肥大細胞通過血管緊張素Ⅱ途徑參與尿酸性腎損傷

張明康,周 燕,武新安,3

(1.蘭州大學第一醫院藥劑科,中國甘肅 蘭州 730000;2.蘭州大學藥學院,中國甘肅 蘭州 730020;3.甘肅省臨床用藥風險防控工程研究中心,中國甘肅 蘭州 730000)

尿酸性腎病(uric acid nephropathy)又稱高尿酸血癥腎病,主要由尿酸或尿酸鹽晶體在腎臟沉積所導致[1]。尿酸主要由內源性和外源性嘌呤在黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase,XOR)的作用下生成[2]。腎臟是尿酸的主要排泄器官,約70%的尿酸從腎臟排泄,其中超過90%被重吸收到腎近曲小管中[3]。目前,降低尿酸的藥物主要有兩大類:XOR抑制劑和促進尿酸排泄劑,它們在臨床上的應用均可產生嚴重副作用。例如:別嘌呤醇(XOR抑制劑)會導致嚴重肝功能損害、胃腸道反應、藥疹等;苯溴馬隆(促進尿酸排泄劑)可導致肝腎損傷和過敏等嚴重的不良反應[2,4～5]。隨著人們生活水平的提高,高嘌呤食物的攝入量明顯增加,導致尿酸性腎病的發病率呈上升趨勢[6],且發病年齡逐漸呈現年輕化趨勢[5]。因此,研發出高效低毒甚至無毒副作用的新型降尿酸藥物,引起了越來越多的關注。

近年來研究發現,肥大細胞與炎癥和纖維化損傷密切相關,并且肥大細胞參與許多腎臟疾病的發生和進展[7],如馬兜鈴酸腎病[8]、肥胖相關性腎病[9]、IgA腎病[10]。但是,很少有研究報道肥大細胞與尿酸性腎病之間的關系,相關機制更是不明。因此,本研究使用腺嘌呤聯合酵母粉模擬高嘌呤飲食,在健康雄性SD大鼠中制備慢性尿酸性腎損傷模型,初步探討肥大細胞與尿酸性腎病之間的聯系,為臨床治療尿酸性腎損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD(sprague-dawley)大鼠24只,6～8周齡,體重(200±10)g,購自蘭州獸醫研究所實驗動物中心,動物生產許可證號:SCXK(甘)2015-0001。大鼠飼養于蘭州大學藥學院動物房,室溫25℃,晝夜12 h交替,可以自由進食、飲水。所有動物實驗均經過蘭州大學醫學倫理委員會同意,實驗方法符合動物醫學倫理管理規范。

1.2 實驗試劑與儀器

腺嘌呤(adenine,AD,北京索萊寶科技有限公司);谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測試劑盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)檢測試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);大鼠血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒(上海酶聯生物公司)。

OLYMPUS AU400全自動生化分析儀(OLYMPUS光學株式會社,日本);17/17R低溫高速離心機(Thermo公司,美國);Smart WLI光學顯微鏡(GBS公司,德國);LT-224S分析天平(北京賽多利斯公司)。

1.3 實驗動物分組與干預方法

SD大鼠適應性基礎喂養1周后根據體重隨機分為對照組和模型組,其中對照組6只,模型組18只。模型組以100 mg/(kg·d)腺嘌呤灌胃聯合喂食含有10%酵母粉的飼料構建尿酸性腎病大鼠模型,分別連續干預14 d(AD-14d)、21 d(AD-21d)和28 d(AD-28d);對照組每天以1%阿拉伯膠灌胃,于28 d后取材。每天記錄大鼠體重,并觀察毛色及日常活動狀況。

1.4 大鼠腎功能指標檢測

每組大鼠于末次干預后禁食24 h,次日利用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液,尿液標本以8 000 r/min離心10 min,收集上清。隨后,腹腔注射3%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠,開腹,腹主動脈采血3 mL,血標本以8 000 r/min離心10 min,收集血清。以全自動生化分析儀檢測血清腎功能指標血尿酸(serum uric acid,SUA)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(serum creatinine,SCr)、胱抑素C(cystatin-C)以及尿尿酸(urinary uric acid,UUA)含量。

