細菌耐藥：生化機制與應(yīng)對策略

劉成程 胡小芳 馮友軍

（1. 西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，西安 710061；2. 南昌大學(xué)撫州醫(yī)學(xué)院，撫州 344000；3. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，杭州 310058）

抗生素作為20世紀(jì)最重要的醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)之一，拯救了無數(shù)人的生命，為人類傳染病的防治做出了重要貢獻。然而抗生素在臨床、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)的過度使用和濫用，以及抗生素誘導(dǎo)廣譜殺傷的內(nèi)在能力導(dǎo)致多重耐藥（multidrug-resistant，MDR）細菌的出現(xiàn)。這些細菌在世界范圍內(nèi)迅速蔓延，已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

抗生素過度使用和濫用是導(dǎo)致抗生素耐藥（antimicrobial resistance，AMR）的根本原因。鑒于嚴(yán)峻的AMR趨勢，2017年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）發(fā)布了最具耐藥性、對人類健康最具威脅的12種“超級細菌”，其中耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌及腸桿菌科細菌被列為嚴(yán)重耐藥性［1］。據(jù)統(tǒng)計，2019年耐藥細菌直接造成全世界127萬人的死亡，多達495萬人的死亡與耐藥細菌感染有關(guān)，耐藥性已成為人類第三大死亡原因［2］。隨著AMR的進一步發(fā)展，MDR細菌導(dǎo)致的死亡人數(shù)還會持續(xù)增加，如果這一問題無法妥善解決，至2050年死亡人數(shù)預(yù)計高達 1 000 萬［3］。

根據(jù)我國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（China Antimicrobial Resistance Surveillance System，CARSS）數(shù)據(jù)顯示，2020年耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的分離率達29.4%；大腸埃希菌對三代頭孢菌素的全國平均耐藥率為51.6%，對喹諾酮類抗生素的全國平均耐藥率為50.7%；肺炎克雷伯菌對三代頭孢菌素的全國平均耐藥率為31.1%，對碳青霉烯類抗生素的全國平均耐藥率為10.9%；肺炎鏈球菌對紅霉素、克林霉素的全國平均耐藥率高達90%以上；而鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的全國平均耐藥率分別為53.7%和18.3%［4］。

AMR對社會經(jīng)濟的負面影響難以估量。據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心估計，美國每年因耐藥造成的經(jīng)濟損失高達550億美元［5］。AMR已成為21世紀(jì)嚴(yán)重危害人群公共健康、影響人類經(jīng)濟生活的重大問題［6］。新型抗生素的研發(fā)速度遠趕不上細菌對其產(chǎn)生耐藥性的速度，投入大量人力和物力不斷地研發(fā)新型抗生素已無法徹底解決日益嚴(yán)重的細菌耐藥問題。因此，必須深入研究AMR的具體機制，同時積極探索應(yīng)對AMR的新型防控策略。本文就AMR的生化機制及其防控策略進行總結(jié)和歸納，旨在為解決細菌耐藥性問題的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 細菌耐藥的機制

抗生素的殺菌機制如表1所示，主要包括：（1）抑制細菌細胞壁的合成；（2）改變細菌細胞膜的通透性；（3）抑制細菌蛋白質(zhì)的合成；（4）抑制細菌核酸的合成；（5）抑制細菌的代謝途徑。細菌耐藥的類型和機制復(fù)雜，主要分為4類：（1）藥物滲透障礙；（2）藥物作用靶位改變；（3）藥物失活；（4）主動外排（如圖1和表2所示）［7］。其中由于革蘭氏陰性菌外膜中含有脂多糖，革蘭氏陰性菌適用上述4種機制，而革蘭氏陽性菌不適用藥物滲透障礙（外膜中沒有脂多糖）和藥物外排機制［6］。

表1 抗生素的殺菌作用機制Table 1 Action mechanisms of antibiotics

表2 細菌耐藥的類型和機制Table 2 Types and mechanisms of antimicrobial resistance

圖1 細菌耐藥機制Fig. 1 Mechanisms of antimicrobial resistance

1.1 藥物滲透障礙

革蘭氏陰性菌外膜中含有脂多糖形成的滲透性屏障，因此對某些抗生素的滲透性本質(zhì)上低于革蘭氏陽性菌。糖肽類抗生素，如萬古霉素?zé)o法穿透外膜而對革蘭氏陰性菌無效，證明了這種天然屏障的有效性。另外，不少抗生素必須穿透細菌外膜和細胞質(zhì)膜作用其靶位才能發(fā)揮抗菌作用，細菌通過降低攝取來阻止抗生素分子抵達其胞內(nèi)或胞漿周質(zhì)的作用靶位導(dǎo)致耐藥［8］。

