CLSI、EUCAST和中國耐藥判定標準概述

阮紫涵 黃安雄 王秀娟 黃玲利 郝海紅，3，4

（1. 華中農業大學 國家獸藥殘留基準實驗室，武漢 430070；2. 華中農業大學 農業農村部畜禽產品質量安全風險評估實驗室，武漢 430070；3. 華中農業大學深圳營養與健康研究院，深圳 518000；4. 中國農業科學院深圳農業基因組研究所 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室深圳分中心，深圳 518000）

眾所周知，抗菌藥物耐藥性對人類健康和農業生產已經產生了不利影響，細菌耐藥性問題也受到了全世界的關注。各國逐漸認識到加強監測獸用抗菌藥物使用的重要性，積極開展了一系列動物源性病原菌的耐藥性監控，包括相關的流行病學研究，為評估細菌耐藥風險提供了一些基礎數據。自20世紀以來，部分發達國家便開始設立了本國的動物源性細菌耐藥性監測系統，如挪威、英國、法國、加拿大［1］、荷蘭［2］、德國［3］以及日本［4］等國家。目前全球公認的最具權威的兩大機構分別是美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）和歐盟藥敏試驗標準委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）。CLSI是一個綜合性的非營利性國際標準方法開發和教育組織，它的許多臨床試驗標準和實踐被認為是黃金標準。EUCAST主要致力于協調歐洲藥敏試驗方法和耐藥性判定標準的開發過程，使其能夠規范適用于盡可能多的國家［5］。

由于耐藥性研究起步較晚，導致缺乏對細菌耐藥性的早期認識，加劇了抗菌藥物的濫用［6］。而不同國家對于抗菌藥物的耐藥判定標準是不同的，這與不同國家習慣使用抗菌藥物的種類和用量有關，這就啟示我們必須要建立起符合我國抗菌藥物耐藥情況的耐藥判定標準［7］。近年來，我國在耐藥判定標準的制定上進行不斷的努力，成立了耐藥監測機構，制定了許多符合我國抗菌藥物的耐藥判定標準，為臨床合理使用抗菌藥物、指導規范用藥提供了依據。此外，2017年，我國經歐洲臨床微生物學和感染病學會（European Society for Clinical Microbiology and Infectious Diseases，ESCMID）歐洲藥敏試驗委員會（EUCAST）批準成立了華人抗菌藥物敏感性試驗委員會（Chinese Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，ChiCAST）［8］， 這 將 有 利 于我國臨床微生物學研究所和臨床細菌學家更好地了解和遵守藥物敏感性測試的國際標準。本文比較了CLSI和EUCAST兩大組織在耐藥判定標準制定過程中的差異，并對中國在獸用抗菌藥物耐藥判定標準制定方面中取得的成績進行了總結，以期為獸用抗菌藥物制定耐藥判定標準提供可靠的理論數據。

1 耐藥判定標準的定義和意義

確定耐藥性的標準，稱為折點，是指最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）或抗菌藥物抑菌圈的直徑［9］，用來評估病原體對抗菌藥物是否具有抗性，或仍然保持敏感的依據。當使用推薦治療劑量就能使MIC低于或等于折點或抑菌圈直徑等于或大于折點，表現可能的臨床療效時，結果報告為敏感；反之，可能存在特定的微生物耐藥機制，藥物沒有表現出分離株的臨床療效，結果報告為耐藥；當使用標準劑量藥物可以在感染部位大量蓄積，并且治愈疾病，或者藥物雖不能在感染部位蓄積，但在安全劑量內增加劑量可以治療疾病時，報告結果為中介［10］。如果只用體外藥敏試驗來確定折點值，根據折點值可將細菌分為兩類：如果MIC值低于折點，則將它們定義為易感細菌；如果不是，它們被定義為耐藥菌株［11］。

制定耐藥判定標準需要3個參數［12］：（1）野生型臨界值（wild-type cut-off，COWT）/流行病學臨界值（epidemiological cut-off，ECOFF）；（2）藥效學臨界值（pharmacodynamic cut-off，COPD）；（3）臨床臨界值（clinical cut-off，COCL）。CLSI和 EUCAST 使用不同的折點制定方法，但在制定過程方面是相似的，都需要確定這3種臨界值，用于臨床實驗室的最終報告［13］。由于臨床治療高度依賴抗菌藥物的使用，耐藥性是一個動態的過程，即使確定耐藥性的標準，也會隨著實際情況的變化（例如相關政策發布和更新）及時更新［14］。