1.5 蘇木精伊紅染色觀察大鼠腎臟組織病理學變化

采血結束后,斷頸處死大鼠,立即采集腎臟組織,稱量,記錄腎總重。根據下述公式計算腎臟指數:腎臟指數=腎總重/體重。隨后,將左側腎臟組織置于4%中性多聚甲醛中固定24 h。制備常規石蠟切片,進行蘇木精伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,用中性樹膠封片后置于光學顯微鏡下觀察染色情況。

1.6 Masson染色觀察大鼠腎間質纖維化程度

取各組大鼠腎臟組織石蠟切片,進行Masson染色,用中性樹膠封片后,置于光學顯微鏡下觀察染色情況。染色結果:膠原纖維呈藍色,視為陽性著色,肌纖維呈紅色。

1.7 大鼠腎臟尿毒素含量測定

采血結束后,斷頸處死大鼠,立即采集腎臟組織。將右側腎臟組織置于液氮中,然后精準稱取適量腎臟組織于離心管中,加入蒸餾水,每個離心管中加入5個磁珠,充分勻漿后以8 000 r/min離心10 min,收集上清。采用超高效液相色譜-串聯質譜(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)技術檢測大鼠腎臟中尿毒素含量。色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm × 50 mm,1.8 μm),流動相組成為水(0.1%乙酸)和甲醇(體積比60∶40),流速為0.2 mL/min,柱溫保持在30℃。樣品溶液和標準溶液的進樣體積均為10 μL。各尿毒素質譜檢測條件見表1。

表1 各尿毒素質譜檢測條件Table 1 Mass spectrometry detection conditions for different urinary toxins

1.8 甲苯胺藍染色觀察大鼠腎臟肥大細胞

取各組大鼠腎臟組織石蠟切片,經脫蠟、脫水后進行甲苯胺藍染色,用中性樹膠封片,置于光學顯微鏡下觀察染色情況。連續觀察5個視野(×200)統計肥大細胞數量,并取平均值。染色結果:肥大細胞呈紫紅色。

1.9 大鼠血清AngⅡ含量檢測

血清AngⅡ含量嚴格根據上海酶聯生物公司試劑盒說明書進行檢測和計算。

1.10 大鼠氧化應激指標檢測

血清和腎臟組織中GSH、GSH-Px、SOD的含量嚴格根據南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行檢測和計算。

1.11 數據統計學處理

用SPSS 21.0軟件進行數據統計分析。實驗中所有數據用平均值±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,顯著性水平為P＜0.05。采用GraphPad Prism 8.0軟件制圖。

2 結果

2.1 大鼠日常狀況和腎臟形態

在造模過程中,模型組大鼠體重增加緩慢甚至減輕,精神萎靡,毛色棕黃,背脊彎曲,并隨著造模天數增加,情況加重;對照組大鼠毛色均光滑潤澤,精神活躍。在腎臟形態方面,模型組大鼠出現“大白腎”現象,即和對照組大鼠腎臟相比,模型組大鼠腎臟體積變大,外表面分布白色顆粒,腎臟變為棕黃色(圖1A)。此外,和對照組相比,造模14 d、21 d和28 d大鼠的腎臟指數(腎總重/體重)均顯著性增加(P＜0.01)(圖 1B)。

圖1 尿酸性腎病大鼠腎臟形態(A)各組大鼠腎臟外觀形態;(B)腎臟指數。**:P＜0.01 vs.對照組。Fig.1 Kidney morphology in rats with uric acid nephropathy(A)The appearance of the rat kidney in each group;(B)The ratio of kidney mass to body weight.**:P＜0.01,compared with the control group.

