有機無機肥長期配施對毛竹林土壤固碳和固氮微生物的影響*

劉彩霞 陳俊輝 秦 華 梁辰飛 徐秋芳

(浙江農林大學 浙江省森林生態系統碳循環與固碳減排重點實驗室 浙江農林大學環境與資源學院 臨安 311300)

毛竹(Phyllostachysedulis)占中國竹林總面積的73%，種植面積達467.78萬hm2，也是整個森林生態系統的重要組成部分(國家林業和草原局, 2019)。近幾十年，農民為了提高經濟效益，傾向于使用見效快且施用方便的無機化肥，尤其是在耕作困難的山區和丘陵地帶(Liuetal., 2015)。已有研究證實，毛竹林長期以單施化肥為主的集約經營方式易引起土壤侵蝕和養分淋失、土壤酸化、土壤碳氮儲量降低等土壤退化問題(Qinetal., 2017)，并導致土壤微生物生物量和多樣性降低，改變土壤微生物群落結構(Qinetal., 2017)。有機、無機肥配施可兼顧必需養分和有機碳供應的雙重作用(公華銳等, 2019)，同時能增加土壤微生物生物量和酶活性(戚瑞敏等, 2019)，因此在毛竹林中推廣使用有機、無機肥配施對維持提高土壤肥力和保持土壤微生物區系健康具有重要意義。

土壤微生物多樣性和群落結構顯著影響土壤生態系統過程及其功能的發揮，特別是地球生物化學碳氮循環過程(沈菊培等, 2011)，其中土壤固碳和固氮微生物分別在地球生物化學碳氮循環過程中發揮著重要作用，且受土地管理措施的影響(Yuanetal., 2015； Fanetal., 2018)。固碳微生物通過吸收大氣中CO2并將其轉化為土壤有機碳來調節大氣中CO2濃度并提高土壤碳固定量(Wuetal., 2013)。每年通過土壤微生物固定的大氣中的CO2達0.6～4.9 Gt C，占陸地生態系統固定大氣CO2的0.5%～4.1%(Falkowskietal., 2000)。固氮微生物把大氣中的N2轉化為氨的過程稱之為生物固氮，每年通過微生物固氮方式輸入土壤的氮含量占全球大氣N2含量的16%(Ollivieretal., 2011)，對大多數生態系統的氮供應起著重要作用，尤其是在低肥力土壤中(Normanetal.， 2016)。cbbL和nifH基因分別編碼核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RubisCO)催化和固氮酶還原酶亞基基因，且具有高度保守性，已用于不同生態環境中固碳(Yuanetal., 2015)和固氮(楊璐等, 2020)微生物群落結構和多樣性的研究。目前，毛竹林長期有機、無機肥配施對固碳和固氮微生物的影響卻鮮見報道，本研究采集不同配施有機、無機肥年限的毛竹林地土壤，利用cbbL和nifH基因揭示有機、無機肥配施對固碳和固氮微生物豐度、群落結構和多樣性的影響，以期為我國竹林土壤肥力維持和提高提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于浙江省長興縣和平鎮(119°91′N，30°79′E)，屬亞熱帶季風氣候，坡度20°～25°，向陽，年均氣溫15.6 ℃，降水量1 309 mm。土壤類型為粉砂巖形成的紅黏土，屬于鐵鋁土(WRB， 2006)。研究區之前杉木林，1999年改種毛竹并開始集約管理，經營管理方式包括每年配施無機有機肥、清除林下植被和深耕，竹林密度為3 000株·hm-2，林下基本無灌木雜草，每年10月砍伐生長5年的新竹。未進行集約管理的毛竹林地下植被以狗脊蕨(Woodwardiajaponica)和兔兒傘(Syneilesisaconitifolia)為主，蓋度為90%。每年6月施用有機肥(豬糞)5.25 t·hm-2，平均含有機質119.6 g·kg-1，全氮5.6 g·kg-1，P2O58.3 g·kg-1，K2O 4.5 g·kg-1； 9月施用化肥，包括尿素(450 kg·hm-2)、過磷酸鈣(380 kg·hm-2)和氯化鉀(75 kg·hm-2)； 有機和無機肥料均采用溝施方式。