1.1.1 外膜孔蛋白改變 外膜孔蛋白（outer membrane protein，Omp）是抗生素進入細菌體內(nèi)發(fā)揮作用的主要通道，外膜孔蛋白量的減少或孔徑減少及細胞壁增厚等均會降低外膜的通透性，使藥物不易進入細菌抵達靶部位。既往研究認為細菌通過兩種孔蛋白的改變來限制抗生素的攝取：（1）孔蛋白的缺失或嚴(yán)重減少；（2）突變致使孔蛋白選擇性或功能的改變［9］。不同細菌通過不同的孔蛋白改變來發(fā)揮耐藥作用，如肺炎克雷伯菌OmpK35、OmpK36、LamB和PhoE的缺失，OmpK36的突變導(dǎo)致其對碳青霉烯類抗生素耐藥［10］；耐碳青霉烯類抗生素的大腸埃希菌表現(xiàn)為OmpC和OmpF缺失，OmpC突變［11］，OmpF缺失會導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺類抗生素、四環(huán)素類抗生素、喹諾酮類抗生素和氯霉素等藥物的多重耐藥；銅綠假單胞菌編碼OprD2基因可發(fā)生多點突變、缺失突變和插入突變導(dǎo)致OprD2發(fā)生結(jié)構(gòu)變化或缺失，使抗生素不能通過其細胞外膜，顯著降低其對碳青霉烯類抗生素的敏感性［12］。

1.1.2 生物被膜 細菌在定植中，另一種降低抗生素攝取的機制是形成生物被膜（biofilm）。生物被膜是附著于物體表面被細菌胞外大分子包覆的有組織的細菌群體。其基質(zhì)含有胞外多糖、蛋白質(zhì)和細胞外DNA［13］，能夠削弱抗生素的滲透，同時為抵抗宿主免疫細胞的吞噬提供屏障［14］。研究表明，生物被膜對抗生素具有很強的抗性，生物被膜狀態(tài)下的細菌可耐受的MIC濃度比浮游狀態(tài)的細菌高1 000-2 000倍［15］。生物被膜的主要耐藥機制包括：（1）降低抗生素在生物被膜中的滲透作用；（2）降低細菌自身新陳代謝和生長速率抵御抗生素的殺傷作用；（3）通過壓力應(yīng)答使生物被膜發(fā)生生理學(xué)改變，防止菌體受到抗生素的破壞作用等［16］。

1.2 作用靶位突變

細菌通過改變抗生素作用靶位的結(jié)構(gòu)來降低抗生素與靶位的親和力，引起耐藥性。靶位改變通常是由染色體上細菌基因的自發(fā)突變引起的，由于抗生素與靶分子的相互作用通常具有相當(dāng)?shù)奶禺愋裕虼税蟹肿拥奈⑿「淖兛蓪股亟Y(jié)合產(chǎn)生重要影響［7］。靶位突變的經(jīng)典機制是喹諾酮耐藥決定區(qū)（quinolone resistance-determining regions，QRDR）突變。QRDR位于大腸埃希氏菌編碼DNA促旋酶GyrA基因的67-106位氨基酸，GyrB基因的426-447位氨基酸之間；編碼DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅳ ParC基因的63-102位氨基酸，ParE基因的420-441位氨基酸之間。DNA促旋酶與DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅳ中任何單個氨基酸發(fā)生突變均會削弱酶與喹諾酮類抗生素的相互作用，從而增強耐藥性［17-18］。青霉素結(jié)合蛋白（penicillin-binding proteins，PBPs）是β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶點。細菌通過改變PBPs的結(jié)構(gòu)（如金黃色葡萄球菌獲得mecA基因后表達PBP2a）降低與β-內(nèi)酰胺類抗生素的親合力，從而對其耐藥［19］。紅霉素核糖體甲基化酶基因家族可使16S rRNA甲基化，并改變藥物結(jié)合位點，阻斷鏈球菌素、大環(huán)內(nèi)酯類及林可胺類抗生素的結(jié)合［20］。耐萬古霉素腸球菌（VRE）和金黃色葡萄球菌（VRSA）通過獲得van基因使其肽聚糖末端D-Ala-D-Ala二肽結(jié)構(gòu)變異為D-Ala-D-Lac，致使它們對萬古霉素的親和力降低1 000倍［21］。針對核糖體亞基抗生素耐藥的產(chǎn)生可能與核糖體突變、erm基因參與的核糖體亞基甲基化以及核糖體保護有關(guān)，這些機制干擾了抗生素與核糖體的結(jié)合能力［7］。

