TMPRSS2重組蛋白阻斷SARS-CoV-2假病毒的感染

潘 婷,彭倩文,杜艷蕓,王晨輝,2,3*

(1.華中科技大學生命科學與技術(shù)學院,中國湖北 武漢 430074;2.四川省醫(yī)學科學院四川省人民醫(yī)院人類疾病基因研究四川省重點實驗室,中國四川 成都 610031;3.電子科技大學,中國四川 成都 611731)

2019年底出現(xiàn)的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)在國內(nèi)和國際上的快速傳播導致了全球衛(wèi)生緊急事件。嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)入侵宿主細胞首先依賴于病毒刺突蛋白S(spike glycoprotein)與細胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensinconverting enzyme 2,ACE2)的結(jié)合,隨后宿主細胞蛋白酶對S蛋白進行切割激活,進而促進病毒與宿主細胞膜融合,ACE2與宿主細胞蛋白酶在病毒入侵宿主細胞的過程中都發(fā)揮了關(guān)鍵作用[1]。Glowacka等[2]曾報道,Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶(type Ⅱ transmembrane serine protease,TMPRSS2)的分布與SARS-CoV在肺部的感染相關(guān),該蛋白酶可以有效地激活冠狀病毒的S蛋白,在細胞表面誘導病毒與細胞膜融合。

1997年,TMPRSS2基因通過系統(tǒng)外顯子捕獲實驗在人類21號染色體上首次被發(fā)現(xiàn)。其全長cDNA編碼由492個氨基酸組成的蛋白質(zhì)[3],該蛋白質(zhì)固定在質(zhì)膜上,屬于TTSPs家族(Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶)。TTSPs的特征是包含一個短的細胞內(nèi)N端結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個大的胞外結(jié)構(gòu)域,其中胞外結(jié)構(gòu)域由一個可變莖區(qū)和一個糜蛋白酶S1折疊的C端絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[4～5]。根據(jù)絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的莖區(qū)組成和系統(tǒng)發(fā)育分析,TTSPs被分為人氣道胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶(human airway trypsin-like protease,HAT)、蛋白質(zhì)裂解酶(matriptase)、跨膜絲氨酸蛋白酶(TMPRSSs)和絲氨酸酶4個亞家族[6]。

SARS-CoV-2是一種主要通過呼吸途徑傳播的急性傳染病的病原體。盡管ACE2存在于所有器官的血管內(nèi)皮細胞中,但SARS-CoV和SARSCoV-2僅在肺部具有高致病性[7～8]。此外,雖然在Ⅰ型和Ⅱ型肺細胞中均有ACE2的表達[9],但SARSCoV-2的細胞向性與ACE2的表達并不嚴格相關(guān),這表明COVID-19的發(fā)病機制還需要其他因素來解釋[9]。TMPRSS2在人肺的上皮細胞中高度表達[10]。已知各種蛋白酶,如胰蛋白酶、類胰蛋白酶、人氣道胰蛋白酶和TMPRSS2,都能夠裂解甲型流感病毒血凝素的糖蛋白,并且TMPRSS2是病毒和宿主細胞膜融合的先決條件[11]。許多病毒,如人類免疫缺陷病毒(HIV)和尼帕病毒,在感染細胞過程中由細胞蛋白酶(如弗林蛋白酶或組織蛋白酶)切割病毒糖蛋白,從而分離病毒的受體結(jié)合亞基和膜融合亞基,并將糖蛋白前體轉(zhuǎn)化為融合狀態(tài)[12]。對于埃博拉病毒和SARS冠狀病毒,病毒糖蛋白被內(nèi)吞體蛋白酶裂解,在病毒進入細胞過程中,誘導受體結(jié)合或內(nèi)吞作用導致的構(gòu)象變化[13]。有3種蛋白酶,即胰蛋白酶、組織蛋白酶L和彈性蛋白酶,曾被報道能夠激活SARS冠狀病毒的S蛋白[14～16]。在細胞表面缺乏上述蛋白酶的情況下,SARS冠狀病毒通過內(nèi)吞體途徑進入細胞,S蛋白被內(nèi)吞體中的組織蛋白酶L激活[17～18]。相反,在細胞表面存在上述蛋白酶(如胰蛋白酶和彈性蛋白酶)時,附著在宿主細胞表面受體上的病毒S蛋白會被這些蛋白酶激活,誘導包膜-質(zhì)膜融合,隨后介導SARS冠狀病毒直接進入細胞[19]。后一種情況下的病毒復制效率更高,比內(nèi)吞體途徑的復制效率高100倍[19],這表明,SARS冠狀病毒引起的嚴重急性呼吸道綜合癥可能是蛋白酶介導的病毒直接進入細胞導致的復制增強。

