細菌黏菌素耐藥性及其逆轉機制研究進展

胡功政 崔小蝶 翟亞軍 賀丹丹

（河南農業大學動物醫學院，鄭州 450046）

黏菌素（colistin，COL）屬于陽離子多肽類抗生素，因腎臟和神經毒性于20世紀70年代幾乎被棄用，由于多重耐藥（multidrug-resistant，MDR）革蘭陰性菌的出現，醫學和獸醫臨床將面臨無抗菌藥可用的局面，因此COL又被老藥新用，作為治療嚴重MDR革蘭陰性菌感染的最后一道防線。而隨著COL使用的增長，細菌COL耐藥性世界范圍內日益增長，已成為全球關注的焦點。研制具有新作用靶點的新抗菌藥異常艱難，而逆轉耐藥性的聯合用藥（與新的化合物或老藥聯用）是與MDR細菌斗爭的經濟、有效策略。聯合用藥可利用藥物間的協同作用，大幅提高抗菌療效，克服細菌耐藥性，減緩耐藥性發展。逆轉COL耐藥性的化合物篩選、逆轉作用（聯合用藥協同增效）及其機制研究，近年已引起國內外高度重視［1-4］，并已取得可喜進展。

細菌COL耐藥性，本質上是細菌在COL壓力下、為了生存而產生的適應性反應，與COL的作用機制密切相關；而聯用藥物或佐藥的逆轉作用往往也針對其作用機制和耐藥機制，即作用機制、耐藥機制與逆轉耐藥機制間具有有機的內部聯系。

1 COL作用機制

過去一般認為COL對革蘭陰性菌的作用機制是膜損害（膜裂解死亡途徑），現在的試驗已證明其作用機制還包括：囊泡-囊泡觸聯途徑、活性氧（reactive oxygen species，ROS）殺滅途徑及呼吸酶抑制途徑。

1.1 膜裂解死亡途徑

COL可選擇性地與革蘭陰性菌外膜（outer membrane，OM）LPS（起始靶位）結合，通過膜裂解殺滅細菌［5-7］。首先，COL帶正電荷的二氨基丁酸殘基中的游離r-氨基質子化，靜電吸引類脂A中帶負電荷的磷酸頭部，競爭性替代Ca2+和Mg2+。隨后COL分子插入疏水性N-末端脂肪酸鏈和D-phe6-L-leu7片段進入外膜，減弱鄰近類脂A的組裝，引起外膜膨脹并形成不穩定區。最后，COL橫跨疏水頭部和脂肪酸鏈的表面，引起自促攝入（self-promoted uptake），使內膜（internal membrane，IM）稀薄并破壞磷脂雙層的完整性，從而導致IM裂解和細菌死亡。

1.2 囊泡-囊泡觸聯途徑

COL分子可借助于靜電作用和兩個疏水區，與陰離子的磷脂囊泡（即OM內葉和IM的外葉）結合，介導環繞周質的囊泡-囊泡觸聯融合，引起囊泡間（OM和IM小葉間）的磷脂交換，導致磷脂組成的特異性喪失和滲透性平衡破壞，使細菌裂解死亡［5-7］。

1.3 羥基自由基（·OH）誘導的死亡途徑（活性氧ROS殺滅途徑）

COL穿過外膜和內膜時，使細菌活性氧（ROS）［超氧化物（O2-）、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（·OH）］水平升高，首先促進生成O2-，O2-隨后由超氧化物歧化酶（SOD）轉換成H2O2，H2O2將Fe2+氧化成Fe3+并生成·OH（芬頓反應）?！H可導致DNA損傷、脂質和蛋白質的氧化損傷，最終導致細菌死亡［5，7］。這一過程不依賴于COL與OM特異性靶位點的結合。

此外，COL刺激大腸桿菌soxS的表達，soxS是sodA（編碼含Mn-SOD），fpr（編碼NADPH：鐵氧蛋白氧化還原酶）和ydbK（編碼Fe-S還原酶）等ROS應激相關基因的轉錄激活劑［5］。

1.4 呼吸酶抑制途徑

COL穿過外膜和內膜進入細胞后，可加速TCA（三羧酸）循環和增強呼吸鏈，通過抑制細菌呼吸鏈中的NADH氧化酶等關鍵酶，造成呼吸鏈混亂并生成超氧化物［5-6］。

2 COL耐藥機制研究進展

沙門菌、大腸桿菌等對COL的獲得性耐藥機制十分復雜，主要有染色體介導的脂多糖（LPS）修飾［由雙組分信號轉導系統（TCSs）PhoPQ和PmrAB］、質粒介導的可轉移COL耐藥（mcr基因）及尚未闡明分子機制的主動外排系統等［7-9］。

