12個(gè)竹種的45S rDNA和5S rDNA分布特性比較*

徐川梅 王子晗 謝 峰 金旭胤 吳心妍 陳 榮 黃堅(jiān)欽

(浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 311300)

竹類植物屬于禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)(張穎等， 2021)，種類繁多，全世界約有1 500個(gè)種，可分為溫帶木本竹種、新熱帶木本竹種、古熱帶木本竹種和草本竹種4種類型，其中溫帶和新熱帶木本竹種染色體數(shù)目為2n=46～48，新熱帶木本竹種染色體數(shù)目為2n=70～72，草本竹種染色體數(shù)目為2n=22～24(Guoetal.， 2019)。目前，竹類植物相關(guān)研究主要集中在栽培生理及分子生物學(xué)等領(lǐng)域，特別是相關(guān)的分子生物學(xué)研究取得了一定突破，毛竹(Phyllostachysedulis)、莪莉竹(Olyralatifolia)、Raddiaguianensis、瓜多竹(Guaduaangustifolia)和蕓香竹Boniaamplexicaulis等5個(gè)竹種全基因組測(cè)序工作已完成(Pengetal.， 2013； Zhaoetal.， 2018； Guoetal.， 2019)；但竹類植物相關(guān)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究進(jìn)展十分緩慢，僅有45S rDNA在毛竹、斑竹(Phyllostachysreticulata‘Lacrima-deae’)、龜甲竹(Phyllostachysedulis‘Heterocycla’)、茶稈竹(Pseudoasaamabilisvar.amabilis)、菲白竹(Sasafortunei)、日本矮竹(Sasapygmea)、鋪地竹(Sasaargenteastriatus)和白綠竹(Bambusaoldhamii)等竹種染色體上的分布特點(diǎn)報(bào)道，大部分竹種的細(xì)胞遺傳學(xué)研究工作還停留在染色體計(jì)數(shù)或傳統(tǒng)的核型分析等初級(jí)細(xì)胞遺傳學(xué)研究水平(李秀蘭等， 1999； 2001； 陳瑞陽(yáng)等， 2003； 徐川梅等， 2009a； 2009b； 賈芳信等， 2016； Zhouetal.， 2017)，這些研究?jī)H能夠揭示竹類植物染色體數(shù)目和形態(tài)大小等信息，并不能對(duì)一些竹種的染色體結(jié)構(gòu)及核型等進(jìn)行精細(xì)分析。

核糖體RNA(rDNA)基因廣泛存在于植物基因組中，主要包括45S rDNA和5S rDNA 2種類型，其中45S rDNA主要由串聯(lián)重復(fù)序列18S、5.8S和28S rRNA基因和非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)組成，重復(fù)單元長(zhǎng)度約10 kb，主要負(fù)責(zé)形成核仁組織區(qū)(Osujietal.， 1998； Katsiotisetal.， 2000； Heslop-Harrison, 2000)。5S rDNA也是串聯(lián)重復(fù)序列，主要包括一個(gè)長(zhǎng)約120 bp的編碼區(qū)和一個(gè)非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Zhangetal.， 2016)。由于45S rDNA和5S rDNA在植物進(jìn)化過程中高度保守，很多植物染色體上均可產(chǎn)生清晰的熒光信號(hào)，可為染色體相關(guān)研究提供一些重要參考信息，這使其成為一個(gè)非常好的染色體物理標(biāo)記，在一些植物倍性鑒定、染色體結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)分類和起源進(jìn)化等研究中發(fā)揮了重要作用(Luoetal.， 2019； Zhangetal.， 2016)。