1.2 樣品采集與處理

2017年9月對研究區進行嚴格實地調查評估，確認毛竹林集約經營的時間順序，最終確認4個不同經營年限毛竹林，分別是集約經營(intensive management，IM)6年(IM6)、10年(IM10)、15年(IM15)和20年(IM20)，以立地條件相同且未施有機無機肥的毛竹林作為對照(CK)。為避免毛竹劇烈生長的春夏季以及施肥和間伐對土壤微生物的影響，因此選擇與以上時期有間隔的11月進行采樣，每個年限林分建立3個20 m × 20 m 標準樣地(即3個重復)，每個樣地小心去除凋落物層，采用5點取樣法采集表層(0～20 cm)和亞表層(20～40 cm)土壤，分別充分混勻過篩(2 mm)并裝入采樣袋，共30個樣品(2個土層 × 5個處理 × 3個重復)。土壤樣品分為2份，1份放入-70 ℃冰箱，經冷凍干燥后，進行土壤DNA提取； 另1份于室內自然風干后，研磨過篩用于基本理化性質分析。

1.3 土壤理化性質分析

土壤化學性質分析參照鮑士旦(2000)方法進行。土壤pH值測定采用1∶2.5土水質量比，用酸度計測定(Mettler Toledo Seveneasy，Sweden)； 有機碳含量(SOC)用重鉻酸鉀容量法； 全氮(TN)采用半微量凱氏定氮法； 堿解氮(AN)采用堿解擴散法； 土壤硝態氮(NO3--N)和銨態氮(NH4+-N)分別采用KCl浸提—紫外分光光度法和KCl浸提—靛酚藍比色法； 有效磷(AP)采用鹽酸-氟化銨溶液浸提—鉬銻抗比色法測定； 速效鉀(AK)采用醋酸銨提取—火焰光度計測定； 同位素比值質譜儀(IsoPrime 100，Germany)和自動元素分析儀(vario MICRO cube，Germany)測定δ13C和δ13N的值。

1.4 土壤微生物總DNA的提取和熒光定量PCR

土壤總DNA提取、濃度和純度測定和保存方法參照文獻劉彩霞等(2018)進行。采用實時熒光定量PCR(Real-time quantutative PCR，qPCR)分別測定固碳和固氮功能菌的cbbL和nifH基因拷貝數，cbbL基因特異性上游引物K2F (5’-AC CAYCAAGCCSAAGCTSGG-3’)，下游引物V2R(5’-GCCTTCSAGCTTGCCSACCRC-3’)(Yuanetal.， 2015)，nifH基因特異性上游引物PolF (5’-ATSGCATCATYTCRCCGGA-3’),下游引物PolR (5’-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3’)(Polyetal.， 2001)。cbbL和nifH基因進行熒光定量PCR的擴增體系和反應程序分別參照Yuan等(2015)和Xiao等(2020)。

1.5 cbbL和nifH基因末端限制性片段長度多態分析(T-RFLP)

采用末端限制性片段長度多態分析(terminal-restriction fragment length polymorph，T-RFLP)技術研究固碳和固氮功能菌群落，引物分別為K2F/V2R(Yuanetal., 2015) PolF/PolR(Polyetal., 2001)，上游引物5’端均用FAM熒光標記。cbbL和nifH基因PCR產物純化后，分別利用限制性內切酶MspI和HaeⅢ在37 ℃下消化4 h，酶切產物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行毛細管電泳(3730 Genetic Analyzer; Applied Biosystems, CA)自動測序分析。毛細管電泳圖譜分析和處理參照Yuan等(2015)。

1.6 cbbL和nifH基因克隆文庫

為了進一步識別末端限制性片段(Terminal-restriction fragment，T-RF)，將不同處理的DNA樣品進行等量混勻后作為PCR的模板來構建cbbL和nifH基因克隆文庫。克隆文庫構建過程見劉彩霞等(2018)，本研究中產生的所有序列均已上傳到NCBI的GenBank數據庫，cbbL基因序列號MF430858～MF430936，nifH基因序列號MF6633454～MF663352。

1.7 數據處理

使用Microsoft Excel 2016進行數據處理，采用SPSS 21.0進行Pearson相關性分析、單因素方差分析和雙因素方差分析，OriginPro 8.5進行圖形繪制。BIO-DAP軟件計算微生物的香農(Shannon)指數、辛普森(Simpson)指數和均勻度指數，采用R中的“vegan”包進行相似性分析(ANOSIM)來確定不同集約經營年限的固碳和固氮微生物組成的差異，采用Canoco 4.5軟件進行微生物與土壤化學性質之間的冗余分析(redundancy analysis，RDA)，其中均采用999次的蒙特卡洛置換檢驗顯著性。