多黏菌素（polymyxins）是一類包括5種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)（A-E）的陽離子環(huán)狀多肽類抗生素，是常用于治療產(chǎn)碳青霉烯酶等MDR菌株的最后一道防線之一。其作用機制是與革蘭氏陰性菌外膜帶負電脂多糖上的脂質(zhì)A相互作用，取代細胞膜賴以穩(wěn)定的Mg2+和Ca2+，引起細胞膜結(jié)構(gòu)紊亂，細胞膜滲透性發(fā)生改變，細胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，最終使細菌裂解死亡。細菌對多黏菌素耐藥的主要機制是二元調(diào)控系統(tǒng)pmrAB和phoPQ基因突變、mgrB基因的完全缺失以及CrrB蛋白中的氨基酸替換上調(diào)了pmrC、pmrE和pmrHFIJKLM基因表達，使其編碼的脂多糖修飾酶量增加，促進脂多糖修飾結(jié)合陽離子磷酸乙醇胺和4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖，從而產(chǎn)生耐藥性［22］。另外，肺炎克雷伯菌莢膜多糖的過量生成使多黏菌素?zé)o法到達細菌外膜上的作用靶點［23］。銅綠假單胞菌還存在2個可能增加脂多糖中陽離子4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖表達的系統(tǒng)（ColRS和CprRS），可使外膜蛋白OprH過度表達，占據(jù)多黏菌素與脂多糖的結(jié)合位點［22］。鮑曼不動桿菌通過插入ISAba11和ISAba125等序列導(dǎo)致編碼脂多糖的lpxA、lpxC和lpxD基因不表達，失去脂多糖的細菌無法與多黏菌素結(jié)合從而對多黏菌素耐藥［24］。

2015年以前多黏菌素耐藥被認為是染色體基因改變所致，而非質(zhì)粒傳播。同年11月我國研究人員發(fā)現(xiàn)了一個多黏菌素耐藥的新基因mcr-1，其編碼的內(nèi)膜蛋白磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶MCR能固定于細胞內(nèi)膜并改變細胞膜構(gòu)象，對脂質(zhì)A基團進行化學(xué)修飾，包括對脂質(zhì)A進行L-氨基-阿拉伯糖修飾以及將磷酸乙醇胺結(jié)合到脂質(zhì)A的1-4’-磷酸基團上，使得細菌表面所帶負電荷減少，削弱了多黏菌素和脂多糖之間的相互作用，導(dǎo)致多黏菌素耐藥的產(chǎn)生（圖2）［25-29］。由于mcr基因有較強的傳播性以及能與不同耐藥基因整合在同一個質(zhì)粒上，因此mcr基因的報道越來越多。截至目前，世界范圍內(nèi)已經(jīng)報道了mcr-1-mcr-10及其亞型基因［30］。在歐洲分離出的肺炎克雷伯菌中mcr-9基因檢出率很高，同時伴有碳青霉烯酶基因，提示mcr基因可能已在歐洲人類來源的肺炎克雷伯菌分離株中廣泛傳播［31］。

圖2 MCR催化細菌脂質(zhì)A的磷酸乙醇胺修飾（改自文獻［26］）Fig. 2 Phosphoethanolamine modification to lipid A catalyzed by MCR（Modified based on the reference［26］）

1.3 藥物失活

抗生素失活是細菌的最主要耐藥機制。細菌主要通過兩種方式使抗生素失去活性。（1）產(chǎn)生蛋白酶降解抗生素。目前細菌產(chǎn)生的滅活酶或鈍化酶主要有β-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷鈍化酶和大環(huán)內(nèi)酯酶-林克霉素類-鏈陽菌素類抗菌藥物鈍化酶。大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等通過產(chǎn)生一種核黃素依賴單加氧酶Tet（X）使替加環(huán)素降解失活［32-33］。而微桿菌屬細菌能夠產(chǎn)生磺胺單加氧酶（SadA）及黃素還原酶（SadC）導(dǎo)致磺胺類抗生素發(fā)生ipso-羥基化及裂解［34］。腸桿菌科細菌通過產(chǎn)生糖苷酶、酯酶及磷酸化酶有效破壞大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的結(jié)構(gòu)［35］。在細菌耐藥機制中，對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因之一是產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。β-內(nèi)酰胺酶通過水解這類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)（圖3），抑制其與PBPs的結(jié)合而產(chǎn)生耐藥。目前已發(fā)現(xiàn)近5 000種β-內(nèi)酰胺酶，根據(jù)分子生物學(xué)分類法（Ambler分類法）可分為A、B、C、D四類，根據(jù)功能分類法（Bush分類法）可分為1類、2類和3類（表3）［36］。近年來產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）的耐藥細菌對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。ESBL是一種主要由腸桿菌科細菌產(chǎn)生，質(zhì)粒編碼合成的絲氨酸蛋白酶。常見的ESBL包括TEM、SHV、OXA、CTX-M等。另外，腸桿菌科細菌中還存在對碳青霉烯類抗生素具有活性的碳青霉烯酶。目前存在兩種碳青霉烯酶：① 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPCs），為A類絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶，能水解所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素，也能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑影響［37］；② 碳青霉烯耐藥腸桿菌科酶（CREs），為B類金屬β-內(nèi)酰胺酶，能水解所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素，但不能被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制。常見的CREs包括IMP-1和VIM-1，由產(chǎn)CREs菌株導(dǎo)致的醫(yī)院內(nèi)感染的死亡率達到70%以上［38-39］。在2010年印度多個城市發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（NDM）的多重耐藥細菌更是引起世界范圍的恐慌［40］。