植物基因組中的rDNA區(qū)域是遺傳重組的熱點(diǎn)區(qū)域，同源染色體間不等交換或重組，往往會(huì)導(dǎo)致rDNA拷貝數(shù)產(chǎn)生一定差異或者擴(kuò)增出新的rDNA序列(Tsangetal.， 2008)。此外，rDNA重復(fù)序列內(nèi)部及鄰近區(qū)域也是轉(zhuǎn)座子高頻插入?yún)^(qū)域，在物種形成和分化過程中，轉(zhuǎn)座子插入或刪除進(jìn)一步促進(jìn)了rDNA位點(diǎn)的進(jìn)化，使物種核型不斷變化，進(jìn)而產(chǎn)生一定的遺傳分化(Pedrosa-Harandetal.， 2006； Raskinaetal.， 2008)。因此了解不同物種的rDNA位點(diǎn)數(shù)及其在染色體上的分布特征，可為植物比較基因組學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)等研究提供重要參考信息。由于rDNA主要是一些串聯(lián)重復(fù)序列，可利用熒光原位雜技術(shù)將這些rDNA在染色體上的分布位置進(jìn)行可視化，且熒光信號(hào)強(qiáng)弱與rDNA拷貝數(shù)呈一定的正相關(guān)，因此，本研究選擇毛竹、花毛竹(Phyllostachysedulis‘Tao kiang’)、龜甲竹、金鑲玉竹(Phyllostachysaureosulcata‘Spectabilis’)、白哺雞竹(Phyllostachysdulcis)、紫竹(Phyllostachysnigra)、斑竹、黃稈烏哺雞竹(Phyllostachysvivaxf.aureocaulis)、早竹(Phyllostachysviolascens)、人面竹(Phyllostachysaurea)、大明竹(Pleioblastusgramineus)和茶稈竹(Pseudoasaamabilis)等12個(gè)竹種，首次利用雙色熒光原位雜交技術(shù)分析45S rDNA和5S rDNA在這些竹種染色體上的分布，以期為竹類植物系統(tǒng)分類及染色體結(jié)構(gòu)等研究提供相應(yīng)的分子細(xì)胞遺傳學(xué)資料，為相關(guān)的染色體識(shí)別提供相應(yīng)的染色體物理標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

12個(gè)竹種均采自浙江農(nóng)林大學(xué)翠竹園，3—6月，挖取新竹或新筍，采集新竹或新筍的嫩根為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 采集根尖利用0.002 mol·L-18-羥基喹啉與秋水仙素混合液室溫下處理4 h，之后利用固定液(甲醇∶乙酸= 3∶1,V/V)固定，固定后的根尖置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 染色體標(biāo)本制備及制片預(yù)處理 染色體標(biāo)本制備參照陳瑞陽(yáng)等(2003)方法略進(jìn)行改進(jìn)，利用2.5%纖維素酶和果膠酶混合液37 ℃酶解根尖2～2.5 h，制備成細(xì)胞懸浮液，后進(jìn)行染色體滴片。利用相差顯微(Olympus BX51)對(duì)染色體制片進(jìn)行觀察和篩選，選取分散較開、形態(tài)較好的中期染色體制片。利用10 mg·mL-1的RNase A 37 ℃處理制片60 min，然后用4%(質(zhì)量百分比)的胃蛋白酶溶液37 ℃處理10 min，再用4%(質(zhì)量百分比)多聚甲醛室溫固定10 min，最后用70%、90%及100%酒精對(duì)制片進(jìn)行梯度脫水，每級(jí)5 min，處理后的制片用于后續(xù)熒光原位雜交試驗(yàn)。

1.2.3 熒光原位雜交與信號(hào)檢測(cè) 熒光原位雜交參照J(rèn)iang等(1995) 方法，45S rDNA和5S rDNA序列分別來(lái)源于小麥(Triticumaestivum)的pTa71和日本蓮花(Lotusjaponicas)(Pedrosaetal.， 2002)。分別利用生物素(Roche，11745824910)和地高辛(Roche，11745816910)采用切刻平移法對(duì)45S rDNA和5S rDNA的質(zhì)粒DNA進(jìn)行標(biāo)記，雜交信號(hào)經(jīng)抗地高辛抗體Anti-digoxigenin-rhodamine(Roche，11207750910)和抗生物素抗體Avidin-fluorescein(Roche，11975595910)檢測(cè)，用DAPI(4′,6-diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride)對(duì)染色體進(jìn)行套染，利用熒光顯微鏡(ZEISS，AX10)100倍油鏡對(duì)熒光原位雜交結(jié)果進(jìn)行觀察和拍照，每個(gè)材料選取20個(gè)良好的分裂相進(jìn)行觀察和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 45S rDNA和5S rDNA在毛竹、花毛竹、龜甲竹及早竹染色體上的分布

