沖液等體積混合，4℃冰箱保存24 h，于45℃保溫2 h，再將酶液調回到最適pH值；在最適反應溫度下測定CMCase和FPA酶的殘余酶活力，用未經處理的酶液作對照。

2 結果

2.1 產纖維素酶菌株的篩選

對從土壤中初篩得到20余菌株進行純培養，復選出D/d值最大的8菌株，其CMCase和FPA酶活力見表1。由表1可知，菌株A-16產的CMCase和FPA酶活力分別為2 516.24 U/mL和686.48 U/mL，總活力均高于其它菌株，基本可以確定A-16菌株產的纖維素酶能力是最強的。因此，后續試驗選擇A-16菌株作為出發菌株，開展其發酵稻草粉生產纖維素酶工藝條件研究及對所產纖維素酶的酶學特性進行測定。

表1 產纖維素酶菌株酶活性Table 1 Enzymatic activity of the cellulase-producing strains

2.2 菌株鑒定

將菌株A-16接種到篩選培養基上培養3 d，菌落呈綠色，菌絲體產生大量分生孢子梗，頂端膨大為近似球形的頂囊，表面長滿單層或雙層的小梗；隨著培養時間延長，菌落變為墨綠色（圖1）；根據菌落形態及顯微鏡觀察，再結合《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》的比對，初步判斷該菌株是曲霉屬真菌。為了進一步確定該菌的類別，采用通用引物ITS1、ITS4對菌株A-16基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR產物只得到一條在500-600 bp之間有明亮的條帶，將PCR回收純化后產物送到上海生工進行測序，結果得到擴增的A-16菌株ITS序列片段大小為569 bp。將測得的18S rDNA序列提交GenBank數據庫中進行BLAST比對（登錄號：MH846230），挑選其中5株模式菌株的ITS序列進行同源性分析，用MEGA7.0軟件構建系統進化樹，結果見圖2。A-16菌株的18S rDNA序列與GenBank數據庫中煙曲霉（Aspergillus fumigatus）MT529449在同一個分支上，親緣關系最近，相似性達99%以上，再結合形態特征可以初步鑒定該菌為煙曲霉，命名為Aspergillus fumigatus A-16。

圖1 菌株A-16菌落形態Fig.1 Colony morphology of the strain A-16

圖2 菌株A-16基于18S rDNA的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strain A-16 based on 18S rDNA

2.3 煙曲霉發酵稻草粉生產纖維素酶單因素試驗

2.3.1 稻草粉添加量對纖維素酶活性的影響 由圖3可知，隨著稻草粉添加量的增加，CMCase和FPA酶活力先上升后下降，不同稻草粉添加量對纖維素酶活性的影響顯著（P＜0.05）。當稻草粉添加量為8 g/100 mL時，纖維素酶活性最強。繼續增加稻草粉濃度，反而降低了介質的孔隙率，溶氧不足，菌體生長受限，使得纖維素酶的活性降低。由多重比較得出，稻草粉添加量為8 g/100 mL時產酶能力（以所產纖維素酶的活性計）與其它稻草粉添加量時的相比差異顯著（P＜0.05）。因此，稻草粉添加量為8 g/100 mL時最佳。

圖3 稻草粉添加量對A. fumigatus A-16菌株纖維素酶活力的影響Fig.3 Effects of straw powder on the cellulase activity of strain A. fumigatus A-16

2.3.2 pH對產纖維素酶活性的影響 由圖4可知，產酶培養基初始pH對A-16菌株產纖維素酶活性影響顯著（P＜0.05）。隨著pH升高，CMCase和FPA酶活力變化趨勢基本一致，均呈現先增大后減小。由LSD法多重比較可知，初始pH 6.0時，CMCase和FPA酶活力最高，且明顯高于其它初始pH時菌株所產的纖維素酶活力（P＜0.05），說明A. fumigatus A-16菌株在中性偏酸性條件下能分泌較高的纖維素酶量，在堿性條件下不利于產酶。因此，選擇最佳培養基初始pH為6.0。

圖4 初始pH對A. fumigatus A-16菌株纖維素酶活力的影響Fig.4 Effects of initial pH on the cellulase activity of strain A. fumigatus A-16