2.1 染色體介導的LPS修飾（涉及2個TCSs PhoPQ和PmrAB）

2.1.1 PhoPQ介導LPS類脂的AL-Ara4N修飾 TCS PhoPQ由感應子激酶PhoQ和調控子PhoP組成（圖1）。PhoP通過感應陽離子抗菌肽等外部信號使自身發生磷酸化而被激活，后者再激活arnBCADTEF（也稱pmrH）的表達。pmrH編碼4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖（Ara4N）轉移酶，使陽離子的Ara4N加成到類脂A的磷酸基團，產生L-Ara4N化修飾，導致陽離子COL與外膜陰性LPS的親和力降低，使細菌耐藥［7-9］。MgrB為負性調控蛋白，通過抑制PhoQ而抑制pmrH的表達。mgrB缺失、變異，均可上調PhoPQ和pmrH的表達，導致對COL耐藥。

圖1 由脂多糖（LPS）修飾介導的沙門菌對黏菌素的一般耐藥機制Fig. 1 General mechanism of Salmonella resistance to COL mediated by lipopolysaccharide（LPS）modification

2.1.2 PmrAB介導的類脂A的pEtN修飾 TCS PmrAB由感應子激酶PmrB和調控子PmrA組成（圖1）。沙門菌中，PmrD是PhoPQ和PmrAB兩個TCSs間的連接蛋白，發揮正調控作用。PmrB感應外部信號（如COL等）被激活，通過磷酸轉移使PmrA磷酸化而激活，進而上調pmrC表達，pmrC編碼磷酸乙醇胺（pEtN）轉移酶，使pEtN加成到類脂A的1-磷酸上，產生pEtN修飾，使細菌耐藥［8-9］。PhoPQ也可通過激活PmrD，間接激活PmrAB，進而刺激pmrC的表達。PmrA磷酸化后也可上調pmrH的表達。

PmrA介導的LPS修飾發生于類脂A、核心多糖和 O-抗原鏈 3 個區域［6，8］。（1）最內的類脂 A區，PmrA除激活pmrC、pmrH外，還可激活L-Ara4N生物合成與類脂A修飾物加合相關基因ugd（編碼UDP-葡萄糖-脫氫酶）和pbg（編碼L-Ara4N轉移酶）的表達；（2）中心的核心多糖區，PmrA可激活eptB和cptA基因，后者的產物可介導LPS核心區磷酸化的庚糖（I）磷酸基團的PEtN修飾；（3）最外的O-抗原鏈，O抗原長度的增加將導致對COL高度耐藥，PmrA可上調沙門菌LPS修飾位點Wzzst和Wzzsep基因的轉錄，增加LPS中O-抗原量，增加耐藥性。

2.2 質粒介導的耐藥機制

自質粒介導的mcr-1（編碼pEtN轉移酶）被發現以來［10］，已在全球動物和人的腸桿菌科細菌中相繼檢出。迄今已報道10種mcr基因（mcr-1-mcr-10）［11］。MCR-1編碼一個pEtN轉移酶，導致在pEtN加成到LPS的脂質A，增加LPS上的陽離子電荷，從而降低COL與LPS的結合［10］。所有已發表的MCR-1的晶體結構都表明MCR-1的活性位點有至少一個共同的鋅離子，證實MCR-1是一種鋅離子蛋白［12］。mcr-1可同時位于染色體和質粒上，單拷貝mcr-1可致LPS修飾，而多拷貝染色體mcr-1可促進耐藥性的穩定持續［13］。位于質粒上的mcr基因加速了COL耐藥性在不同細菌種屬之間的傳播，因此為解決COL耐藥日益嚴重的問題，中國已禁止將COL作為飼料添加劑用于促生長，許多歐洲國家也減少了COL在畜牧業中的應用［14］。