毛竹、花毛竹、龜甲竹及早竹在系統(tǒng)分類上均屬于剛竹屬，染色體數(shù)目均為2n=48。毛竹具有1對(duì)45S rDNA信號(hào)，分布于1對(duì)同源染色體末端，5S rDNA在毛竹染色體上有2對(duì)強(qiáng)弱不同的熒光信號(hào)，其中較強(qiáng)的1對(duì)信號(hào)位于1對(duì)同源染色體末端，另1對(duì)信號(hào)非常微弱，位于另1對(duì)同源染色體的近中間區(qū)域，如白色箭頭所示(圖1A，表2)，雙色FISH檢測(cè)結(jié)果顯示45S rDNA和5S rDNA位于毛竹的不同染色體上，在分布位置上沒有任何重疊。花毛竹也具有1對(duì)45S rDNA位點(diǎn)，位于1對(duì)同源染色體末端，且這對(duì)45S rDNA位點(diǎn)信號(hào)較強(qiáng)(圖1B，表1)，5S rDNA在花毛竹染色體上也存在2對(duì)強(qiáng)弱不同的熒光信號(hào)，其中較強(qiáng)的1對(duì)信號(hào)位于1對(duì)同源染色體末端，而另1對(duì)信號(hào)非常微弱，幾乎觀察不到，位于另1對(duì)同源染色體的近中間區(qū)域，如白色箭頭所示(圖1B，表1)，45S rDNA和5S rDNA在花毛竹染色體上也沒有任何重疊分布(圖1B )。45S rDNA和5S rDNA在龜甲竹上的分布模式與花毛竹相似，1對(duì)較強(qiáng)的45S rDNA信號(hào)分布于1對(duì)同源染色體的近端部(圖1C，表1)，其5S rDNA信號(hào)也是2對(duì)，其中較強(qiáng)的1對(duì)信號(hào)位于1對(duì)同源染色體末端，另外1對(duì)微弱的熒光信號(hào)位于另1對(duì)同源染色體近中間區(qū)域，如白色箭頭所示(圖1C，表2)，45S rDNA和5S rDNA在龜甲竹染色體上也沒有任何重疊分布(圖1C)。早竹45S rDNA的分布模式與毛竹相似，具有1對(duì)末端45S rDNA信號(hào)，與毛竹、花毛竹及龜甲竹的5S rDNA分布模式不同，早竹具有2對(duì)較強(qiáng)的5S rDNA信號(hào)，且2對(duì)信號(hào)均位于2對(duì)不同的同源染色體的近中間區(qū)域(圖1D，表1)，45S rDNA和5S rDNA在早竹染色體上也沒有重疊分布(圖1D)。

表1 12個(gè)竹種的45S rDNA和5S rDNA分布特征Tab.1 The distribution of 45S rDNA and 5S rDNA of 12 bamboo species

圖1 45S rDNA(綠色)和5S rDNA(紅色)在4個(gè)不同竹種染色體上的分布結(jié)果Fig.1 The distribution of 45S rDNA (green) and 5S rDNA (red) on the chromosome of four different bamboo speciesA-D分別為毛竹、花毛竹、龜甲竹及早竹，白色箭頭所示為5S rDNA弱信號(hào)。A to D is Phyllostachys edulis, Phyllostachys edulis ‘Tao kiang’, Phyllostachys edulis ‘Heterocycla’ and Phyllostachys violascens, respectively, white arrows show the weak signals of 5S rDNA.