耐藥性標準的重要性在于開發新藥時，首先要進行體外研究以確認其活性，并進行臨床試驗以確定藥物、療效和MIC之間的關系。收集的臨床分離病原體的藥敏數據可用于得出病原體易感程度的結論，并根據感染部位和感染程度選擇合適的治療方案。如果分離鑒定出病原菌并獲得其藥敏試驗結果，就可以預測藥物的治療情況。如果已經采取了一些治療仍未治愈，可以結合折點數據來分析和確定是否有耐藥性或其他因素的存在。綜上所述，建立耐藥性標準對于指導臨床治療、協助臨床治療和控制細菌耐藥性的出現都具有重要作用。

2 CLSI耐藥判定標準

2.1 CLSI的概況

CLSI是世界衛生組織認可的“臨床和實驗室標準研究所”，我國常用的許多藥敏試驗都是參考其制定的標準。CLSI是一個制定臨床試驗標準和操作規范的組織，其目標是在醫學領域建立統一的標準和指南，以解決關鍵的臨床診斷和治療問題。CLSI整合來自多個來源的研究數據，以開發抗菌藥物敏感性測試方法、結果解釋和質量控制參數。CLSI敏感性測試委員會由3個委員會組成：抗菌藥物敏感性測試委員會、抗真菌藥敏試驗委員會和獸醫抗菌藥物敏感試驗委員會（表1）。

表1 CLSI主要委員會信息Table 1 CLSI main committee information

CLSI折點的可用性體現在多個方面。首先，CLSI是美國國家標準協會（American National Standards Institute，ANSI）指定的國際標準化組織（International Organization for Standardization，ISO）技術委員會212（ISO/TC 212）臨床實驗室檢測和體外診斷系統秘書處，ISO/TC 212負責制定實驗室醫學和體外診斷檢測系統領域的國際標準和指南，顯示出CLSI的專業性。其次，CLSI每年發布一次的M100《抗菌藥物敏感性試驗性能標準》［15］，其內容包括代表藥物選擇、抗菌藥物敏感性試驗判讀和質量控制（quality control，QC）的最新信息，顯示出其實用性。M100中提供的數據在全世界范圍內被實驗者、傳染病從業者和抗菌藥物藥敏試驗（AST）委員會廣泛使用，其軟件應用的算法基于M100的信息，顯示出其廣泛性。此外，CLSI文件M23《體外藥敏試驗標準和質量控制參數》的開發支持引入和變更M100中發布的判讀標準，為申辦方提交給監管機構的數據提供指導，并詳細說明CLSI藥敏試驗小組委員會遵循的標準發布或修訂QC范圍和藥敏試驗判讀標準。

2.2 CLSI-VAST的概況

CLSI獸醫抗菌藥物敏感性測試（CLSI veterinary antimicrobial susceptibility testing，CLSI-VAST）小組委員會致力于制定和促進從動物體內分離的細菌的體外抗菌藥物敏感性測試的性能標準、折點和解釋類別；并且通過開發新的或修訂的方法、折點、解釋類別和質量參數來不斷完善標準，促進使用這些方法的用戶進行對話。CLSI-VAST的目標是建立獸醫特定折點，以減少對人類折點的依賴。當某些抗菌藥物和生物體對所有動物種屬均無可用的獸醫折點時，將考慮參考人用折點。

目前CLSI已經制定的文件中，VET01和VET03分別是從陸生生物和水生生物中分離的細菌的敏感性試驗方法文件［16-17］，VET02描述了確立折點所需數據、ECOFF、QC參數以及如何提供數據進行評價的詳細信息［18］。

3 EUCAST耐藥判定標準

3.1 EUCAST概述

EUCAST于1997年在ESCMID的支持下成立，于2001-2002年進行了重建，并于2002年開始運行。EUCAST目前的職責是協調現有歐洲藥物的臨床折點、定義新藥的臨床折點、設置ECOFF并根據需要修改折點、統一抗菌藥敏感性測試方法，并開發網站（https：//www.eucast.org/），提供有關各種抗菌藥物的抗菌MIC和面積直徑分布的免費信息。