2 結果與分析

2.1 毛竹林土壤理化性質變化

不同集約經營年限毛竹林土壤樣品理化性質結果見表1。土壤pH值穩定在5.0～5.5，表層和亞表層土壤中SOC、TN、AN和AK含量在IM6和IM20顯著高于其他經營年限和CK(P< 0.05)。表層土壤NH4+-N含量隨集約經營時間延長而降低，且CK顯著高于IM6、IM15和IM20(P< 0.05)，亞表層NH4+-N變化規律與表層相反。除表層IM15外，表層和亞表層各經營年限NO3--N含量高于CK。表層和亞表層土壤各經營年限δ13C值均高于CK，IM15達到最高。表層土壤各經營年限δ15N值顯著高于CK(P< 0.05)，亞表層土壤δ15N最大值出現在IM10。

表1 不同集約經營年限毛竹林土壤理化性質①Tab.1 Soil characteristics of long-term intensive managed Phyllostachys edulis stand

2.2 cbbL和nifH基因豐度及其與土壤理化性質的關系

與對照相比，IM6、IM10和IM15表層土壤cbbL基因豐度顯著降低(P< 0.05)，IM20與CK無顯著差異； 表層和亞表層nifH基因豐度在集約經營后顯著降低(P< 0.05)(圖1A和1B)。相關性結果表明，cbbL基因豐度與表層中AK呈顯著正相關，與AP呈顯著負相關； 與亞表層中AN和AK呈顯著正相關。表層土壤nifH基因豐度與NH4+-N呈顯著正相關，與亞表層C∶N呈顯著正相關，而與亞表層NH4+-N呈顯著負相關(圖1C)。

圖1 不同集約經營年限毛竹林土壤固碳細菌cbbL和nifH基因豐度及其與環境因子的相關系數Fig. 1 Abundance of cbbL and nifH gene under long-term intensive managed P. edulis stand and correlation coefficients of environment factors with the diversity indices of cbbL and nifH genes不同小寫字母代表表層(0～20 cm)不同經營年限的顯著性差異(P < 0.05)，大寫字母代表亞表層(20～40 cm)不同經營年限的顯著性差異(P < 0.05)。*P < 0.05，**P < 0.01,下同。Different lowercase and uppercase letters indicate significant differences among the stands in thechronosequence in topsoil and subsoil (P < 0.05), respectively. *P < 0.05;**P < 0.01.The same below.

2.3 毛竹林土壤固碳和固氮菌群落結構及物種變化

cbbL基因擴增產物經MspI酶切處理后得到17條 40～488 bp間的T-RFs。如圖2A所示，40 bp(9.7 %～24.1 %)和177 bp(22.1 %～54.4%)T-RFs是表層和亞表層所有施肥土壤的優勢片段。44、168、175和360 bp則是某些經營年限毛竹林土壤中的優勢片段。表層土壤中44和360 bp相對豐度在IM6后急劇下降，亞表層土壤中360 bp的相對豐度在經營10年后急劇下降，168 bp在經營15年后出現在表土和亞表層土壤中。364 bp是表層土壤特有片段，439和488 bp是亞表層土壤特有片段。nifH基因的擴增產物經HaeⅢ 酶切處理后得到17條37～ 357 bp間的T-RFs(圖2B)，68、154、177、180 bp和332 bp是表層和亞表層中的優勢片段，其中180 bp(22.1 %～54.4 %)是所有經營年限土壤中的優勢片段。表層和亞表層土壤中154和177 bp相對豐度在IM6、IM10和IM15高于CK和IM20，而68和332 bp的相對豐度規律則相反。以上結果表明，有機無機肥配施的集約經營管理對這些片段代表的微生物產生影響。

圖2 不同集約經營年限毛竹林土壤固碳細菌cbbL和nifH基因T-RFs相對豐度Fig. 2 Relative abundance of cbbL and nifH T-RFs under long-term intensive managed P. edulis forestsT-RF:末端限制性片段 Terminal restriction fragment.