2.3 未闡明分子機制的主動外排系統

采用正向（激活）或反向（基因缺失或外排泵抑制）研究均證明，外排泵如AcrAB-TolC（大腸桿菌、沙門菌等），KpnEF（肺炎克雷伯菌），以及MexXYOprM（綠膿桿菌）等在COL耐藥性中十分重要［8-9］。外排泵抑制劑CCCP能逆轉多種細菌對COL的耐藥性，無論涉及pmrB、mgrB變異，還是涉及mcr-1陽性，均有逆轉效果［15］。我們前期研究發現，沙門菌主動外排系統（AcrAB-TolC）ΔacrB時，并不明顯改變對COL的敏感性，但當ΔtolC或ΔacrB與CpxAR系統激活協同作用時，菌株對COL的敏感性顯著增強［16-19］。而SoxRS可通過上調AcrAB-TolC介導陰溝和阿氏腸桿菌對COL的異質性耐藥［20］。盡管現已證明外排泵在COL耐藥性中有重要作用，但其具體分子機制并不清楚。

3 佐藥逆轉細菌COL耐藥性的研究進展

3.1 逆轉COL耐藥性的藥物或化合物

研發新抗菌藥耗時長、費用高、風險大，而抗生素佐藥（adjuvants）針對細菌的非必須功能，并增強抗生素活性，可提供經濟有效的方法逆轉細菌耐藥性。

目前，應用佐藥逆轉COL耐藥性已成為研究熱點，有多種方法用于佐藥篩選，如表型檢測（MIC測定、棋盤試驗等）、分子對接技術、生物信息學方法［4］和萬古霉素低溫拮抗作用篩選方法［21］等。萬古霉素低溫拮抗作用是有用的較新的特異性篩選平臺，E.coli在應激期間對萬古霉素變得敏感，這種表型可由滅活涉及外膜生物合成尤其是LPS核心多糖合成所必需的基因所逆轉。由于涉及非必需的外膜生物合成的基因損害，常常使革蘭陰性菌對經典的作用于革蘭陽性菌的抗生素敏感，故在低溫下即15℃對萬古霉素拮抗作用的篩選檢測，可檢出擾亂外膜的非致死分子即逆轉COL耐藥性的化合物。已有研究利用該篩選方法對1 440種之前批準的藥物進行了篩選，篩選鑒定出1種活性化合物噴他脒（pentamidine），能夠逆轉革蘭陰性菌的COL耐藥性，突顯了這種篩選方法的特異性。

已報道逆轉COL耐藥性的佐藥約60余種，主要包括（1）抗寄生蟲藥物：如抗原蟲藥噴他脒、水楊酰苯胺類抗蠕蟲藥五羥氯柳胺、氯硝柳胺、碘醚柳胺等［21-25］；（2）大環內酯類抗革蘭陽性菌抗生素克拉霉素、阿奇霉素等［26］；（3）其他藥物：褪黑素［27］、紫檀芪（抗癌）［28］、疊氮胸苷［29］、阿司匹林等；（4）天然化合物：如白藜蘆醇、熊果酸、蛇床子素、丁香酚［30-33］；（5）藥物衍生物：如苯并咪唑、色胺和苯氨乙酮衍生物和［34-35］；（6）新的先導化合物：如廣譜佐藥SLAP-S25［1］、OmpA抑制劑AOA-2［36］；（7）小分子化合物 ：二氨基咪唑［37］、dephostatin［38］和帶正電荷的二胺嗎啡代寡核苷酸肽［39］。

3.2 逆轉COL耐藥性的分子機制

逆轉COL耐藥性的機制研究報道不斷增加，但仍處于初步探索階段，大多數僅針對相應藥物的某一方面機制進行研究且不深入，復雜的逆轉機制闡明仍面臨著挑戰。目前已報道的逆轉COL耐藥的機制主要分為以下幾個方面：與COL作用機制相關的逆轉機制，與COL耐藥機制相關的逆轉機制、影響外膜蛋白表達的逆轉機制以及綜合逆轉機制。

與COL作用機制相關的逆轉機制主要有：（1）損害細菌外膜：通過外漏蛋白質或核酸含量的測定、膜完整性和通透性試驗、細菌的溶解檢測等試驗證明 ：如噴他脒［21］、氯羥柳胺［22］、粉防己堿［40］等逆轉細菌（肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、大腸桿菌）COL耐藥性，其機制在于損害細菌外膜而增加了細菌外膜的通透性；（2）增強氧化應激：質子驅動力（PMF）的破壞會減少ATP的生成，增加氧氣消耗和氧化應激。當外排泵受到抑制時，通過PMF、細胞內ATP水平、耗氧量及菌體內氧化還原電位測定等證明，氯硝柳胺能使大腸桿菌解偶聯氧化磷酸化，破壞菌株的氧化還原穩態，導致氧化應激增加，是逆轉COL耐藥性的機制之一［41］。