EUCAST提供了關于原理和標準操作程序的文件。前者總結了EUCAST可持續性評估標準的基礎信息；后者主要包括設置新的抗菌藥物折點、協調現有的折點、審查和修訂折點、建立區域直徑折點的程序和新藥的QC標準、MIC分配和ECOFF值設置的步驟。

3.2 VET-CAST的概況

抗菌藥物敏感性測試獸醫委員會（Veterinary Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，Vet-CAST）是EUCAST的一個小組委員會，成立于2015年。VET-CAST的主要功能是處理涵蓋動物細菌病原體的各個方面和動物源性細菌藥敏試驗。同時致力于發布免費的標準、指南、ECOFF、PK/PD折點、臨床折點（clinical breakpoints，CBPs）和其他有關AST實施的相關信息，為科研工作者參考利用（https：//www.eucast.org/ast_of_veterinary_pathogens/）。

到目前為止，VET-CAST制定了大多數獸用抗菌藥物的藥敏試驗折點，但仍有很多抗菌藥物缺少對所有病原菌的折點，或是缺乏一些動物特異性折點（表2）。這些抗菌藥物可能由于沒有合適的給藥方案造成濫用，導致治療人類感染的重要抗菌藥物耐藥性升高從而治療失敗。

表2 尚未制定出動物特異性折點的抗菌藥物Table 2 Antibiotics while no animal-specific breakpoints have been established

4 CLSI和EUCAST耐藥判定標準的差異

自1993年CLSI版本在中國推出以來，每個版本都由專家翻譯。該標準引進歷史悠久，修訂及時，與臨床緊密結合，是中國衛生部頒布的標準。EUCAST成立于1997年，歐洲標準于2002年統一，但國內對其研究和應用較少，然而EUCAST的專家規則和ECOFF為折點的制定提供了較為合理的標準，可作為CLSI的補充。

在功能方面，CLSI的業務涵蓋了臨床檢驗醫學的各個方面。折點主要由微生物學委員會下屬的抗菌藥物敏感性實驗分會完成，相對比較穩定；相比之下，EUCAST業務范圍較窄，主要專注于藥物敏感性試驗標準以及協調統一歐洲各個國家或地區的折點。

4.1 折點值及表達形式

CLSI文件中，僅規定運用折點來區分敏感、中介和耐藥，而EUCAST在此基礎上，提出ECOFF的定義，ECOFF是用來區分野生型菌株和非野生型菌株的MIC值，其不考慮臨床效力，單純考察細菌對藥物的敏感性情況，所以該值相對穩定，在一定時期內通常不會隨樣本來源及地區不同而產生差異，在全世界范圍內具有廣泛應用［19］。CLSI設置的耐藥判定標準通常低于EUCAST所設定的（表3）。此外，值得我們注意的有：（1）EUCAST對葡萄球菌屬中不同的細菌對氟喹諾酮類藥物制定了不同的折點，而CLSI則對所有的葡萄球菌屬對氟喹諾酮類藥物制定了相同的折點；（2）CLSI對所有的厭氧菌采用同樣的折點，相反EUCAST對不同的厭氧菌分別制定了折點，能夠更好地解釋藥敏試驗結果，且CLSI只制定了適用于厭氧菌的最小抑菌濃度的折點值，并未制定抑菌圈直徑的折點值；（3）并且EUCAST文件還在最后注明每種藥物的PK/PD的折點值。

表3 CLSI和EUCAST制定的部分折點的比較Table 3 Comparison of partial breakpoints established by CLSI and EUCAST

EUCAST 設置折點的過程（EUCAST SOP 1.4）［20］與 CLSI［21］類似，均需要確定 COWT/ECOFFs、COPD和COCL。不同之處在于EUCAST建立的耐藥性折點（resistance，R）是基于抗菌藥物的最高推薦劑量，缺乏明確的中介值（intermediate，I），MIC結果的表達方式為 ：S≤ X μg/mL，R＞Y μg/mL；CLSI則是通過稀釋法藥敏試驗結果與紙片法結果進行平行比較，經過統計分析，得到I值和耐藥性折點值，其MIC結果判定的表達方式為：S≤X μg/mL，I=Y μg/mL，R ≥ Z μg/mL。

4.2 藥敏試驗操作規程細節的差異

CLSI和EUCAST在藥敏試驗程序細節上的差異主要體現在培養基選擇、接種物制備、質控菌種選擇、孵育時間等方面（表4）。

表4 CLSI和EUCAST建立耐藥判定標準的藥敏試驗方法比較Table 4 Comparison of susceptibility test methods for development of susceptibility breakpoints by CLSI and EUCAST