2.3.3 溫度對產纖維素酶活性的影響 在其它條件恒定的情況下，不同發酵溫度對產酶的影響見圖5，菌株A-16生長溫度較寬且具有較強的高溫耐受性，隨著溫度升高，CMCase和FPA的酶活力呈現先上升后下降的趨勢。當溫度過高時，加快菌體老化，不利于纖維素酶的代謝積累，并且酶的穩定性顯著下降。當溫度為65℃時，CMCase活力達到最大值，為2 714.6 U/mL，顯著高于其它培養溫度下的菌株產纖維素酶活力（P＜0.05），是25℃培養條件下酶活力的1.95倍。然而，當溫度為55℃時，FPA的酶活力達到最高，為902.8 U/mL，由LSD法多重比較可知，55℃培養條件下產的FPA活力較其它培養溫度的顯著增大（P＜0.05）。因此，A.s fumigatus A-16產纖維素酶的適宜培養溫度范圍為55℃-65℃。

圖5 溫度對A. fumigatus A-16菌株纖維素酶活力的影響Fig.5 Effects of temperature on the cellulase activity of strain A. fumigatus A-16

2.3.4 發酵時間對纖維素酶活性的影響 由圖6可知，不同發酵時間對CMCase和FPA的酶活力有顯著影響（P＜0.05）。發酵5 d時，CMCase和FPA的酶活力均達到最高，繼續延長培養時間，營養供應不足，菌體開始老化，纖維素酶活緩慢下降。由LSD法多重比較可知，發酵到第5天時FPA酶活力雖然和第6-8天酶活力差異不顯著（P＞0.05），但綜合考慮時間成本、低耗能等因素，選擇最佳產酶時間為5 d。

圖6 發酵時間對A. fumigatus A-16菌株纖維素酶活力的影響Fig.6 Effects of fermentation time on the cellulase activity of strain A. fumigatus A-16

2.4 響應面法優化實驗

響應面設計及試驗結果見表2，方差分析見表3，根據回歸方程作出不同因子的響應曲面圖見圖7。對表2實驗數據進行二次回歸擬合后，得到回歸方程為：Y=2 916.68-215.88A-40.00B+29.83C-17.42D-9.15AB+50.10AC-56.46AD+154.38BC-59.47BD-35.82CD-301.240A2-301.57B2-334.09C2-254.14D2

圖7 響應曲面圖Fig.7 Response surface diagram

表2 響應面設計及試驗結果Table 2 Response surface design and test results

由表3可知，模型極顯著（P＜0.0001），模型失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型選擇合適，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析和預測。模型的可決系數R2為0.905 8＞0.9，說明90.58%的CMCase活力的變化可以用該模型來解釋。離散系數（CV）為5.30%，其值較低，表明整個試驗具有較好的精確性和可靠性，從而也說明該模型擬合度較好。

表3 響應面模型及回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of the response surface model and the regression equations

同時，模型中自變量一次項A和二次項A2、B2、C2、D2對 CMCase活力的影響極顯著（P＜0.01），BC對CMCase活力的影響顯著（P＜0.05），其它因素交互作用均不顯著（P＞0.05）。根據F值大小可知，各因素對CMCase活力的影響大小為：稻草粉添加量＞pH＞發酵溫度＞發酵時間。對回歸方程進行優化，得到最佳發酵條件為：稻草粉添加量7.28 g/100 mL，pH 5.94，發酵溫度65.03℃，發酵時間5.01 d。在此條件下預測最大CMCase活力為2 956.52 U/mL。為了方便實際操作，將最佳發酵工藝參數修正為：稻草粉添加量7 g/100 mL，pH 6.0，發酵溫度65℃，發酵時間5 d。為了驗證預測值與實際情況是否吻合，進行3次重復試驗。結果表明CMCase活力平均值為2 954.76±2.33 U/mL，與模型預測值接近，說明該模型具有較高的可信度。

2.5 菌株A-16產纖維素酶的特性

2.5.1 酶反應最適溫度及熱穩定性 粗酶液在不同溫度條件下測定CMCase和FPA酶活力，結果（圖8-A）表明，CMCase和FPA酶的適宜反應溫度均為70℃，且在40℃-80℃范圍內均有較強的酶活性，仍然保持在80%以上，說明所得纖維素酶屬于高溫酶。將酶液在不同溫度條件下分別保溫90 min，然后在70℃下測定CMCase和FPA酶的殘余酶活力，結果（圖8-B）表明，CMCase和FPA酶活力在80℃之內穩定性較好，處理90 min酶活力還保持在80%以上，繼續升高溫度至90℃保溫90 min，CMCase和FPA酶的相對酶活力均保持在70%以上。相比較CMCase，FPA的熱穩定性更好一些，90℃溫度范圍內隨溫度升高酶活力下降比較緩慢，90℃處理90 min后，仍然保持76.3%的酶活力，說明菌株A-16所產的纖維素酶具有良好的熱穩定性，具有良好的開發價值。

圖8 菌株A-16產纖維素酶作用的最適溫度及其熱穩定性Fig.8 Optimal temperature of cellulase activity of strain A-16 and and its thermo-stabilities