TMPRSS2在病毒感染宿主細胞的過程中發(fā)揮重要作用。類似地,人偏肺病毒(human metapenumovirus,HMPV)的融合蛋白F是作為單一表面糖蛋白合成的,需要被宿主細胞蛋白酶裂解才能使病毒繁殖[20]。這種病毒主要在幼兒中引起嚴重的毛細支氣管炎和肺炎。既往研究表明,TMPRSS2是HMPV F蛋白的有效激活劑[21]。此外,研究還發(fā)現(xiàn),除了組織蛋白酶L外,TMPRSS2也能激活SARS-CoV的刺突蛋白S[22]。TMPRSS2對S蛋白的切割促進了SARS冠狀病毒從細胞表面直接進入宿主細胞,而不依賴于內(nèi)吞體途徑中組織蛋白酶L的活性[23]。之前的一項研究發(fā)現(xiàn),非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑camostat處理后,SARS冠狀病毒對Calu3細胞的感染相比較未處理的對照組降低了90%[24]。

基于以上信息,我們推測TMPRSS2可能成為抗SARS-CoV-2感染的潛在靶點。我們前期通過研究TMPRSS2蛋白酶存在的幾種形式,發(fā)現(xiàn)TMPRSS2會通過自剪切發(fā)揮酶活,并且確認了野生型TMPRSS2在具有酶活的狀態(tài)下仍然錨定在膜上,提示TMPRSS2可以作為一種阻斷病毒進入的細胞表面靶點。因此,我們純化了酶活位點和剪切位點雙突變的TMPRSS2重組蛋白,該重組蛋白通過與Calu3細胞表面具有酶活性的TMPRSS2競爭性結(jié)合SARS-CoV-2的S蛋白,抑制宿主細胞表面的TMPRSS2對病毒S蛋白的裂解激活,從而阻斷病毒與宿主細胞的膜融合,進而阻斷SARS-CoV-2的感染。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人胚腎細胞系HEK293T購自武漢普建生物科技有限公司,在37℃、5%CO2培養(yǎng)條件下,傳代于有1%青霉素-硫酸鏈霉素和10%胎牛血清的高糖 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培養(yǎng)基中。人肺腺癌細胞系Calu3購于上海富衡細胞庫,在37℃、5%CO2培養(yǎng)條件下,傳代于有1%青霉素-硫酸鏈霉素和10%胎牛血清的高糖 MEM(Modified Eagle’s Medium)培養(yǎng)基中。HeLa細胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection,ATCC),在 37℃、5%CO2培養(yǎng)條件下,傳代于有1%青霉素-硫酸鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中。人結(jié)腸腺癌細胞系Caco2購自ATCC,在37℃、5%的CO2培養(yǎng)條件下,傳代于有1%青霉素-硫酸鏈霉素、10%胎牛血清和1%丙酮酸鈉的MEM培養(yǎng)基中。人胚腎懸浮細胞FreeStyleTM293F購于賽默飛世爾科技公司,利用緩沖底三角培養(yǎng)瓶,在37℃、5%的CO2、120 r/min懸浮培養(yǎng)箱條件下,傳代于FreeStyleTM293F表達培養(yǎng)基中。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