2.2 45S rDNA和5S rDNA在白哺雞竹、黃稈烏哺雞竹及斑竹染色體上的分布

白哺雞竹、黃稈烏哺雞竹及斑竹在系統(tǒng)分類上均屬于剛竹屬，染色體數(shù)目均為2n=48。圖2A1-A3和表1為45S rDNA和5S rDNA在白哺雞竹染色體上的分布結(jié)果，可以看出45S rDNA在白哺雞竹染色體上有1對(duì)信號(hào)，分布于1對(duì)同源染色體端部，且其中一條染色體上的45S rDNA位點(diǎn)發(fā)生斷裂，如圖2A1所示。5S rDNA在白哺雞竹染色體上有2對(duì)清晰明顯的信號(hào)，且2對(duì)信號(hào)強(qiáng)度差異不大，位于2對(duì)同源染色體的近中間區(qū)域(圖2A2、A3,表1)，除此之外，在45S rDNA位點(diǎn)處也觀察到了微弱的5S rDNA信號(hào)，如黃色箭頭所示(圖2A2)，對(duì)這種特殊現(xiàn)象進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，70個(gè)分裂相中有32個(gè)分裂相可觀察到這種現(xiàn)象，約占45.49%。圖2B1和表1為45S rDNA和5S rDNA在黃稈烏哺雞竹染色體上的分布結(jié)果，可以看出黃稈烏哺雞竹染色體具有1對(duì)45S rDNA信號(hào)，位于1對(duì)同源染色體端部，這對(duì)信號(hào)位點(diǎn)也存在明顯的斷裂現(xiàn)象(圖2B)，黃稈烏哺雞竹染色體上也具有2對(duì)清晰明顯的5S rDNA信號(hào)，位于2對(duì)同源染色體的近中間區(qū)域(圖2B1，表1)，45S rDNA和5S rDNA在黃稈烏哺雞竹染色體上也沒有任何重疊(圖2B)。斑竹染色體上具有1對(duì)45S rDNA信號(hào)，這對(duì)45S rDNA信號(hào)熒光強(qiáng)度一致，位于1對(duì)同源染色體末端，且存在一定的斷裂現(xiàn)象(圖2C，表1)； 斑竹染色體上有2對(duì)5S rDNA信號(hào)，這2對(duì)5S rDNA熒光信號(hào)較弱，位于2對(duì)同源染色體的近中間區(qū)域，如白色箭頭所示(圖2C，表1)，45S rDNA和5S rDNA在斑竹染色體上也沒有任何重疊分布(圖2C)。

圖2 45S rDNA(綠色)和5S rDNA(紅色)在3個(gè)不同竹種染色體上的分布結(jié)果Fig.2 The distribution of 45S rDNA (green) and 5S rDNA (red) on the chromosome of three different bamboo speciesA1-A3為白哺雞竹，B為黃稈烏哺雞竹，C為斑竹。A1 to A3 is Phyllostachys dulcis, B to C is Phyllostachys vivax f. aureocaulis and Phyllostachys reticulata ‘Lacrima-deae’, respectively.

2.3 45S rDNA和5S rDNA在人面竹、金鑲玉竹及紫竹染色體上的分布

人面竹、金鑲玉竹及紫竹在系統(tǒng)分類上均屬于剛竹屬，染色體數(shù)目均為2n=48。由圖3A和表1可以看出人面竹具有2個(gè)45S rDNA信號(hào)位點(diǎn)，位于染色體端部，且其中1個(gè)45S rDNA位點(diǎn)有明顯的斷裂現(xiàn)象，如圖3A1虛線所示。人面竹具有2對(duì)5S rDNA信號(hào)位點(diǎn)，其中1對(duì)位點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度相似，但另外1對(duì)信號(hào)表現(xiàn)為1強(qiáng)1弱，如圖3A1白色和黃色箭頭所示，這2對(duì)信號(hào)均位于兩對(duì)同源染色體的近中間區(qū)域，且45S rDNA和5S rDNA分布于人面竹不同的染色體上(圖3A)。圖3B和表1為45S rDNA和5S rDNA在金鑲玉竹染色體上的分布情況，可以看出金鑲玉竹也具有1對(duì)45S rDNA信號(hào)位點(diǎn)，均位于染色體端部，其中1個(gè)45S rDNA位點(diǎn)存在明顯的斷裂現(xiàn)象，如圖3B虛線所示，而金鑲玉竹的5S rDNA分布模式比較特殊，有3個(gè)信號(hào)位點(diǎn)存在，其中2個(gè)位點(diǎn)位于2條染色體的近中間位置，且這2個(gè)位點(diǎn)在信號(hào)強(qiáng)弱上存在一定差異，如圖3B白色和紅色箭頭所示，另外1個(gè)位點(diǎn)信號(hào)較強(qiáng)，位于1條染色體的末端，如圖3B黃色箭頭所示。金鑲玉竹的45S rDNA和5S rDNA也是位于不同的染色體上，在分布位置上沒有任何重疊(圖3B)。45S rDNA在紫竹染色體上的分布情況比較特殊，雖然45S rDNA位點(diǎn)也是1對(duì)，但這2個(gè)位點(diǎn)存在較大差異，其中1個(gè)位點(diǎn)信號(hào)較強(qiáng)，但極易斷裂，如圖3C虛線所示，而另外1個(gè)位點(diǎn)信號(hào)非常微弱，甚至檢測(cè)不到，位于染色體末端，如圖3A3紅色箭頭所示。紫竹的5S rDNA分布模式也比較特殊，與金鑲玉竹情況相似，也具有3個(gè)位點(diǎn)，其中2個(gè)位點(diǎn)信號(hào)非常強(qiáng)，以成對(duì)的形式位于1對(duì)同源染色體末端，但另外1個(gè)位點(diǎn)信號(hào)微弱，甚至檢測(cè)不到，單獨(dú)位于1條染色體的近中間區(qū)域，如黃色和白色箭頭所示(圖3C，表1)，45S rDNA和5S rDNA也是位于紫竹的不同染色體上(圖3C)。