2.2 大鼠腎功能指標檢測結果

模型組大鼠分別喂養至14 d、21 d和28 d,對照組大鼠喂養至28 d,各組大鼠正常禁食24 h后,收集24 h尿液,同時經腹主動脈收集血清,檢測各組大鼠 BUN、SCr、SUA、cystatin-C 和 UUA含量。檢測結果如表2所示,與對照組相比,造模14 d、21 d和28 d大鼠的BUN和SCr含量均顯著性升高(P＜0.01);造模21 d和28 d大鼠的血清cystatin-C水平顯著性升高(AD-21d,P＜0.05;AD-28d,P＜0.01);造模14 d、21 d和28 d大鼠的SUA水平顯著性升高,UUA水平顯著性降低(AD-14d,P＜0.05;AD-21d 與 AD-28d,P＜0.01)。由上可見,模型組大鼠在造模14 d時BUN、SCr和SUA的水平顯著高于對照組,且隨著造模天數增加,上述腎功能指標(包括cystatin-C)的水平逐漸增加。此外,模型組血中尿酸水平顯著升高,尿中尿酸水平顯著降低,提示模型組大鼠腎臟功能受損,腎臟尿酸鹽排泄發生障礙。

表2 各組大鼠腎功能指標含量Table 2 The contents of renal function indexes in each group of rats

2.3 大鼠腎臟組織病理學觀察結果

為了證實模型組大鼠腎臟存在結構受損,尿酸鹽排泄障礙,我們對各組大鼠腎臟組織進行了病理學顯微觀察和比較。HE染色結果如圖2所示,對照組大鼠腎臟組織(腎小管、腎小球)大小和形態均正常;造模14 d的大鼠腎臟組織出現腎小管擴張,造模21 d和28 d的大鼠腎臟組織呈現腎小管擴張和尿酸鹽晶體沉積,并且隨著造模天數增加,上述病理情況更加嚴重。上述結果證明,模型組大鼠腎臟結構受損,并在功能上導致腎臟尿酸鹽蓄積。

圖2 HE染色觀察各組大鼠腎臟組織切片(×200)圖中黑色箭頭指示腎小管擴張,黃色箭頭指示尿酸鹽晶體。Fig.2 HE staining of rat kidneys in each group(×200)The black arrows indicate the dilated renal tubules,and the yellow arrows indicate the urate crystals.

2.4 大鼠腎間質纖維化程度

為了進一步證實模型組大鼠腎臟結構受損,我們采用Masson染色來觀察其腎間質纖維化程度。結果如圖3顯示,對照組大鼠腎間質僅見少量亮藍綠色膠原纖維;模型組(AD-14d、AD-21d、AD-28d)大鼠腎臟組織均可見大量亮藍綠色膠原纖維沉積且呈絮團狀,提示其纖維化損傷嚴重并呈現時間依賴性。

圖3 Masson染色觀察各組大鼠腎臟組織切片(×200)Fig.3 Masson staining of rat kidneys in each group(×200)

2.5 大鼠腎臟尿毒素含量

鑒于模型組大鼠存在嚴重腎損傷,我們進一步比較了對照組和不同時間段模型組大鼠的腎臟尿毒素含量。檢測結果如圖4所示,與對照組相比,結合型尿毒素中D-犬尿酸和苯基-β-D-葡糖苷酸的含量在造模21 d和28 d時均顯著性增加(P＜0.05);對甲酚葡糖苷酸的含量在造模28 d時顯著性增加(P＜0.05);對甲酚硫酸鹽的含量在造模21 d和28 d時顯著性增加(P＜0.01);苯乙酰-L-谷氨酰胺的含量在造模21 d和28 d時顯著性增加(P＜0.05或P＜0.01);馬尿酸的含量在造模14 d、21 d和28 d時均出現顯著性增加(P＜0.01);硫酸吲哚酚的含量在造模14 d、21 d和28 d均出現顯著性增加(P＜0.05 或 P＜0.01)。同時,與對照組相比,游離型尿毒素中N-乙酰-L-精氨酸和三甲胺-N-氧化物的含量在造模14 d、21 d和28 d時均出現顯著性增加(P＜0.01);N-肉桂酰甘氨酸和假尿苷的含量在造模14 d、21 d和28 d時均出現顯著性增加(P＜0.05);L-甲基肌苷的含量在造模21 d和28 d時均出現顯著性增加(P＜0.01)。上述結果說明,結合型和游離型尿毒素含量均因模型誘導時間的加長而增加,證明誘導時間的延長將導致尿酸性腎功能障礙的進一步惡化。

圖4 各組大鼠腎臟尿毒素含量*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.對照組。Fig.4 The content of urinary toxin in the kidney of each group*:P＜0.05,**:P＜0.01,compared with the control group.