PLVX-FLAG-TMPRSS2-Puro購自武漢淼靈生物科技有限公司,在它的基礎(chǔ)上將255位氨基酸AGG點突變?yōu)镃AG,得到PLVX-FLAG-TMPRSS2-R255Q-Puro質(zhì)粒,在此突變的基礎(chǔ)上將441位氨基酸AGT點突變?yōu)镚CT,得到PLVXFLAG-TMPRSS2-R255Q+S441A-Puro。隨后,以雙突變的PLVX-FLAG-TMPRSS2-R255Q+S441APuro為模板,使用限制性內(nèi)切酶Sac Ⅰ(GAGCTC)和Xho Ⅰ(CTCGAG),將雙突變的TMPRSS2構(gòu)建到pINFUSE-hIgG2-FC蛋白表達載體(購自Invivo-GEN公司)上。所需引物見表1。

表1 主要引物信息Table 1 The sequences of primers in this study

1.3 TMPRSS2重組蛋白的表達和純化

為制備TMPRSS2(106-492)R225Q+S441A-FC蛋白,將293F細胞擴培至300 mL,當密度達到2×106mL-1時平均分到兩個搖瓶中,每個搖瓶中150 mL,向每個搖瓶中各補120 mL新鮮培養(yǎng)基至270 mL的終體積。隨后,使用轉(zhuǎn)染試劑Polyplus FectoPRO(購自法國Polyplus Transfection公司),按照如下條件:轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒(μg)∶總培養(yǎng)基(mL)=1∶2;轉(zhuǎn)染試劑(μL)∶質(zhì)粒(μg)=1.5∶1;輔助轉(zhuǎn)染試劑Booster在培養(yǎng)基中的用量為0.45 μL/mL,瞬時轉(zhuǎn)染表達質(zhì)粒pINFUSE-TMPRSS2(106-492)R225Q+S441A-hIgG2-FC(含該蛋白質(zhì)編碼序列)。處理3 d后,檢測細胞活率,收集部分上清液,初步檢測蛋白質(zhì)在上清中的表達;6 d后,收集上清液,用Protein G柱(GE Healthcare)經(jīng)親和層析純化可溶性蛋白。

1.4 免疫印跡

向瞬時轉(zhuǎn)染了TMPRSS2三種突變體的HEK-293T細胞中加入IP-Buffer裂解液(本實驗室配制),冰上裂解30 min。12 000 r/min離心10 min,取上清液到新的EP管中,棄沉淀,加適量的5×上樣緩沖液(本實驗室配制),95℃加熱5 min,通過SDSPAGE將蛋白質(zhì)條帶分離開來。將凝膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到甲醇激活的PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜完成后分別使用脫脂牛奶封閉1 h,采用特異性的一抗(圖1A中的一抗為購自日本GNI公司的anti-Flag monoclonal antibody;圖1B中的一抗為購自武漢普建生物科技有限公司的anti-mouse IgGFC antibody),按照1∶1 000的比例用脫脂牛奶配制后于4℃孵育過夜,利用對應(yīng)的二抗(圖1中的二抗都是購自賽默飛世爾科技公司的goat antimouse IgG(H+L)secondary antibody,HRP),按照1∶2 000的比例用脫脂牛奶配制后在常溫孵育2 h,隨后使用化學發(fā)光顯影液,將PVDF膜置于ChemiDocTMXRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光,結(jié)果圖片使用Image Lab進行分析。

1.5 免疫熒光顯微技術(shù)

將HeLa細胞種至直徑1.5 cm的孔板中,待細胞密度達到40%～50%時,用pH 7.4的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌。用4%多聚甲醛固定細胞30 min,再用0.5%Triton X-100溶液處理細胞20 min,然后加入5%的牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)作為阻斷緩沖液,室溫封閉1 h。加入用5%BSA溶液稀釋的一抗(1∶1 000)于4℃孵育過夜,吸棄一抗后,加入帶熒光的二抗FITC。實驗所用的一抗為AbclonalhTMPRSS2 Ab,相應(yīng)的FITC標記的二抗(1∶500)購自Beyotime Biotechnology。細胞核使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)于室溫下避光染色15 min,然后在OLYMPUS FV3000共聚焦顯微鏡下進行觀察。