4.2.1 培養基的選擇 除了表中常見細菌CLSI和EUCAST在培養基選擇上的差異外，一方面EUCAST使用MH-F（MH瓊脂/肉湯+5%脫纖維馬血+20 mg/L β-NAD）瓊脂和肉湯對難以培養的細菌進行藥敏試驗，而CLSI有更詳細的規定：如葡萄球菌肉湯的稀釋，除了需要陽離子調節的MHB（cation-adjusted mueller-hinton broth，CAMHB）外，還需要添加2%NaCl或50 μg/mL鈣；對于淋病奈瑟菌的藥敏試驗需要使用GC瓊脂和1%的生長補充劑，相比之下，EUCAST還未確定淋病奈瑟菌的藥敏試驗紙片擴散標準。

4.2.2 接種物的制備 CLSI和EUCAST規定接種物必須滿足0.5麥氏濁度標準，但是CLSI聲明接種物可以通過肉湯培養或菌懸液制備，而EUCAST聲明推薦使用菌懸液法。此外，EUCAST文件中，絲狀真菌的接種濃度為（2-5）×105CFU/mL，用血細胞計數器計數；CLSI文件中則要求絲狀真菌接種濃度為（0.4-5）×104CFU/mL，采用分光光度計計數。

4.2.3 質控菌株的選擇 CLSI推薦的質控菌株均為美國微生物保藏中心采集的ATCC菌株。除上述菌株外，EUCAST還可能使用其他國家收集的菌株作為質控菌株。

4.2.4 孵育時間 在CLSI中，常規培養細菌的孵育時間通常為16-20 h，但對難培養的細菌則規定了其他孵育時間。例如，葡萄球菌、巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌需要孵育18-24 h；睡眠嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、鏈球菌與李斯特菌需要孵育20-24 h，而空腸彎曲桿菌最特殊，需要在36-37℃的環境中孵育48 h或42℃環境孵育24 h。EUCAST除空腸彎曲桿菌在42℃孵育24 h外，其余細菌孵育均為18-20 h。

5 我國在耐藥判定標準方面的研究

抗菌藥在控制傳染病、保持動物健康和食源性產品的安全，對維持公共衛生安全方面至關重要。雖然有CLSI和EUCAST兩大組織制定的折點，但是不同國家之間的病原菌對抗菌藥物規定的給藥方案存在差異，如果完全按照這兩大組織制定的折點可能導致意想不到耐藥性的發生。

5.1 我國在耐藥性監測方面的成就

2005年，衛生部建立了“全國抗菌藥物臨床應用監測網”（Center for Antibacterial Surveillance，CAS，http：//y.chinadtc.org.cn/login）和全國細菌耐藥監測網絡（China Antimicrobial Resistance Surveillance System，CARSS，http：//www.carss.cn/），后者是覆蓋全國基本細菌耐藥監測的網絡，也是構成世界衛生組織（World Health Organization，WHO）全球監測細菌耐藥性工作的一部分［22］。但動物源細菌耐藥性研究監測起步較晚，2008年農業部才建立了動物源性細菌耐藥性監測制度［23］，以更好地實施動物源性細菌耐藥性監測計劃。據統計，直到2022年已經有23個耐藥性監測實驗室單位加入到我國動物源細菌耐藥性監測網絡，這些監測單位執行農業部動物細菌耐藥監測計劃的采樣要求，開展藥敏試驗。目前監測的細菌包括大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、彎曲桿菌（包括空腸和結腸彎曲桿菌）、腸球菌（包括糞腸球菌和屎腸球菌）、魏氏梭菌、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌和巴氏桿菌等［24-25］。此外，通過對上述細菌在中國不同時期、不同地區和不同動物的耐藥性及發展趨勢進行分析總結，了解中國動物源耐藥性的現狀、產生原因及耐藥趨勢，為我國采取有效措施控制動物源性細菌耐藥性提供了依據［26］。