系統發育分析結果(圖3)表明，cbbL基因擴增產物的酶切片段177 bp與α-變形菌門中的慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.)(CP013949.1)、紅螺菌(Rhodospirillumcentenum)(CP000613.2)、Starkeyanovella(CP002026.1)、Stappiameyerae(EF101506.1)以及γ-變形菌門中的運動硫黃球菌(Thioflavicoccusmobilis) (CP003051.1)6個物種的親緣關系較近，175 bp與Starkeyanovella(CP002026.1) 親緣關系較近，360 bp在CK和IM6土壤中豐度最高，與新加坡放線菌Actinopolymorphasingaporensis(LT629732.1)、菊苣中根瘤菌(M.cicero) (CP002447.1)和紅螺菌(R.centenum) (CP000613.2)親緣關系較近。表層土壤特有片段364 bp與(S.novella) (CP002026.1) 和慢性根瘤菌(CP013949.1)親緣關系較近，亞表層土壤特有片段439 bp與(S.meyerae)(EF101506.1)親緣關系較近(圖3A)。nifH基因擴增產物的酶切片段81、180、161和187 bp與Rhizobiumsp. (M16710.1)和Azorhizobiumdoebereinerae(FJ223129.1)親緣關系最近，47 bp與變異硫腐菌(Desulfovibriovulgaris) (CP002298.1)親緣關系最近(圖3B)。

圖3 cbbL和nifH序列的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on partial cbbL and nifH sequencesA： cbbL基因的系統發育分析; B： nifH基因的系統發育分析。HP： 和平(試驗地點)；HP后數字代表克隆子序號。GenBank登錄號后的數字表示cbbL和nifH用限制性內切酶酶切后T-RFs大小。自舉值超過30%時在節點上顯示。 Phylogenetic analysis of the (A) partial cbbL sequence and (B) nifH gene affiliated with known sequences in GenBank. HP represent the experimental site of Heping and the numbers after HP represent the respective number of clones. The numbers after GenBank accession numbers indicate the respective sizes of the T-RFs after in silico analysis with the restriction enzyme Msp I for cbbL and Hae Ⅲ for nifH. The selective sequences from clone library were matched T-RFs found in the T-RFLP profiles as determined by endonuclease digestion. Bootstrap values are shown at nodes when they exceed 30% of replicates.

2.4 土壤固碳與固氮微生物群落結構及其與土壤性質的關系

ANOSIM分析結果表明，不同經營年限間土壤固碳和固氮微生物群落存在顯著差異(P< 0.01)，為進一步揭示集約經營對固碳和固氮微生物群落的影響，利用cbbL和nifH基因T-RFLP片段信息和土壤化學性質為2組變量進行冗余分析(RDA)，結果表明，集約經營措施顯著影響固碳和固氮微生物群落結構，其中，固氮微生物群落結構表現出經過20年集約經營后有恢復為經營前群落結構的趨勢。根據Canoco的forward分析，表層土壤的AP、δ13C和NH4+-N變化顯著影響固碳微生物群落結構(圖4A)，亞表層土壤中δ13C變化顯著影響固碳微生物群落結構(圖4B)。表層土壤中AK、SOC、C∶N和AN變化顯著影響土壤固氮微生物群落(圖4C)，亞表層中AP、NO3--N和C∶N變化顯著影響土壤固氮微生物群落(圖4D)。

圖4 毛竹林土壤固碳和固氮微生物群落結構的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis of CO2 fixating microbes and diazotroph community in soils of P. edulis standA： cbbL基因表層； B： cbbL基因亞表層； C: nifH基因表層； D: nifH基因亞表層。A and B were the topsoil and subsoil of cbbL gene, respectively; C and D were the topsoil and subsoil of nifH gene, respectively.

2.5 土壤固碳和固氮微生物群落多樣性及其與土壤性質關系

根據T-RFLP圖譜中T-RFs分別計算表層和亞表層不同經營年限土壤樣品的多樣性指數，包括Shannon指數、均勻度指數和Simpson指數，分別從微生物群落物種豐富度、物種均一性和常見物種3個方面反映微生物群落多樣性。結果表明，表層和亞表層土壤固碳和固氮微生物多樣性對有機無機肥配施反應相似(表2)。毛竹林土壤表層和亞表層固碳微生物以及表層固氮微生物IM10處理的Shannon指數和均勻度指數均低于其他處理，而Simpson指數則相反，亞表層土壤中固氮微生物多樣性指數無顯著差異。雙因素方差分析表明，經營時間顯著影響微生物多樣性(P< 0.05)。多樣性指數與土壤性質的相關分析表明(圖5)，表層土壤固碳微生物的均勻度和亞表層的Shannon指數分別與土壤AK和AP含量呈正相關。而更多的土壤理化因子與固氮微生物多樣性指數呈顯著正相關(P< 0.05)，包括表層土壤均勻度指數與SOC、TN和AN，亞表層土壤中NH4+-N均與Shannon指數和均勻度指數成正相關(P< 0.05)，而與Simpson指數呈負相關(P< 0.05)。