1.6 SARS-CoV-2假病毒的包裝

SARS-CoV-2假病毒是使用VSV假病毒系統(tǒng)生產(chǎn)的[25]。在轉(zhuǎn)染前一天,制備HEK293T細胞,調(diào)整細胞密度為5×105mL-1,其中15 mL轉(zhuǎn)入T75細胞培養(yǎng)瓶中,在37℃、5%的CO2條件培養(yǎng)箱中孵育過夜。當過夜培養(yǎng)的細胞達到70%～90%的密度時,將表達刺突蛋白S的DNA質(zhì)粒(購自北京義翹神州科技有限公司)與psPAX2(購自Addgene公司)、pLenti-Luc2(購自武漢淼靈生物科技有限公司)按照1∶1∶2的質(zhì)量比進行轉(zhuǎn)染。6 h后,用新鮮的含有1%青霉素-硫酸鏈霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基替換,再孵育36 h,收集含有假病毒的培養(yǎng)上清液,離心后過濾(孔徑為0.45 μm),并在-80℃下保存待用。

1.7 感染程度的測定

在假病毒的包裝過程中,我們將熒光素酶的序列加入到系統(tǒng),故該假病毒也可以表達熒光素酶,該熒光素酶可以與熒光素酶的底物反應(yīng),通過熒光強度顯示病毒感染細胞的效率。假病毒感染前24 h,將HEK293T、Calu3或Caco2細胞接種于96孔板(JET BIOFIL),每孔1×104個細胞。待第2天細胞貼壁后,將包裝好的假病毒上清每孔100 μL加入到種好細胞的96孔板內(nèi),細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后,吸棄上清,再向96孔板中每孔加入30 μL的細胞裂解液,冰上裂解30 min,隨后收集裂解液到1.5 mL EP管中,12 000 r/min離心5 min,取5 μL上清液與熒光素酶底物20 μL混合,15 s內(nèi)用LUMINOMETER機器檢測混合物的熒光。

1.8 中和實驗測試

在假病毒感染前,每孔1×104個Calu3細胞接種于96孔板(JET BIOFIL)。將TMPRSS2重組蛋白按照30 μg/mL的量加入Calu3細胞中。37℃孵育1 h后,將100 μL的SARS-CoV-2假病毒加入混合物中孵育36 h。取熒光素酶底物(20 μL/孔)至1.5 mL EP管中,再向EP管中加5 μL細胞裂解上清?；靹蚝髮P管轉(zhuǎn)移到LUMINOMETER中,通過測定生物發(fā)光來確定其感染能力。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差(x±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析,顯著性水平為P＜0.05。采用Prism計算機軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 TMPRSS2突變體的構(gòu)建及蛋白質(zhì)純化

報道顯示,TMPRSS2的實際裂解位點是Arg-255-Ile-256鍵,如果蛋白酶活性結(jié)構(gòu)域催化三聯(lián)體中的第441位絲氨酸突變?yōu)楸彼?S441A),則TMPRSS2失去蛋白酶活性[26]。

基于這一報道,我們構(gòu)建了TMPRSS2突變體重組蛋白。該重組蛋白不具有蛋白酶活性,也不會發(fā)生自剪切,是TMPRSS2全長的胞外段。我們在HEK293T中分別過表達野生型和突變型的TMPRSS2,結(jié)果顯示,在野生型的TMPRSS2(WTTMPRSS2)中明顯觀察到細胞相關(guān)的C端切割片段,但在TMPRSS2的R255Q(剪切位點)突變體和S441A(酶活位點)突變體以及二者的雙突變體中只能觀察到很少的切割(圖1A),這證實了TTSPTMPRSS2的剪切形式確實是通過自催化活性產(chǎn)生的。我們在HEK293T中過表達R255Q、S441A和R255Q+S441A這3種TMPRSS2突變體蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)這3種蛋白質(zhì)大多數(shù)都作為全長70 kD的酶原形式存在(圖1A)。該結(jié)果與之前的報道相一致,TTSPs是作為非活性的單鏈原酶(酶原)合成的,在運輸?shù)郊毎砻嫫陂g或之后發(fā)生自裂解,形成活性形式[26～27]。