表3 主要β-內(nèi)酰胺酶及分類Table 3 β-lactamases and their classification

圖3 β-內(nèi)酰胺酶水解β-內(nèi)酰胺類抗生素Fig. 3 Hydrolysis of β-lactams by β-lactamase

（2）添加或取代活性基團使抗生素失活。細菌通過產(chǎn)生能將多種活性基團（如乙?；⒘柞；拖佘栈┻B接到抗生素上的酶，阻止抗生素與作用靶位結(jié)合，如氨基糖苷類修飾酶（磷酸/乙酰/核苷酸轉(zhuǎn)移酶）通過共價結(jié)合改變了氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)上的氨基或羥基，導(dǎo)致其不能與作用靶位結(jié)合產(chǎn)生耐藥性［6］；氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）催化乙酰輔酶A（CoA）依賴位于C-3位的羥基乙酰化，導(dǎo)致氯霉素修飾生成1-乙酰氯霉素，使其不能與細菌核糖體結(jié)合而耐藥。

1.4 主動外排

主動外排系統(tǒng)的過量表達是細菌具有多重耐藥性的重要原因之一。細菌利用通用或特異的外排系統(tǒng)將胞內(nèi)的抗生素排出胞外，降低胞內(nèi)抗生素濃度而產(chǎn)生耐藥性。主動外排系統(tǒng)由外排蛋白、融合蛋白和外膜通道蛋白三部分構(gòu)成。根據(jù)結(jié)構(gòu)和能量供應(yīng)進行分類，細菌的外排系統(tǒng)包括ATP結(jié)合盒（ABC）家族、主要易化子超家族（MFS）、小多藥耐藥（SMR）家族、耐藥結(jié)節(jié)化細胞分化（RND）家族和多藥及毒性化合物外排（MATE）家族（圖4）［7］。其中RND家族是多組分泵，能與細胞周質(zhì)膜融合蛋白和外膜蛋白協(xié)同將底物外排至細胞膜和細胞質(zhì)外，其他外排系統(tǒng)均為單泵，穿過細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運底物。四環(huán)素耐藥是外排泵介導(dǎo)耐藥的典型示例，銅綠假單胞菌的MexAB-OprM和腸桿菌科細菌的AcrAB-TolC能排出四環(huán)素［41］。鮑曼不動桿菌中AdeABC外排系統(tǒng)的高水平表達與美羅培南耐藥密切相關(guān)［42］。

圖4 外排泵家族的基本結(jié)構(gòu)（改自文獻［7］）Fig. 4 General structure of efflux pump families（Modified based on the reference［7］）