表2 不同集約經營年限毛竹林土壤固碳和固氮微生物多樣性①Tab.2 Microbial diversity of soil carbon and nitrogen fixation in P. edulis forest with different intensive management years

3 討論

3.1 有機無機肥配施對毛竹林土壤理化性質的影響

長期大量施用化肥通常會降低土壤pH值，造成土壤酸化(Schroderetal., 2011)，但在本研究中毛竹林經過20年的有機、無機肥配施，土壤pH值仍保持穩定，說明這種施肥措施能夠避免竹林土壤酸化，另外與CK相比， 20年的有機、無機肥配施提高了土壤SOC、TN、AN和AP等養分的含量。本研究中SOC含量與未施肥相比，SOC經營前6年急劇增加，經營15年后降低， 20年后毛竹林SOC含量逐漸提高。SOC動態變化依賴于有機碳輸入和礦化的平衡(邢亞薇等, 2019)，前一階段的急劇增加可能是因為大量有機肥料投入但沒有迅速分解，隨著土壤微生物群落的改善，在隨后的經營年限中SOC礦化加速，土壤有機碳下降到與對照相同的水平，說明毛竹林土壤有相對穩定的有機碳循環動態，雖然每年輸入一定量豬糞有機肥，但有機質礦物速率較大，不足以顯著提高SOC水平。土壤δ13C是研究植物群落歷史、確定土壤有機碳來源、指示土壤質量和土壤碳固存率的重要指標(Mendez-Millanetal., 2013; Zhangetal., 2015)，與土壤有機碳動態密切相關。本研究中，未經營的毛竹林土壤δ13C值高于各經營處理的δ13C值，且隨著經營年限延長而提高。δ13C值的提高可能歸因于2個因素： 在酶促反應中，含12C同位素的化學鍵比13C更容易被分解(Powersetal., 2002)，因此較輕的12C更容易通過有機物分解揮發，從而13C的占比增加(Guillaumeetal., 2015)。本研究中輸入的有機肥為豬糞，豬飼料中含有C4植物玉米(Zeamays)，C4植物δ13C的范圍為-17 ‰～-9 ‰高于C3植物(范圍為-32 ‰～-22 ‰)(Baietal., 2012)。

3.2 有機、無機肥配施對毛竹林土壤固碳和固氮微生物數量、多樣性和群落結構的影響

毛竹林土壤中固碳和固氮微生物群落結構對集約經營響應不同。隨著經營時間的延長，CK與各經營年限的土壤固碳微生物群落結構差異顯著，而CK處理與經營20年固氮微生物群落在RDA第一排序軸聚集在一起，說明經過20年的經營其結構恢復到原來的狀態，表明土壤固氮微生物群落結構具有一定恢復能力。固碳微生物優勢片段豐度在各經營年限中不同，177 bp是表層和亞表層優勢片段，它代表的菌群主要屬于變形菌門中的慢生根瘤菌、紅螺菌、中慢生根瘤菌S.novella、S.meyerae和T.mobilis。變形菌門是富營養菌群，適宜生長在養分充足的環境中(Fiereretal., 2007)，因此，177 bp代表的物種在CK中相對豐度較低，各經營年限中由于大量有機和無機肥施入有利于其生長而提高其豐度。RDA分析結果表明，毛竹林表層土壤中AP和δ13C顯著影響固碳微生物群落結構，表明集約經營可能通過提高土壤AP含量而提高177 bp為代表的物種豐度，這一結果與Yuan等(2015)的結果相似，土壤P含量是調控含cbbL基因群落組成的主要因子之一。毛竹林土壤中優勢固氮菌是根瘤菌和固氮根瘤菌，已經證實根瘤菌廣泛存在于酸性土壤中(Fanetal., 2018)，因此根瘤菌能成為毛竹林土壤中的優勢固氮菌。毛竹林土壤固碳和固氮微生物豐度對集約經營反應不同，與未施肥處理相比，本研究中以有機無機肥配施為主的經營措施在經營前15年降低土壤中固碳微生物豐度，經營20年后固碳微生物豐度恢復到經營前水平，而固氮微生物基于經營后豐度持續下降。但與固碳和固氮微生物數量和群落結構對集約經營反應不同相比，它們的多樣性表現出相似的規律。固碳和固氮微生物經營10年后Shannon指數和均勻度指數顯著下降，這可能是因為肥料的施入刺激了某些適應于寡營養環境的固碳和固氮微生物，但隨著施肥時間的延長肥效降低，集約經營前期降低的適應于寡營養環境的固碳和固氮微生物逐漸恢復而導致Shannon指數和均勻度指數在經營后期(IM15和IM20)提高。在集約經營前10年，表征優勢物種豐富度的Simpson指數顯著增加，固碳菌優勢片段177 bp和固氮菌優勢片段180bp代表的優勢種的增加可解釋這一結果。