隨后,我們在真核細胞293F中表達雙突變體的TMPRSS2蛋白,轉(zhuǎn)染6 d后收集細胞上清,發(fā)現(xiàn)雙突變的TMPRSS2重組蛋白能正常表達,并且以全長二聚體的形式分泌到上清中(圖1B)。

圖1 TMPRSS2突變體的構(gòu)建及蛋白質(zhì)純化(A)TMPRSS2的自剪切形式。將野生型TMPRSS2及3種突變體瞬時轉(zhuǎn)染進HEK293T細胞,48 h后收集細胞冰上裂解,Western-blot技術(shù)分析帶FLAG標簽的幾種TMPRSS2突變體蛋白質(zhì)條帶的位置,最右側(cè)條帶為蛋白質(zhì)marker;(B)TMPRSS2重組蛋白的純化。將構(gòu)建成功的(從左到右)WT-TMPRSS2-FC、TMPRSS2-R255Q-FC、TMPRSS2-S441A-FC和TMPRSS2-R225Q+S441A-FC的pINFUSE表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293F細胞中,6 d后收集細胞培養(yǎng)上清,提純蛋白質(zhì)后進行Westernblot分析,最右側(cè)條帶為蛋白質(zhì)marker。Fig.1 Construction and protein purification of TMPRSS2 mutant(A)Self-shearing form of TMPRSS2.The wild-type TMPRSS2 and three mutants were transiently transfected into HEK293T cells.The cells were collected for ice lysis 48 h later.The TMPRSS2 mutants labeled with FLAG were analyzed by Westernblot.The rightmost lane is the protein marker;(B)Purification of TMPRSS2 recombinant protein.The constructed pINFUSE plasmids expressing WT-TMPRSS2-FC,TMPRSS2-R255Q-FC,TMPRSS2-S441A-FC and TMPRSS2-R225Q+S441A-FC were transfected into 293F cells.Six days later,the purified proteins were collected from the supernatants of cell cultures and analyzed by Western-blot.The right most lane is the protein marker.

2.2 假病毒感染宿主細胞體系的建立

為了研究純化的TMPRSS2突變體重組蛋白對SARS-CoV-2的抑制活性,我們在體外構(gòu)建了假病毒感染細胞的體系:構(gòu)建SARS-CoV-2 S蛋白攜帶水皰性口炎病毒(ΔG-VSV/熒光素酶)假病毒用作細胞感染。VSVG(皰疹性口腔炎病毒糖蛋白G)是一種包膜蛋白,因為這種抗原在很多細胞表面都能找到對應(yīng)的受體,所以這個包膜蛋白具有廣泛的宿主范圍。病毒通過包膜蛋白與宿主細胞識別后,繼而通過內(nèi)吞作用進入細胞。因此,本研究使用VSVG作為病毒能夠感染進宿主細胞的陽性對照。

用包裝好的VSVG和SARS-CoV-2假病毒分別感染HEK293T細胞系、Calu3細胞系和Caco2細胞系。曾有文獻報道,ACE2的融合蛋白對病毒感染具有顯著的阻斷效果[28]。因此我們使用純化的人的ACE2融合蛋白作為阻斷病毒感染的陽性對照。圖2的結(jié)果顯示:在HEK293T細胞系和Calu3細胞系中,病毒感染率較高,且感染能被ACE2融合蛋白顯著阻斷。相關(guān)文獻報道,Calu3細胞系中有內(nèi)源性的TMPRSS2穩(wěn)定表達,而HEK239T中沒有TMPRSS2的表達[1];在本研究中,圖2的結(jié)果顯示,假病毒感染Caco2細胞的效率較低。因此,我們最終選定Calu3細胞系作為TMPRSS2研究的主要細胞載體,并使用目前的病毒感染體系用于后續(xù)的研究。