與COL耐藥機制相關的逆轉機制主要有：（1）抑制mcr-1的表達或抑制MCR-1蛋白，如粉防己堿可抑制 mcr-1 的表達［40］；蛇床子素［32］、紫檀芪［28］、苯氨乙酮衍生物（能通過氫鍵與MCR-1蛋白互作，抑制MCR-1晶體所導致的磷酸乙醇胺（pEtN）轉移反應，抑制MCR-1的酶活性）［35］、丁香酚［33］不僅可抑制mcr-1的表達，而且其酚羥基還可與MCR-1蛋白的鋅原子結合，與COL聯用對大腸桿菌產生協同抗菌作用；帶正電荷的二胺嗎啡代寡核苷酸肽［39］是以mRNA為靶位、阻止翻譯的MCR-1反義分子，能恢復mcr-1陽性大腸桿菌對COL的敏感性。（2）下調TCS pmrAB表達，如小分子二氨基咪唑［37］及亞硝苯胺類化合物dephostatin［38］，能顯著下調或阻斷TCS pmrAB，逆轉類脂A修飾，阻斷細菌（沙門菌）對COL的耐藥性。（3）外排泵機制：基因缺失技術證明，沙門菌標準菌株JS主動外排系統ΔtolC時，能夠明顯改變對COL的敏感性，菌株對COL的敏感性顯著增強［19］。采用表型改變、外排泵活性、分子對接、轉錄組、基因缺失、熒光探針檢測等試驗及細菌細胞內的抗生素濃度變化證明，多類逆轉藥物（如氯羥柳胺［22］、熊果酸［31］、CCCP［15］和粉防己堿［40］）均有外排泵抑制作用，能使COL耐藥的大腸桿菌或沙門菌恢復敏感性。

影響外膜蛋白表達的逆轉機制：AOA-2通過下調OmpA和上調OmpA25的表達量，增強COL對鮑曼不動桿菌的殺菌活性［36］。

綜合逆轉機制，如SLAP-S25通過膜損害、代謝改變和細胞內抗生素蓄積［1］多種機制恢復細菌對多種抗生素包括COL的敏感性；褪黑素能增加外膜的通透性、促進氧化損傷和抑制外排泵［27］，逆轉由MCR介導的陰性菌對COL耐藥性。粉防己堿通過增強COL的膜損傷能力、破壞了細菌的質子動力、外排泵功能和抑制MCR-1蛋白來逆轉由MCR介導的沙門菌對COL的耐藥性（圖2）［40］。

圖2 逆轉革蘭陰性菌黏菌素耐藥性的分子機制Fig. 2 Molecular mechanism of reversing COL resistance in gram negative bacteria

4 存在問題與展望

近年文獻報道的逆轉細菌COL耐藥性的佐藥已有60余種，但因有效性、安全性、特異性和合理用量等問題尚無一個成功用于臨床。這些佐藥的化學結構及藥理作用各異，其共性逆轉機制除膜損害、mcr-1表達降低或MCR-1活性抑制得到清晰的闡明外，對其他方面分子機制的研究尚不系統深入。例如，抑制外排泵、增加氧化損傷被證明是逆轉COL耐藥性的重要機制，但革蘭陰性菌外排泵有多種，除最重要的外排系統AcrAB-TolC外，依賴TolC的RND外排泵還有AcrAD-TolC、AcrEF-TolC、AcrABTolC等多種，每種外排泵又有多個組分，且其表達受marA、soxS、robA、ranA等全局調控基因的調控。佐藥抑制何種外排泵、如何抑制外排泵而逆轉COL耐藥性及其量效關系？又如氧化損傷涉及ROS產生、清除、TCA循環、呼吸鏈等環節，佐藥通過影響何種環節，來逆轉細菌對COL的耐藥性？其量效關系如何？目前對佐藥或聯合用藥逆轉COL耐藥性的分子機制遠未闡明，該方面的研究總體處于初步階段，是制約安全高效佐藥篩選及聯用措施建立的關鍵瓶頸。

隨著組學（轉錄組、代謝組和蛋白質組）技術的應用，結合差異基因的缺失與回補，將推動佐藥的具體靶點（如外排泵、氧化應激和代謝途徑）得以揭示，令新的佐藥篩選更具針對性；而對逆轉作用的量效關系研究，將使得聯合用藥方案或其復方制劑中佐藥用量的確定有科學的理論依據?？梢灶A見，一批新的逆轉COL耐藥性的高效佐藥將陸續篩選發現，逆轉耐藥性的研究理論將不斷的豐富、深化和完善。