圖5 環境因子與cbbL和nifH基因多樣性指數的相關系數①Fig. 5 Correlation coefficients of environment factors with the diversity indices of cbbL and nifH genes

3.3 毛竹林土壤理化性質變化對土壤固碳和固氮微生物的影響

土壤pH值是影響土壤微生物的關鍵因子，而本研究中未發現固碳和固氮微生物豐度、多樣性和群落結構與土壤pH值的相關性。Zhou等(2019)認為土壤pH值與新層土中固碳微生物群落結構變化顯著相關，與本研究結果相反，這可能是因為長期(26年)不同配方無機施肥加劇了土壤酸化，未施肥處理與4種無機肥處理間的土壤pH值變化范圍為1～0.89，而本研究中有機肥的施用緩沖了無機肥施用引起的pH值降低(肖輝等， 2014)，CK處理與IM20土壤pH差值僅為0.26。另外，本研究毛竹林土壤中的固碳和固氮共同優勢菌是根瘤菌，根瘤菌適宜生長的范圍是pH值4.5～5.5 (Fanetal., 2018)，本研究中不同處理間土壤pH值范圍是4.99～5.42。因此，較弱的pH變化和優勢菌適應生長的pH值范圍未發生改變是土壤固碳和固氮菌未響應土壤pH值的變化的重要原因。土壤養分有效性是細菌豐度和多樣性的重要決定因素，已有研究表明cbbL基因豐度主要受SOC、AN和C:N等與土壤養分相關因子的影響(袁紅朝等， 2012)，在本研究中表層和亞表層土壤中cbbL基因豐度與AK含量變化顯著相關，隨著經營年限延長有機、無機肥配施能顯著提高土壤AK含量，但其含量仍屬于極低水平(< 50)(鮑士旦等, 2000)，因此，毛竹林土壤中較低的AK含量導致土壤固碳微生物豐度的降低，說明AK含量是限制毛竹林土壤中固碳微生物生長的重要環境因子。本研究中有機、無機肥配施顯著降低了nifH基因豐度，這與Fan等(2019)的研究結果相似，即與無施肥處理相比，即使是有機材料(小麥秸稈、豬糞或牛糞)與化肥配施，土壤固氮微生物的固氮效率也下降了50%。nifH基因豐度與土壤中AN、NO3--N和NH4+-N含量變化顯著相關，Pereira等(2011)也證實固氮微生物對土壤中氮含量豐缺表現極其敏感。另外生物固氮是一個高耗能過程，而有機碳通常是其主要能量來源(Pfisteretal., 2010)，較高的土壤C:N使固氮微生物生長具有競爭優勢，因此nifH基因豐度與亞表層土壤C:N呈正相關，同時C:N是驅動固氮微生物群落結構變化的重要因子(Wangetal., 2017)。綜上所述，土壤養分有效性是毛竹林土壤中固碳和固氮微生物豐度、多樣性和群落結構變化的重要原因。

4 結論

毛竹林有機、無機肥配施經營20年后，土壤有機碳和速效氮、磷、鉀含量雖有波動，但總體為提高趨勢，土壤pH值一般穩定在5.0～5.5，土壤未出現酸化現象。土壤固碳和固氮微生物豐度和群落結構對有機、無機肥配施措施響應強烈，但規律不同。與未施肥對照相比，經營15年后土壤固碳微生物豐度顯著降低，經營20年后其豐度恢復到經營前水平，而集約經營后固氮微生物豐度保持下降趨勢。未施肥處理與毛竹林各經營年限處理的固碳微生物群落結構差異顯著，而經營20年的固氮微生物群落結構與未施肥對照相似。毛竹林土壤有機無機肥配施20年后，固碳微生物豐度和固氮微生物群落結構恢復到未施肥對照水平，說明長期采用有機、無機配施肥措施對毛竹林土壤固碳和固氮微生物顯著影響，也未造成土壤酸化，因此可在毛竹林經營中推廣有機、無機配施，以緩解大量化肥施用對土壤造成的不良影響。