圖2 假病毒感染宿主細胞體系的建立SARS-CoV-2假病毒是使用VSV假病毒系統(tǒng)生產(chǎn)的[25]。用包裝好的VSVG和SARS-CoV-2假病毒依次感染HEK293T、Calu3和Caco2這3種細胞系,將hACE2-Fc融合蛋白按照30 μg/mL的量加入宿主細胞以阻斷SARS-CoV-2假病毒的感染,vector和VSVG分別用作病毒感染進細胞的陰性和陽性對照(***:P＜0.001;****:P＜0.000 1)。Fig.2 Establishment of host cell system infected with pseudovirusSARS-CoV-2 pseudovirus was produced using VSV pseudovirus system[25].The HEK293T,Calu3 and Caco2 cell lines were infected with packaged VSVG and SARS-CoV-2 pseudovirus successively.The hACE2-Fc fusion protein was added into host cells at a concentration of 30 μg/mL to block the infection of SARS-CoV-2 pseudovirus.The vector and VSVG were used as negative and positive controls,respectively,for virus infection of cells(***:P＜0.001;****:P＜0.000 1).

2.3 TMPRSS2重組蛋白能夠阻斷SARS-CoV-2假病毒的感染

相關(guān)研究報道,非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑camostat處理,可使SARS冠狀病毒對Calu3細胞的感染相比較未處理的對照組降低90%[24]。這在我們的實驗結(jié)果中也得到了證實:camostat抑制劑能夠顯著阻斷SARS-CoV-2假病毒感染細胞(圖3A)。圖3B顯示,我們純化的人的R255Q和S441A雙突變TMPRSS2重組蛋白(hTMPRS-S2-Fc)也能抑制SARS-CoV-2病毒的感染,但是其抑制效果并不像camostat抑制劑那樣顯著,其原因可能是:在病毒感染的過程中,S蛋白的激活除了依賴TMPRSS2蛋白酶,還有可能依賴其他的蛋白酶,例如組織蛋白酶B/L(已有文獻報道,組織蛋白酶B/L的抑制劑也能有效阻斷SARS-CoV-2病毒的感染)[16]。綜上所述,TMPRSS2在病毒感染過程中發(fā)揮了重要的作用,很有可能成為阻斷病毒感染的潛在靶點。

圖3 TMPRSS2重組蛋白阻斷假病毒的感染(A)TMPRSS2抑制劑阻斷SARS-CoV-2假病毒感染的效果。將TMPRSS2抑制劑camostat按照2 μmol/L、10 μmol/L和50μmol/L的梯度加到鋪有Calu3細胞的96孔板中,37℃孵育1 h后,將100 μL的SARS-CoV-2假病毒上清加入混合物中孵育36 h,通過測定生物發(fā)光來確定其感染能力。*:P＜0.05,**:P＜0.01;(B)TMPRSS2重組蛋白阻斷SARS-CoV-2假病毒感染的效果。將TMPRSS2雙突變重組蛋白和hACE2-Fc融合蛋白按照30 μg/mL的量加到鋪有Calu3細胞的96孔板中,37℃孵育1 h后,將100 μL的SARS-CoV-2假病毒上清加入混合物中孵育36 h,通過測定生物發(fā)光來確定其感染能力。**:P＜0.01,****:P＜0.000 1。Fig.3 Prevention of pseudovirus infection by TMPRSS2-Fc protein(A)The blocking effect of TMPRSS2 inhibitors on pseudovirus infection.Camostat,a TMPRSS2 inhibitor,was added into the 96-well plate of Calu3 cells at a gradient level(2 μmol/L,10 μmol/L and 50 μmol/L).After incubation at 37 ℃ for 1 h,100 μL SARS-CoV-2 pseudovirus supernatant was added into the mixture and incubated for 36 h.The infectivity was determined by bioluminescence measurements.*:P＜0.05,**:P＜0.01;(B)The blocking effect of TMPRSS2-Fc protein on pseudovirus infection.The double mutanted TMPRSS2 recombinant protein and hACE2-Fc fusion protein were added into the 96-well plate of Calu3 cells at a concentration of 30 μg/mL.After incubation at 37 ℃ for 1 h,100 μL SARS-CoV-2 pseudovirus supernatant was added into the mixture and incubated for 36 h.The infectivity was determined by bioluminescence measurements.**:P＜0.01,****:P＜0.000 1.