2.5.2 酶反應的最適pH和pH穩定性 粗酶液于不同pH條件下測定CMCase和FPA酶活力，結果（圖9-A）表明，CMCase和FPA酶的最適反應pH均為6.0，且在pH 5.0-8.0范圍內催化分解羧甲基纖維素和濾紙的效率高，可見菌株A-16所產纖維素酶的最佳反應條件為中性偏酸性。pH穩定性實驗結果（圖9-B）表明，CMCase和FPA酶活力在pH 5.0-7.0范圍內比較穩定，放置1 d后可保持70%以上的酶活力，尤其在pH 6.0時，CMCase活力可保持84.6%，FPA酶活力可保持86.9%；若反應體系pH低于5.0或高于7.0時，CMCase和FPA酶活力快速喪失，說明該酶是一種中性偏酸性酶，對pH變化比較敏感。

圖9 菌株A-16產纖維素酶作用的最適pH及其pH穩定性Fig. 9 Optimal pH of cellulase activity of strain A-16 and its pH stabilities

3 討論

理想的產纖維素酶效率是微生物發酵法具有實際應用價值的關鍵因素之一［13，22］。單因素和響應面優化建立的培養純化A. fumigatus A-16的條件組合具備高效生產纖維素酶的能力。本研究所得的優化條件使A. fumigatus A-16發酵產品的總纖維素酶活力較優化前提高了26.4%，優化效果十分明顯。以所獲產品的纖維素酶活力為考察指標進行比較，A.fumigatus A-16菌株及其培養條件優于已報道的A.fumigatus B-2-3菌株及其培養條件［23］。在優化條件下，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis DX4）［24］和放 線 菌（Streptomyces azureus T23-B）［25］相 比，A.fumigatus A-16能得到更高總纖維素酶活力的發酵產品，菌株產酶活力高了34.35%以上。

與其它報道的產纖維素酶菌株相比，本研究分離純化出來的煙曲霉A-16所產纖維素酶的活力更高、耐熱和耐酸特性更優異，具有潛在的開發價值。在工業生產中，耐高溫纖維素酶有助于提高纖維素降解率。目前，已有文獻報道了耐高溫纖維素酶生產菌，巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）［26］，嗜熱煙曲霉（A. fumigatus JCM 10253）［20］芽孢桿菌（Bacillus sp. BSC6-1）［18］，但這些耐高溫菌產纖維素酶的最適反應溫度為45℃-60℃，熱穩定性在50℃-70℃，而本研究篩選得到的A. fumigatus A-16菌株所產CMCase和FPA酶的適宜反應溫度條件為70℃，在80℃熱處理90 min，酶活力還保持在80%以上，其中FPA酶在90℃保溫90 min仍然保持76.3%的酶活力。較其它已報道的菌株具有明顯優勢，是一株性能優良的耐高溫纖維素酶生產菌株。本研究篩選得到的煙曲霉A-16與蔣芳等［27］、金偉等［28］篩選出來的耐高溫真菌在最適反應溫度（均為70℃）上相似，但其它條件均不相同。同時，A. fumigatus A-16菌株所產CMCase和FPA酶在pH 5.0-7.0范圍內穩定性較高，放置1 d后可保持70%以上的酶活力。這一溫和的pH范圍有利于生產應用。

本研究建立的培養純化A. fumigatus A-16的優化條件組合中，使用稻草粉為基礎培養基。我國有大量這種原料，價格低廉，生產成本低。同時，實現廢棄物資源化利用目標，減少資源浪費和環境污染。煙曲霉A-16是一株原始野生型菌，后續研究工作將通過誘變、菌種改良或蛋白質工程技術等現代生物技術手段來構建高效纖維素酶基因工程菌，優化生產工藝提高纖維素酶產量和增強酶活穩定性，旨在為耐高溫酸性纖維素酶的規模化生產及工業化應用提供優良菌株。

4 結論

本研究從土壤中篩選到一株性能穩定、高產纖維素酶的A. fumigatus A-16。通過響應面分析法優化獲得最佳產酶條件：稻草粉添加量7 g/100 mL，pH 6.0，發酵溫度65℃，發酵時間5 d，在最優發酵條件下，CMCase活力達到2 954.76 U/mL，FPA酶活為1 086.37 U/mL，較優化前提高了26.4%。該菌產纖維素酶的最適反應條件為70℃，pH 6.0，具有較強的耐熱能力和較好的pH穩定性，可作為耐高溫酸性纖維素酶生產的資源菌，具有纖維素酶制劑規模化生產和纖維素資源開發應用的潛力。