圖3 45S rDNA(綠色)和5S rDNA(紅色)在3個(gè)不同竹種染色體上的分布結(jié)果Fig.3 The distribution of 45S rDNA (green) and 5S rDNA (red) on the chromosome of three different bamboo species.A-C分別為人面竹、金鑲玉竹和紫竹。A to C is Phyllostachys aurea, Phyllostachys aureosulcata ‘Spectabilis’,and Phyllostachys nigra, respectively.

2.4 45S rDNA和5S rDNA在茶稈竹及大明竹染色體上的分布

茶稈竹和大明竹在系統(tǒng)分類上分別屬于茶稈竹屬和大明竹屬，染色體數(shù)目均為2n=48。圖4A1和表1分別為45S rDNA (綠色)和5S rDNA(紅色)在茶稈竹染色體上的分布，45S rDNA在茶稈竹染色體上有2個(gè)位點(diǎn)，分布于染色體短臂的次縊痕部位(圖4A1)，試驗(yàn)過程中觀察到茶桿竹其中一條染色體上的45S rDNA位點(diǎn)極易斷裂成2段，斷開的2個(gè)45S rDNA片段均可產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào)，導(dǎo)致很多細(xì)胞中出現(xiàn)3個(gè)45S rDNA位點(diǎn)信號(hào)(圖4B，紅色)，對(duì)這類細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，約占55.20%(共統(tǒng)計(jì)154個(gè)分裂相)。5S rDNA(紅色)在茶稈竹染色體上分布模式比較固定，只有1對(duì)分布位點(diǎn)，且信號(hào)較弱，位于染色體近中間區(qū)域(圖4A1)，45S rDNA和5S rDNA均位于茶稈竹不同的染色體上(圖4A1)。45S rDNA(綠色)在大明竹染色體上有2個(gè)信號(hào)位點(diǎn)，分布于大明竹染色體末端，但這2個(gè)位點(diǎn)在信號(hào)大小上存在一定差異(圖4 B，表2)，5S rDNA(紅色)在大明竹染色體上分布情況也比較特殊，以奇數(shù)形式存在，其中2個(gè)位點(diǎn)以成對(duì)的形式分布于染色體短臂中間，另1個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)分布于染色體近著絲粒區(qū)域(圖4B，表2)，大明竹的45S rDNA和5S rDNA也是分布于不同的染色體上(圖4B)。

圖4 45S rDNA和5S rDNA在2個(gè)不同竹種染色體上的分布Fig.4 The distribution of 45S rDNA (green) and 5S rDNA (red) on the chromosome of two different bamboo speciesA1和B分別為45S rDNA(綠色)和5S rDNA(紅色)在茶稈竹和大明竹染色體上的分布，A2為45S rDNA(紅色)在茶桿竹染色體上的分布。A1 and B is the distribution of 45S rDNA (green) and 5S rDNA(red)on the chromosome of Pseudoasa amabilis and Pleioblastus gramineus, respectively. A2 is the distribution of 45S rDNA (red) on the Pseudoasa amabilis.