2 細菌耐藥性防控新策略

2.1 抗菌肽療法

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是一類具有抑制或殺滅病原微生物的小分子多肽或小分子蛋白的總稱，常含有10-50個氨基酸，相對分子量約為4 000 Da，帶正電荷并具有較好的水溶性?？咕母鶕?jù)其結(jié)構(gòu)特征可分為α-螺旋型抗菌肽、β-片狀抗菌肽、具有β發(fā)夾或環(huán)的抗菌肽、無規(guī)則卷曲的抗菌肽、線性結(jié)構(gòu)抗菌肽、雜合抗菌肽等?？咕牡目咕鷻C制主要包括以下幾個方面：（1）引起細胞壁損傷，抗菌肽通過與細胞壁合成前體分子結(jié)合、或干擾肽聚糖合成、或與肽聚糖結(jié)合等方式造成細菌細胞壁損傷，如Teixobactin與肽聚糖前體Lipid II和坦酸前體Lipid III結(jié)合抑制細菌細胞壁合成［43］；（2）引起細胞膜損傷，抗菌肽與革蘭氏陰性菌細胞外膜脂多糖結(jié)合形成跨膜通道破壞細胞膜完整性，與革蘭氏陽性菌表面坦酸結(jié)合并附著于細菌表面，通過兩親性結(jié)構(gòu)自聚形成構(gòu)象簇穿過細胞膜并造成其受損，如帶正電荷的抗菌肽LL-37與帶負電荷的細菌結(jié)合，插入細菌細胞膜導(dǎo)致其內(nèi)容物流出而死亡［44］；（3）影響生物大分子合成及代謝關(guān)鍵酶活性，如抗菌肽P7通過抑制DNA復(fù)制和RNA合成引起大腸埃希菌的死亡［45］；（4）引起免疫調(diào)節(jié)抑菌機制，抗菌肽在亞治療劑量下可作為免疫效應(yīng)分子調(diào)動并激活機體免疫細胞抑制或消除炎癥，如LL-37可直接上調(diào)單核細胞趨化蛋白-1和IL-8的表達，誘導(dǎo)單核細胞產(chǎn)生大量IL-1β，間接誘導(dǎo)白細胞介素和單核細胞趨化蛋白質(zhì)表達，或上調(diào)趨化因子受體CXCR-4、CCR2和IL-8RB表達，招募免疫細胞抵達感染部位［44］。抗菌肽抗菌作用機制獨特，可單獨或與抗生素聯(lián)用，對革蘭氏陽性和陰性多重耐藥細菌具有廣譜抗菌活性，是一類極具潛力的抗菌藥物。目前全球范圍內(nèi)進入臨床試驗的抗菌肽不到50種，已上市的抗菌肽藥物有阿尼芬凈（anidulafungin）、桿菌肽（bacitracin）、卡泊芬凈（caspofungin）、達托霉素（daptommycin）等?？咕谋仨毧朔恍┤秉c（包括穩(wěn)定性差、易被蛋白酶水解、生理條件下活性低及生產(chǎn)成本高等）后才能進入市場，對抗菌肽的結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化來提高其生物活性、延長半衰期、降低細胞毒性等已成為當(dāng)前抗菌肽領(lǐng)域的研究熱點。

2.2 免疫療法

基于主動免疫和被動免疫的疫苗和抗體的產(chǎn)生為預(yù)防和治療多重耐藥菌的感染提供了新思路。免疫療法有助于打破抗生素耐藥-新抗生素研發(fā)-新抗生素耐藥的死循環(huán)，從根本上解決耐藥細菌感染及耐藥菌株流行的問題［46］。目前所研究的耐藥細菌疫苗主要包括全菌滅活或減毒疫苗、外膜囊泡、重組DNA或蛋白亞單位疫苗、莢膜多糖疫苗。我國自主研發(fā)的耐藥細菌疫苗重組金黃色葡萄球菌疫苗已獲國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)III期臨床研究，該疫苗是我國首個自主研發(fā)的耐藥細菌疫苗，其免疫攻毒保護率顯著高于國際同類疫苗。德國Behringwerke公司和韓國Cheil Jedang公司開發(fā)的多個銅綠假單胞菌多糖蛋白結(jié)合疫苗也先后開展了人體臨床研究，結(jié)果顯示疫苗在健康志愿者中具有良好的安全性和較強的免疫原性，并能有效預(yù)防燒傷患者發(fā)生銅綠假單胞菌性菌血癥［47］。另一種應(yīng)對耐藥細菌的策略是利用單克隆抗體，其主要作用是中和毒力因子的活性和抑制補體介導(dǎo)的細菌裂解。目前大約有10余種單克隆抗體處于臨床試驗階段，有3種抗菌單克隆抗體藥物已被批準(zhǔn)上市，如Raxibacumab和Obiltoxaximab被批準(zhǔn)用于預(yù)防和治療吸入性炭疽。