2.4 野生型TMPRSS2定位在HeLa細胞表面

TMPRSS2是Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶,屬于TTSPs家族,表達在細胞質(zhì)膜上,其絲氨酸蛋白酶活性區(qū)域位于C端胞外段[3]。TMPRSS2作為一種膜蛋白,在病毒入侵宿主細胞時發(fā)揮酶活,切割并激活病毒的S蛋白。我們假設(shè)TMPRSS2作為一種膜蛋白,能夠成為宿主細胞表面阻斷病毒感染的靶點。因此,我們在HeLa細胞中過表達野生型的TMPRSS2,并使用TMPRSS2的特異性一抗與HeLa細胞孵育,隨后用FITC綠色熒光二抗標記TMPRSS2,最后在FV3000共聚焦顯微鏡下觀察TMPRSS2的細胞定位情況。我們發(fā)現(xiàn),野生型的TMPRSS2定位在細胞膜表面(圖4),證明TMPRSS2在細胞膜上的穩(wěn)定表達確實能夠作為阻斷病毒入侵的潛在靶點,這為未來針對TMPRSS2的藥物研發(fā)提供了新的思路。

圖4 野生型TMPRSS2定位在HeLa細胞表面瞬時轉(zhuǎn)染PLVX-M2-FLAG到HeLa細胞,使用Abclonal-hTMPRSS2 Ab一抗及相應(yīng)的FITC標記的二抗進行免疫熒光染色,然后在FV3000共聚焦顯微鏡下進行觀察。比例尺:5 μm。Fig.4 Wild-type TMPRSS2 localization on the surface of HeLa cellsPLVX-M2-FLAG was transiently transfected into HeLa cells.The primary antibody was Abclonal-hTMPRSS2 Ab,and the corresponding FITC-labeled secondary antibody was used for immunofluorescence staining.Then observation was performed under FV3000 confocal microscope.Scale bar:5 μm.

3 討論

本研究表明,TMPRSS2雙突變的重組蛋白能有效抑制SARS-CoV-2假病毒感染Calu3細胞,這和非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑camostat的功能基本一樣,二者都能夠有效抑制SARS-CoV-2假病毒感染細胞。有報道稱,在TMPRSS2敲除的細胞中,SARS-CoV的S蛋白可以利用內(nèi)吞體半胱氨酸蛋白酶CatB/L啟動S蛋白[16]。然而,由TMPRSS2,而不是CatB/L,啟動的S蛋白是病毒通過受體進入原代靶細胞感染宿主細胞的必要條件[1]。我們的研究發(fā)現(xiàn),SARS-CoV-2假病毒感染Calu3細胞能夠被TMPRSS2重組蛋白和camostat不同程度的抑制,但不能完全阻斷,這可能是因為除了TMPRSS2以外,CatB/L也可以激活SARSCoV-2的S蛋白,從而促進SARS-CoV-2病毒的感染[16]。總的來說,根據(jù)已有的文獻,TMPRSS2是一種宿主細胞因子,對包括甲型流感病毒和冠狀病毒在內(nèi)的幾種臨床相關(guān)病毒的傳播至關(guān)重要[29～30];相比之下,TMPRSS2對于宿主細胞的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)并不是不可或缺的[31],因此,封閉或者干涉TMPRSS2的功能為抗新型冠狀病毒感染的研究提供了新的思路。雖然絲氨酸蛋白酶抑制劑camostat可以阻斷TMPRSS2的活性,在日本也已被批準用于人新型冠狀病毒感染治療的臨床試驗,但患者出現(xiàn)了嚴重的副反應(yīng)。因此,該化合物仍需進行改構(gòu)以降低副作用,從而用于治療SARS-CoV-2感染患者[32]。相比較之下,TMPRSS2蛋白顯示出較好的阻斷效果。TMPRSS2重組蛋白的治療可能規(guī)避掉抑制劑化合物對人體造成的嚴重副作用。在未來,研究人員還可以篩選出TMPRSS2特異性的封閉抗體,從而阻斷病毒的感染?？傊?該研究為阻斷SARS-CoV-2感染的第一步——病毒進入細胞提供了新的見解,并確定了TMPRSS2很有可能成為抗新型冠狀病毒干預(yù)的潛在靶點。