3 討論

本研究首次系統(tǒng)分析45S rDNA和5S rDNA在毛竹、花毛竹、金鑲玉竹、白哺雞竹、龜甲竹、紫竹、斑竹、黃稈烏哺雞竹、早竹、人面竹、茶稈竹及大明竹等12個(gè)竹種染色體上的物理分布，結(jié)果表明，這些竹種的45S rDNA位點(diǎn)數(shù)比較一致，5S rDNA分布模式彼此間存在一定差異。Garcia等(2017)曾對(duì)1 791個(gè)物種的45S rDNA分布特性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分物種的45S rDNA主要位于染色體端部，特別是只有1對(duì)45S rDNA位點(diǎn)存在的物種，45S rDNA更易分布于染色體末端。本研究中的12個(gè)竹種，近11個(gè)竹種的45S rDNA位點(diǎn)位于染色體末端，說明竹類植物45S rDNA分布模式與大多數(shù)植物的45S rDNA分布趨勢(shì)一致。毛竹測(cè)序結(jié)果表明，其45S rDNA數(shù)為2個(gè)(Pengetal.， 2013)，另外徐川梅等(2009a)曾對(duì)毛竹、斑竹及茶稈竹等竹種的45S rDNA分布特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，這些竹種的45S rDNA位點(diǎn)數(shù)均為2個(gè)，本研究與以上研究結(jié)果基本一致。另外，雖然大部分竹種具有2個(gè)末端45S rDNA位點(diǎn)，但一些竹種的2個(gè)45S rDNA位點(diǎn)在形態(tài)上卻表現(xiàn)出了一定差異，特別是紫竹、大明竹、白哺雞竹及金鑲玉竹等，以紫竹和大明竹為例，其2個(gè)45S rDNA位點(diǎn)在信號(hào)強(qiáng)弱上存在一定差異，紫竹表現(xiàn)更為突出，其1條染色體上的45S rDNA信號(hào)非常強(qiáng)，而另1條染色體上的45S rDNA信號(hào)非常弱，幾乎檢測(cè)不到。一些研究證實(shí)，45S rDNA是一個(gè)脆性位點(diǎn)，該區(qū)域的DNA重復(fù)序列極易斷裂，是一個(gè)重組熱點(diǎn)區(qū)域(Monkheangetal.， 2016； Huangetal.， 2008)。研究過程中發(fā)現(xiàn)，黃桿烏哺雞竹、白哺雞竹、斑竹、金鑲玉竹、紫竹及茶稈竹等竹種的45S rDNA位點(diǎn)區(qū)域有明顯的斷裂痕跡，對(duì)這些竹種的45S rDNA斷裂率進(jìn)行了初步統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，這些竹種的45S rDNA斷裂率介于55.2%～95.59%之間，特別是白哺雞竹和紫竹，其45S rDNA斷裂率高達(dá)90%以上，這進(jìn)一步說明這些竹種的45S rDNA區(qū)域也是一個(gè)脆性區(qū)域，紫竹的45S rDNA異質(zhì)性可能與45S rDNA位點(diǎn)斷裂及易位重組等存在一定關(guān)系。此外，這些竹種的45S rDNA在斷裂方式方面也存在一定差異，例如，紫竹和金鑲玉竹等竹種，其45S rDNA斷點(diǎn)靠近染色體末端部位，大部分45S rDNA片段脫離染色體，染色體末端僅留少量45S rDNA片段，而茶稈竹的45S rDNA易從中間或近中間位置斷開，斷開后的45S rDNA片段變成2個(gè)熒光信號(hào)較強(qiáng)的位點(diǎn)，因此存在45S rDNA斷裂的細(xì)胞中可產(chǎn)生3個(gè)明亮的熒光信號(hào)，且這類細(xì)胞所占比例較高(約55.20%)，這在一定程度上對(duì)試驗(yàn)結(jié)果判讀造成了一定干擾。