2.3 噬菌體療法

噬菌體是一類能夠特異寄生在細菌、放線菌、真菌等微生物內(nèi)的DNA或RNA病毒，根據(jù)對宿主菌的作用方式不同可分為烈性噬菌體（溶菌型噬菌體）和溫和噬菌體（溶原型噬菌體）。烈性噬菌體與細菌表面特定受體結(jié)合并將其遺傳物質(zhì)注入宿主內(nèi)進行復(fù)制，子代噬菌體在細胞溶解酶和穿孔蛋白的作用下裂解細菌后導(dǎo)致感染終止，并釋放到周邊環(huán)境中繼續(xù)重復(fù)殺傷過程［48］。噬菌體治療的優(yōu)勢在于研發(fā)周期短、成本低且特異性感染宿主菌。特異性使噬菌體在治療過程中對患者正常菌群沒有影響，無抗菌藥物的毒副作用。噬菌體的抗菌機制獨特，能自我復(fù)制并增強抗菌療效，對于耐藥細菌感染或抗生素治療無效的患者具有天然的優(yōu)勢。但單一噬菌體抗菌譜窄，能引起機體免疫應(yīng)答不足等，目前主要采取噬菌體雞尾酒療法、抗生素與噬菌體聯(lián)用、噬菌體裂解酶與抗菌制劑聯(lián)用等方法來提高療效［49］。2020 年 Tkhilaishvili團隊［50］報道了一例多重耐藥銅綠假單胞菌引起的假體關(guān)節(jié)周圍感染，在抗生素和手術(shù)治療均失敗的情況下，患者接受噬菌體輔助治療，發(fā)現(xiàn)噬菌體與抗生素聯(lián)用可有效消除感染，在治療第3天的引流液中未分離到銅綠假單胞菌。2021年該團隊［51］再次報道了一例噬菌體與抗生素聯(lián)用成功治療心室輔助裝置感染的案例。在手術(shù)前靜脈施用噬菌體共3次，并局部應(yīng)用噬菌體，手術(shù)清創(chuàng)期間再次遞送噬菌體與抗生素，手術(shù)結(jié)束后并未分離出多重耐藥銅綠假單胞菌。李莉莎等［52］嘗試使用噬菌體霧化吸入治療泛耐藥肺炎克雷伯菌引起的肺部感染，發(fā)現(xiàn)分離株的噬菌體裂解譜發(fā)生了變化，患者臨床癥狀改善。

2.4 抗菌光動力療法

抗菌光動力療法（antimicrobial photodynamic therapy，aPDT）是一種利用無毒的光敏劑（PS）、特定波長的可見或近紅外光以及耐藥細菌周邊或內(nèi)部的分子氧產(chǎn)生光毒性反應(yīng)來殺傷耐藥細菌的治療模式［53］。如圖5所示，PS在特定波長光的照射下從基態(tài)經(jīng)過壽命極短的激發(fā)單重態(tài)，系間竄越到激發(fā)三重態(tài)。三重態(tài)的PS與分子氧通過I型反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2·-）、羥基自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2），或通過II型反應(yīng)產(chǎn)生單線態(tài)氧（1O2）［54］。這些活性氧（ROS）對耐藥細菌的生物大分子和細胞結(jié)構(gòu)造成不可逆轉(zhuǎn)的氧化損傷，導(dǎo)致耐藥細菌的死亡［55］。aPDT對幾乎所有的耐藥細菌都具有良好的殺菌活性［56］，由于ROS非特異性的氧化作用模式，氧化損傷發(fā)生在細菌內(nèi)許多作用靶點（如核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等）和細胞結(jié)構(gòu)，一般認為耐藥細菌不太可能對aPDT產(chǎn)生抗性機制［57］。例如本團隊［58］利用20個重復(fù)周期的亞致死劑量aPDT處理多重耐藥大腸埃希菌后發(fā)現(xiàn)，細菌沒有對aPDT產(chǎn)生抗性，而且對頭孢他啶和多黏菌素E的MIC值分別降低了4倍和2倍。aPDT是一種獨立于抗生素的殺菌模式，對宿主損傷小，多次治療不會誘導(dǎo)耐藥，因此被認為是很有前途的治療細菌感染方法之一，尤其是多重耐藥細菌引起的感染。目前aPDT已被用于部分淺表或局部耐藥細菌感染的治療，但治療深度有限這一問題仍需解決。

圖5 光敏劑的賈布朗斯基圖（改自文獻［54］）Fig. 5 Jablonski diagram of photosensitizer（Modified based on the reference［54］）

2.5 益生菌療法

益生菌（probiotics）是定植于腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)能產(chǎn)生確切健康功效的具有活性的有益微生物的總稱。其合成的活性短肽——細菌素，能抑制部分人體致病菌、調(diào)節(jié)腸道菌群以及幫助益生菌定植［59］。細菌素的抑菌機制有兩種：（1）破壞細菌細胞壁使內(nèi)容物流出，主要針對革蘭氏陽性菌；（2）進入細菌胞內(nèi)抑制基因或蛋白的表達，主要針對革蘭氏陰性菌。細菌素中的羊毛硫肽（lanthipeptides）是目前益生菌抑菌領(lǐng)域研究最深入的一種，乳酸鏈球菌素（nisin）是羊毛硫肽的主要代表［60］。羊毛硫肽除了能抑制一般細菌外，還對部分耐藥細菌具有抑制作用，如MRSA和VRE等。研究表明加氏乳桿菌OLL2716對耐藥幽門螺桿菌在體內(nèi)外的生長及定植均具有明顯的抑制作用［61］。Matthew Chang團隊［62］發(fā)現(xiàn)經(jīng)過基因改造的益生大腸埃希菌Nissle 1917能在動物模型中預(yù)防和消除銅綠假單胞菌引起的腸道感染。目前益生菌抗耐藥細菌的研究尚處于體外試驗階段，未來需要進一步開展體內(nèi)和臨床試驗。