5.2 我國在耐藥判定標準制定方面的研究

在折點的制定方面，我國的科研者做了許多努力并制定出符合我國耐藥性情況的折點值（表5）。從表中可以看出，對產氣莢膜梭菌、大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、沙門菌和巴氏桿菌的耐藥判定標準研究較多，與我國動物源細菌耐藥性檢測系統監測的細菌重合，對耐藥性監測工作具有一定幫助；并且監測的藥物大多是CLSI和EUCAST尚未制定出折點的抗菌藥物［27］，可為我國臨床用藥提供一些理論依據。其中，田二杰［28］和傅嘉莉［29］制定的達氟沙星對雞源大腸桿菌的野生型臨界值差距較大（約32倍），發生這種情況的可能原因有：（1）采集樣品的范圍不同。田二杰采集的樣品涉及全國各地并且包括多所農業高校贈送的雞源大腸桿菌，而傅嘉莉僅在廣東省幾個地區進行了采樣；（2）采集樣品的時間不同。與傅嘉莉相比，田二杰采集樣品的時間更長且包含4個季節；（3）樣本量的差異。田二杰進行測定的雞源大腸桿菌高達1 412株，遠超過CLSI規定的100株。相比之下，傅嘉莉只有363株的雞呼吸道大腸桿菌，樣本的豐富度和多樣性都較差。因此，以4 μg/mL作為我國達氟沙星對雞源大腸桿菌的野生型臨界值最為合適。李佳瑞［30］制定的安普霉素對豬源大腸桿菌的野生型臨界值為32 μg/mL，是丹麥測定 ECOFFs（16 μg/mL）的兩倍，這可能與兩國使用抗菌藥物的情況有關。同樣的情況可以在慶大霉素、鏈霉素和奇霉素對副豬嗜血桿菌的野生型臨界值研究中觀察到，出現這種情況最可能的原因是我國抗菌藥物的過度使用［31-32］。部分研究還通過PK/PD模型等制定了一些臨床治療的推薦劑量，如分別用馬波沙星和頭孢喹肟治療副豬嗜血桿菌的最佳推薦給藥劑量分別為16 mg/kg b.w.［33］和 4 mg/kg b.w.［34］；陶夢婷［35］預測用沃尼妙林治療兔源產氣莢膜梭菌的有效劑量為2.33 mg/kg b.w.，與EUCAST推薦的劑量（3 mg/kg b.w.）相近，具有一定的臨床指導意義；Lei等［36］首次提出大環內酯類藥物替地羅辛對豬多殺性巴氏桿菌的敏感性折點為4 mg/kg，并且證明之前的推薦劑量4 mg/kg不能夠達到理想的殺菌作用，預測12.17 mg/kg b.w.才是充分有效的治療劑量。從表5中可以看出，大多數研究人員只進行了野生型和/或藥效臨界值研究，而對COCL的研究幾乎沒有可用的數據，且在獲得臨床相關數據方面的難度大，使得COCL在制定過程中常常受阻。這提示國家層面上應該多多促進科研人員與養殖人員的交流與合作，共同努力以獲得相關的臨床數據［27］。

表5 我國在動物源性病原菌耐藥判定標準方面情況進展Table 5 Progress in standard for susceptibility breakpoints of animal-borne pathogens in China

續表（Contitnued）

6 展望

抗菌藥物耐藥性是一場全球公共衛生危機，具有威脅成功治療細菌感染的能力［50］。世界衛生組織在2017年發布了關于在食源性動物中使用醫學上重要的抗菌藥物的指南，建議停止常規使用抗菌藥物來促進健康動物的生長和預防疾病［51］。這一指南希望通過減少抗菌藥物在動物中使用來維持抗菌藥物在人類醫學方面的有效性［52］。控制耐藥性的一個關鍵是制定出符合本地區的耐藥判定標準，以用于指導臨床用藥，防止用藥過多造成抗菌藥物壓力環境，或用藥不足而導致的治療失敗。

雖然近年來我國在動物源細菌的監測和耐藥判定標準的制定上已經取得了一些研究進展，但是有些耐藥判定標準只能反映部分地區的耐藥性情況，并不適合應用于全國，所以還未形成完備的指南。這就需要廣大科研工作者努力探索出更加快速、簡便和準確的方法來制定出全國適用的獸用耐藥判定標準，以指導臨床合理使用抗菌藥物、推進新獸藥的開發和細菌耐藥檢測工作。同時，未來我國需要繼續加強對獸用抗菌藥物使用的監管和監督，督促各獸藥使用者按照推薦的給藥劑量對動物進行細菌感染的預防和治療，為實現獸用抗菌藥物高療效、控制耐藥性的發展作出應有貢獻。