與45S rDNA相比，5S rDNA在竹類植物上展現(xiàn)出了豐富的多態(tài)性分布，根據(jù)5S rDNA在12個(gè)竹種上的分布特征，可歸納為4類。第一種分布類型的竹種具有2對(duì)5S rDNA信號(hào)位點(diǎn)，其中1對(duì)5S rDNA信號(hào)非常強(qiáng)，位于染色體端部，另外1對(duì)5S rDNA信號(hào)極弱，甚至檢測(cè)不到，位于染色體近中部區(qū)域，毛竹、花毛竹及龜甲竹3個(gè)竹種的5S rDNA分布模式均屬于這一類型。第二種分布類型的竹種也具有2對(duì)5S rDNA信號(hào)位點(diǎn)，但2對(duì)5S rDNA信號(hào)強(qiáng)度差異不明顯，且均分布于染色體近中部區(qū)域，早竹、白哺雞竹、黃稈烏哺雞竹、斑竹及人面竹均屬于這種分布類型。第三種分布類型的竹種具有1對(duì)5S rDNA信號(hào)位點(diǎn)，分布于染色體近中部區(qū)域，僅茶稈竹屬于這種分布類型。第四種分布類型比較特殊，這些竹種的5S rDNA存在異質(zhì)性分布，具有3個(gè)明顯不對(duì)稱的5S rDNA位點(diǎn)，金鑲玉竹、紫竹及大明竹均屬于這種分布類型。理論上同源染色體在序列組成上是相同的，因此對(duì)應(yīng)的rDNA分布模式也應(yīng)完全相同，但一些竹種的45S rDNA或5S rDNA表現(xiàn)出了明顯的異質(zhì)性，一些研究證實(shí)，其他一些植物中也存在rDNA異質(zhì)分布現(xiàn)象，例如Philodendronangustilobum、Scadoxusmultiflorus及Paspalumquadrifarium等植物，45S rDNA位點(diǎn)均為奇數(shù)，表現(xiàn)出了明顯的異質(zhì)性(Vasconcelosetal., 2018; Monkheangetal., 2016; Vaioetal., 2005)，Philodendronbipennifolium具有3個(gè)5S rDNA位點(diǎn)，2個(gè)以成對(duì)形式位于1對(duì)同源染色體的長(zhǎng)臂近端處，另外1個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)位于1條染色體的短臂處，Philodendronglaziovii2個(gè)5S rDNA位點(diǎn)在形態(tài)大小及信號(hào)強(qiáng)度上存在極大差異(Vasconcelosetal.， 2018)。一些研究證實(shí)，即使親緣關(guān)系很近的一些物種間，其染色體上的rDNA位點(diǎn)數(shù)及分布位置有時(shí)也會(huì)存在一定差異，這些差異可能由以下3個(gè)機(jī)制所導(dǎo)致： 一是染色體間發(fā)生了不等交換或易位，二是rDNA區(qū)域染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生了快速重排，三是多倍化后導(dǎo)致DNA序列丟失(Badaevaetal., 2007; Mondinetal., 2011)。因此，根據(jù)45S rDNA和5S rDNA在上述竹種中的分布結(jié)果，推測(cè)這些竹種在染色體結(jié)構(gòu)上可能也發(fā)生過諸如插入、缺失、易位及不等交換等類型的染色體重組現(xiàn)象，導(dǎo)致不同竹種在45S rDNA和5S rDNA分布模式上存在較大差異，甚至一些竹種的rDNA呈現(xiàn)出一定的異質(zhì)性分布。