2.6 大鼠腎臟組織肥大細胞數量

為了考察肥大細胞是否參與尿酸性腎損傷,利用甲苯胺藍染色,特異性識別肥大細胞。結果如圖5A所示,對照組大鼠腎臟可見少量肥大細胞(黑色箭頭所示),并且肥大細胞分布稀疏;在模型組中,肥大細胞主要分布在腎皮質、腎小管間質以及腎小球和血管周圍區域,且呈聚集狀態。進一步對各組肥大細胞的數量進行統計分析,結果如圖5B所示,與對照組相比,造模14 d大鼠的肥大細胞數量有增加趨勢但未出現顯著性差異,而造模21 d、28 d大鼠的肥大細胞數量均出現顯著性增加(AD-21d,P＜0.05;AD-28d,P＜0.01)。以上結果提示,隨著造模天數增加,肥大細胞數量顯著增加。AngⅡ的含量。結果如圖6所示,與對照組相比,造模14 d大鼠血清AngⅡ含量沒有顯著性差異,然而在造模21 d和28 d的大鼠中,血清AngⅡ含量均出現顯著性增加(P＜0.05)。

圖5 各組大鼠腎臟肥大細胞的分布和數量(A)各組大鼠腎臟肥大細胞的分布;(B)各組大鼠腎臟肥大細胞的數量。*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.對照組。Fig.5 Distribution and number of mast cells in each group of rats(A)Distribution of renal mast cells in each group;(B)Mast cell numbers in renal of each group.*:P＜0.05,**:P＜0.01,compared with the control group.

圖6 各組大鼠血清AngⅡ含量*:P＜0.05 vs.對照組。Fig.6 The serum Ang Ⅱ content in each group of rats*:P＜0.05,compared with the control group.

2.8 大鼠血清和腎臟氧化應激指標檢測結果

AngⅡ作為腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system,RAS)主要的功能性成分,可以促進活性氧的產生,繼而加重氧化應激反應。為了進一步證明肥大細胞通過AngⅡ途徑參與尿酸性腎損傷,我們檢測了大鼠血清和腎臟氧化應激指標GSH、SOD和GSH-Px的含量。血清檢測結果如

2.7 大鼠血清AngⅡ含量

當過敏原持續刺激機體時,肥大細胞會募集在組織或器官中并釋放細胞內的各種活性遞質,最終促進AngⅡ的產生。為了進一步證實肥大細胞參與尿酸性腎損傷,我們檢測了各組大鼠血清表3所示,與對照組相比,造模14 d時,大鼠血清GSH和GSH-Px的含量有下降趨勢但未出現顯著性差異;造模21 d和28 d時,大鼠血清GSH和GSH-Px的含量顯著性下降(AD-21d,P＜0.05;AD-28d,P＜0.01);各模型組大鼠血清SOD水平和對照組相比沒有顯著性差異。各組大鼠腎臟氧化應激指標的檢測結果如表4所示,與對照組相比,造模14 d、21 d和28 d時,大鼠腎臟GSH的含量顯著性下降(AD-14d,P＜0.05;AD-21d和AD-28d,P＜0.01);造模21 d和28 d時,SOD和GSH-Px的含量均顯著性下降(AD-21d,P＜0.05;AD-28d,P＜0.01)。以上數據提示,肥大細胞通過促進AngⅡ產生,促進氧化應激,使GSH、SOD和GSH-Px的含量降低,從而加重腎損傷。

表3 各組大鼠血清GSH、SOD和GSH-Px的含量Table 3 The contents of GSH,SOD,and GSH-Px in sera of rats in each group

表4 各組大鼠腎臟GSH、SOD和GSH-Px的含量Table 4 The contents of GSH,SOD and GSH-Px in kidneys of rats in each group