2.6 抗菌納米顆粒技術(shù)

近年來抗菌納米顆粒技術(shù)成為新的對抗耐藥細菌研究熱點。常見的抗菌納米顆粒主要有銀納米顆粒（silver nanoparticles，AgNPs）、金屬氧化物納米顆粒、光熱轉(zhuǎn)換納米顆粒、抗生素共軛納米顆粒等［63］，它們通過破壞細菌細胞膜、與細菌DNA或蛋白質(zhì)相互作用、間接啟動ROS的產(chǎn)生等方式實現(xiàn)抗菌作用。AgNPs是最常見的抗菌納米顆粒，具有廣譜的抗菌活性，其作用機制包括：（1）干預(yù)細菌細胞壁或細胞膜的合成；（2）干擾細菌能量代謝；（3）抑制細菌關(guān)鍵酶的活性；（4）抑制細菌DNA的合成；（5）產(chǎn)生ROS等。納米顆粒的細胞毒性是一個不容忽視的缺點。在抑菌濃度下，AgNPs被證實具有一定的細胞毒性。為了克服這個問題，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)展了羧甲基羅望子多糖、殼聚糖、阿拉伯膠、聚乙烯吡咯烷酮以及二氧化鈦封端的AgNPs，它們在保留抗菌活性的同時能顯著降低細胞毒性［64］。

2.7 反義寡核苷酸和基因編輯技術(shù)

反義寡核苷酸是與細菌mRNA互補的RNA分子，二者特異性結(jié)合后能抑制mRNA的翻譯，從而抑制相關(guān)基因的表達，在基因水平調(diào)控的分子藥物。反義寡核苷酸包括反義DNA和反義RNA，其機制涉及順式和反式序列，順式反義序列一般可以在mRNA附近的調(diào)節(jié)區(qū)域找到，或從同一遺傳位點的互補鏈轉(zhuǎn)錄而來；反式反義序列從較遠的遺傳位點轉(zhuǎn)錄而來。反義寡核苷酸能夠抑制細菌耐藥酶的翻譯、也可用于發(fā)現(xiàn)新的抗菌物質(zhì)、開發(fā)高度敏感的抗菌屏障及作用模式［65-66］。羅曉星團隊［67］利用反義技術(shù)抑制MRSA群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)中關(guān)鍵分子agrA的表達，阻斷其信號通路并降低細菌的致病力，為抗MRSA感染提供了一種新思路。

由于抗生素的大量使用，在動物和人體內(nèi)誘導(dǎo)出抗生素耐藥基因，這些基因進入環(huán)境后，通過橫向轉(zhuǎn)移機制誘導(dǎo)耐藥菌的產(chǎn)生。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/ Cas系統(tǒng)作為一種細菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，被認為是控制耐藥菌株的新策略之一。該系統(tǒng)用于對抗細菌基因組序列的可編程Cas核酸酶，也有望降低細菌對抗生素的耐藥性。根據(jù)效應(yīng)蛋白的數(shù)量，CRISPR / Cas系統(tǒng)可分為I型和II型兩大類，作用機制可分為3個階段：新間隔序列的獲得與整合（適應(yīng)）、cr RNA和Cas蛋白的生成（表達）以及cr RNA引導(dǎo)的核酸靶向切割（干擾）。CRISPR / Cas系統(tǒng)可以區(qū)分致病菌和共生菌，并能選擇性的剔除耐藥基因，或通過消除含有耐藥基因的質(zhì)粒使細菌重新對抗生素敏感［65］。在所有Cas蛋白中，針對耐藥細菌最有前景的為CRISPR-Cas9、dCas9、nSpCas9 和 Cas13a。Kim 等［68］利用 CRISPR /Cas9 系統(tǒng)靶向大腸埃希菌中的抗生素耐藥基因，成功清除了產(chǎn)ESBL大腸埃希菌內(nèi)的抗生素耐藥質(zhì)粒。Citorik 等［69］和 Bikard 等［70］分別以大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌內(nèi)的抗生素耐藥質(zhì)粒為靶標(biāo)，利用噬菌體為載體傳遞CRISPR / Cas9系統(tǒng)，最終細菌中的抗生素耐藥質(zhì)粒被成功清除，耐藥菌對抗生素的敏感性得到恢復(fù)。目前，亟需開展體內(nèi)研究來解決該系統(tǒng)存在的不足，包括如何通過噬菌體、質(zhì)粒以及納米顆粒將CRISPR-Cas系統(tǒng)高效輸送至細菌體內(nèi)的遞送問題，以及宿主基因組中潛在脫靶修飾的副作用等［71］。