一些研究者根據(jù)45S rDNA和5S rDNA在一些植物染色體上的分布特征，將45S rDNA和5S rDNA的位置關(guān)系分為獨(dú)立排列(S-type arrangement，S-type)和連鎖排列(Linked-type arrangement，L-type)兩種類型，其中S-type是指45S rDNA和5S rDNA獨(dú)立分布于不同染色體上，約86.57%的植物屬于這種分布類型，L-type是指45S rDNA和5S rDNA分布于同一條染色體上，這種分布類型的植物較少，約占4.21%(Garciaetal., 2017)。在L-type分布類型中，45S rDNA和5S rDNA分布位置表現(xiàn)形式多樣，有些植物的45S rDNA和5S rDNA位于同一條染色體臂上，且位置十分接近，例如Cucumiszambianus、Cucumismetuliferus及Brassicaoxyrrhina等(Zhangetal.， 2016； Hasteroketal.， 2006)，還有些植物的45S rDNA和5S rDNA在位置上幾乎重疊，例如Brassicafruticulosa，還有些植物的45S rDNA和5S rDNA雖然位于同一條染色體上，但是位于不同染色體臂上，例如Cucumisdipsaceus(Zhangetal.， 2016)。本研究中大部分竹種的45S rDNA和5S rDNA分布于不同的染色體上，因此這些竹種的45S rDNA和5S rDNA分布類型屬于S-type。但是，在白哺雞竹的45S rDNA位點(diǎn)處，檢測(cè)到了微弱的5S rDNA信號(hào)，且對(duì)應(yīng)位置的5S rDNA信號(hào)在形狀大小與45S rDNA完全相同，位置也完全重疊，只是信號(hào)較弱，因此推測(cè)白哺雞竹部分5S rDNA位點(diǎn)與45S rDNA在位置關(guān)系上存在連鎖關(guān)系。除白哺雞竹外，在毛竹的45S rDNA位點(diǎn)處觀察到了非常微弱的5S rDNA信號(hào)，這類細(xì)胞比例較低，約為21.43%，且其表現(xiàn)沒有白哺雞竹明顯。

另外，本研究所分析的12個(gè)竹種除大明竹和茶稈竹分別屬于大明竹屬和茶稈竹屬外，其余10個(gè)竹種均屬于剛竹屬，在rDNA分布模式上，茶桿竹與大明竹除了彼此間存在一定差異外，與剛竹屬的其他一些竹種間也存在著較大差異。剛竹屬是包含竹種較多的一個(gè)屬，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，剛竹屬竹種被分為剛竹組(PhyllostachysSect. Phyllostachys)和水竹組(PhyllostachysSect. Heteroclade)2個(gè)不同的組(馬乃訓(xùn)等， 2014； Zhangetal.， 2019)，本研究所涉及的10個(gè)剛竹屬竹種，除紫竹屬于水竹組外，其余9個(gè)竹種均屬于剛竹組，而紫竹的45S rDNA和5S rDNA分布表現(xiàn)出了明顯的異質(zhì)性，與剛竹組的其他9個(gè)竹種存在較大差異。另外，剛竹組的9個(gè)竹種中，毛竹、花毛竹及龜甲竹3個(gè)竹種的親緣關(guān)系最近，形態(tài)特征也非常相似，而這3個(gè)竹種的45S rDNA和5S rDNA分布模式也十分相似。因此，本研究中一些竹種的細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果在一定程度上與這些竹種的系統(tǒng)分類結(jié)果具有一定的一致性。

4 結(jié)論

本研究利用雙色熒光原位雜交技術(shù)分析了45S rDNA和5S rDNA在毛竹、花毛竹、龜甲竹、早竹、金鑲玉竹、白哺雞竹、紫竹、斑竹、黃稈烏哺雞竹、人面竹、茶稈竹及大明竹12個(gè)不同竹種染色體上的分布，結(jié)果表明，紫竹的45S rDNA位點(diǎn)存在明顯的異質(zhì)性，而金鑲玉竹、紫竹及大明竹3個(gè)竹種的5S rDNA位點(diǎn)為奇數(shù)，也存在明顯的異質(zhì)性。此外，45S rDNA和5S rDNA除了在以上竹種中存在異質(zhì)性分布外，45S rDNA在綠稈人面竹、斑竹、黃桿烏哺雞竹、白哺雞竹及金鑲玉竹等竹種上存在明顯的斷裂現(xiàn)象。根據(jù)以上研究結(jié)果，可以推斷，在進(jìn)化過程中，這些竹種的染色體可能發(fā)生過斷裂、易位、插入或缺失等結(jié)構(gòu)變異。另外，龜甲竹和花毛竹在形態(tài)上與毛竹非常相似，這2個(gè)竹種在系統(tǒng)分類上屬于毛竹的變種，而這3個(gè)竹種的45S rDNA和5S rDNA分布模式也非常相似，這在一定程度上與3個(gè)竹種的系統(tǒng)分類地位具有一定的一致性。上述45S rDNA和5S rDNA的分布特性可作為相應(yīng)的染色體物理標(biāo)記，用以對(duì)相關(guān)染色體的識(shí)別和鑒定。