3 討論

腎臟作為尿酸主要的排泄器官,在維持尿酸水平相對穩定方面發揮著至關重要的作用。當血尿酸水平持續增高時,尿酸或尿酸鹽在腎臟蓄積,引起腎小管上皮細胞功能紊亂、腎間質纖維化,以及腎小球濾過率下降[11]。本實驗利用腺嘌呤-酵母粉聯合喂養模擬高嘌呤飲食,誘導大鼠尿酸性腎損傷。結果顯示,隨著造模天數增加,模型組大鼠血清尿酸水平顯著增加(表1),腎臟尿酸鹽蓄積(圖2),腎間質纖維化損傷加重(圖3)。此外,隨著造模天數增加,模型組大鼠血清肌酐、尿素氮及胱抑素C的水平也顯著增加(表1)。上述結果表明,模擬高嘌呤飲食可造成大鼠尿酸性腎損傷。當腎功能下降或喪失時,機體代謝產生的氮質廢物在體內蓄積并加重腎臟損害,這些物質也被稱為尿毒素[12]。Duranton等[13]報道,硫酸吲哚酚和對甲酚硫酸鹽等蛋白質結合型尿毒素極難經血液透析清除,其中經透析治療后的患者體內硫酸吲哚酚的水平仍高達正常水平的20倍。尿毒素水平顯著升高的現象往往在慢性腎損傷患者體內出現,而尿酸性腎損傷是導致慢性腎損傷的重要因素[14]。我們的研究結果顯示,隨著造模天數增加,大鼠腎臟結合型尿毒素(例如硫酸吲哚酚和對甲酚硫酸鹽)水平顯著上升,游離型尿毒素(例如N-乙酰-L-精氨酸和三甲胺-N-氧化物)水平也顯著上升。其中,硫酸吲哚酚、馬尿酸、N-乙酰-L-精氨酸、三甲胺-N-氧化物、N-肉桂酰甘氨酸和假尿苷的水平在造模14 d時就顯著增加,而且隨著造模天數增加,上述尿毒素水平逐漸增加;對甲酚葡糖苷酸水平僅在造模28 d時顯著增加(圖4)。上述結果說明,利用腺嘌呤-酵母粉聯合喂養模擬高嘌呤飲食會導致腎臟尿酸鹽排泄障礙和尿毒素水平顯著升高。

Corry等[15]指出,尿酸通過激活單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)通路,增加血管緊張素原的表達,促進AngⅡ的生成[6]。AngⅡ的增多能直接導致腎小管周圍毛細血管的收縮或丟失,從而致使腎臟微血管系統受損[16～17]、腎小管間質性缺血缺氧以及腎間質纖維化[18],造成嚴重腎功能障礙。Li等[19]報道,在人腎臟疾病中,腎皮質、腎小管間質以及腎小球和血管周圍區域的肥大細胞數量增加并活化。Veerappan等[17]發現,肥大細胞活化后可分泌多種介質,主要包括特定的蛋白酶(糜酶和胰酶)、組胺和炎性細胞因子。Yamada等[20]指出,靡酶是合成AngⅡ的重要活性酶,肥大細胞通過釋放糜酶與人腎臟間質纖維化密切相關[21]。此外,Silver等[22]的研究發現,除了傳統的腎素-血管緊張素系統外,肥大細胞也是腎素的來源途徑,并且構成獨特的腎素-血管緊張素系統,促進AngⅡ的產生。本研究發現,造模21 d和28 d的大鼠腎臟肥大細胞數量(圖5)和血清AngⅡ含量(圖6)均顯著高于對照組,提示肥大細胞通過促進AngⅡ生成的途徑參與尿酸性腎損傷。此外,與對照組相比,造模21 d和28 d時,大鼠血清GSH和GSH-Px的含量顯著降低(表3),腎臟GSH、SOD和GSH-Px的含量顯著降低(表4)。上述結果提示,肥大細胞通過促進AngⅡ的生成,引起腎小管周圍毛細血管的收縮或丟失,進而導致腎臟缺血缺氧[16～17],加重腎臟氧化應激反應[23],使GSH、SOD和GSH-Px的含量降低。因此,阻斷肥大細胞活化產生AngⅡ,抑制腎臟氧化應激反應,為治療尿酸性腎損傷提供了一條新思路。

利益聲明:本文全體作者均聲明不存在利益沖突。