2.8 其他新策略

應(yīng)對AMR的其他新策略包括宿主導(dǎo)向療法（host-directed therapy，HDT）、毒力因子（virulence factors，VF）抑制劑、QS抑制劑、納米酶等。細胞內(nèi)的病原菌能夠與宿主共同進化，操縱宿主因子繼而維持病原菌的生存。在這種情況下，HDT可能是一種很有前景的抗生素替代療法，它能靶向宿主因子并消除細胞內(nèi)病原菌的復(fù)制，同時引起宿主針對病原菌的免疫反應(yīng)，并通過增強病理部位的愈合來減少慢性炎癥。HDT靶向病原菌生命周期并有助于根除病原菌，這一特性契合了耐藥細菌感染的治療［72-73］。VF抑制劑是近年來的研究熱點之一，由于它并不直接抑制細菌的生長，因此大大降低了耐藥細菌出現(xiàn)的概率，同時也降低了菌株的致病力［74］。許多細菌的行為受到QS的調(diào)節(jié)，QS依賴細菌之間可擴散的信號分子進行通信，能夠調(diào)節(jié)細菌代謝、毒力和生物被膜形成等生理過程。群體淬滅是通過化學(xué)或酶的手段抑制QS，對抗QS調(diào)節(jié)從而達到抗菌效果。QS抑制劑是目前研究最多的一類物質(zhì)，它能抑制QS調(diào)控的功能達到抗菌目的［75］。目前已發(fā)現(xiàn)了幾種QS抑制劑，包括假單胞菌喹諾酮信號通路阻滯劑、丁子香酚、阿司匹林、布洛芬及吲哚美酰亞胺等［76］。納米酶是新一代人工模擬酶，包括過氧化物酶、氧化酶、鹵代過氧化物酶和脫氧核糖核酸酶等，它兼具納米材料獨特的理化性質(zhì)和類酶催化活性，相較于天然抗菌酶（溶菌酶、髓過氧化物酶等）具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、抗菌譜廣、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點［77］。近年來新型抗菌策略層出不窮，未來將被更加深入地研究及進一步轉(zhuǎn)化。

3 總結(jié)與展望

抗生素的發(fā)現(xiàn)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)史上的里程碑，使人類告別無法控制細菌感染的“黑暗時代”。但抗生素的過度使用和濫用已導(dǎo)致細菌耐藥率持續(xù)升高，耐藥程度愈發(fā)嚴(yán)重，多重耐藥甚至全耐藥菌株普遍出現(xiàn)。目前，多重耐藥細菌引起的感染已成為臨床亟待解決的醫(yī)學(xué)難題，使用單一抗生素已無法達到預(yù)期治療效果。而新型抗生素的研發(fā)速度遠落后于細菌耐藥的發(fā)展速度，投入大量人力、物力研發(fā)抗生素又會陷入抗生素耐藥-新抗生素研發(fā)-新抗生素耐藥的死循環(huán)，人類正在邁入“后抗生素時代”。為了應(yīng)對日益嚴(yán)重的細菌耐藥性問題，在加強耐藥細菌監(jiān)測力度、減少抗生素使用的同時，亟需深入開展細菌耐藥生化機制的研究?，F(xiàn)有的研究表明，細菌耐藥生化機制具有復(fù)雜性和多樣性，包括：外膜孔蛋白量減少或孔徑減少、形成生物被膜減少抗生素攝取的藥物滲透障礙機制；通過改變抗生素作用靶位的結(jié)構(gòu)來降低抗生素與靶位親和力的作用靶位突變機制；產(chǎn)生水解酶、添加或取代活性基團使抗生素失活的藥物失活機制；以及利用外排系統(tǒng)將胞內(nèi)抗生素排出胞外、降低胞內(nèi)抗生素濃度的藥物外排機制。此外，仍需積極探索和發(fā)展細菌耐藥性防控新策略或新方法。盡管抗菌肽療法、免疫療法、噬菌體療法、抗菌光動力療法、益生菌療法、抗菌納米顆粒技術(shù)、反義寡核苷酸和基因編輯技術(shù)、宿主導(dǎo)向療法等在防控耐藥細菌方面顯現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，其中一些方法或技術(shù)已用于耐藥細菌感染的治療，但仍存在不少的問題需要深入研究和探索。相信在不久的將來，細菌耐藥這一醫(yī)學(xué)難題一定能夠得到妥善地解決。