基于UPLC特征圖譜結合多模式識別和色度值的槐角炮制前后差異研究

鄧李紅，王壽富，陳仕妍，鄺 敏，黃貴發，林偉雄，張志鵬

基于UPLC特征圖譜結合多模式識別和色度值的槐角炮制前后差異研究

鄧李紅，王壽富，陳仕妍，鄺 敏，黃貴發，林偉雄*，張志鵬

廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244

測定槐角炮制前后的超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜和色度值，結合不同模式識別方法比較槐角炮制前后的差異性，為槐角和蜜槐角的質量控制及評價提供參考。采用UPLC法對槐角炮制前后樣品進行測定，按《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對色譜圖進行匹配生成槐角炮制前后的UPLC特征圖譜，并對炮制前后的色度值（、、）進行測定，通過相似度分析、對照品比對、方差分析、聚類分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）對槐角炮制前后進行多模式識別研究。建立了槐角炮制前后的UPLC特征圖譜，槐角和蜜槐角分別確定了23、24個共有峰，指認2、15、16、20、21號峰為沒食子酸、蘆丁、染料木苷、槲皮苷、槐角苷，炮制后新增成分24號峰為5-羥甲基糠醛；相似度分析結果顯示槐角炮制前后相似度均大于0.98，聚類分析結果顯示槐角炮制前后區分不明顯，PCA可以將槐角和蜜槐角大致分為2類，OPLS-DA分析可將槐角和蜜槐角明顯區分為2類，且結果顯示1、2、10、22、23、24號峰是引起槐角和蜜槐角間成分差異的主要標志性成分，與方差分析結果一致；色度值Δ范圍為5～13，炮制前后色差可被肉眼識別。建立的多指標特征圖譜和色度值鑒別方法對槐角藥材及其炮制品的質量控制及整體性評價具有重要意義。

槐角；蜜槐角；UPLC特征圖譜；方差分析；沒食子酸；蘆丁；染料木苷；槲皮苷；槐角苷；5-羥甲基糠醛

槐角始載于《神農本草經》，列為上品，為豆科植物槐L.的干燥成熟果實，味苦，性寒，歸肝、大腸經，具有清熱瀉火、涼血止血等功效。用于腸熱便血、痔腫出血、肝熱頭痛、眩暈目赤等病癥[1]。現代研究證明，槐角中主要含有黃酮、異黃酮、生物堿、三萜皂苷、氨基酸和磷脂類等多種化學成分[2-4]，其中以黃酮和異黃酮化合物含量最高[5]，主要有槐角苷、槐角雙苷、染料木苷、染料木素、蘆丁等[6-8]。槐角生品清熱涼血力較強，用于血熱妄行出血證，肝火目赤、肝熱頭痛、眩暈、陰瘡濕癢等癥；亦用于腸熱便血和痔腫出血。槐角炮制后苦寒之性減弱，具有緩和藥性兼具潤腸通便的作用，用于便血、痔血，尤其適用于脾胃不健或兼有便秘的患者[9-10]。

目前，關于槐角和蜜槐角的研究多集中于炮制工藝及染料木苷、槐角苷、蘆丁等黃酮類成分的含量測定上[11-14]，均以單個或多個含量指標表征槐角炮制前后的差異性，但不足以作為全面而準確地反映槐角炮制前后差異的主要變量指標，有必要對槐角炮制前后化學成分進行全面系統的分析。本研究采用超高效液相色譜法建立槐角炮制前后UPLC特征圖譜，并運用方差分析、聚類分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）與正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等多模式識別方法對UPLC特征圖譜中多指標變量進行統計分析，同時增加飲片粉末色度值（、、）的變化加以輔助分析，可有效區分槐角炮制前后的主要共性和差異性成分，為其藥效物質基礎及質量控制研究奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；KQ-500DE型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；111B型二兩裝高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）；MiliQ Direct 8型超純水機（德國Merck有限公司）。

1.2 藥品與試劑

5-羥甲基糠醛（質量分數99.20%，批號111626-201912）、沒食子酸（質量分數90.8%，批號110831-201906）、蘆丁（質量分數91.7%，批號100080-201811），染料木苷（質量分數99.9%，批號111709-201702）、槲皮苷（質量分數90.6%，批號111538-201606）、槐角苷（質量分數99.6%，批號111695-201703）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜級，其余試劑為分析純，水為超純水。

16批槐角藥材（編號H1～H16）經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定本品為豆科植物槐L.的干燥成熟果實，相應的16批蜜槐角（編號M1～M16）為實驗室嚴格按照《中國藥典》2020年版一部槐角項下蜜槐角炮制規定[1]進行炮制，來源信息見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）- 0.4%醋酸溶液（B），梯度洗脫，0～2 min，2% A；2～6 min，2%～5% A；6～8 min，5%～15% A；8～18 min，15%～22% A；18～20 min，22%～30% A；20～29 min，30%～40% A；29～30 min，40%～2% A；檢測波長282 nm；體積流量0.2 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量1 μL。

表1 16批槐角和蜜槐角來源信息

Table 1 Source information of 16 batches of Sophorae Fructus and its processed products

槐角編號蜜槐角編號產地槐角編號蜜槐角編號產地 H1M1安徽H9M9河北 H2M2山西H10 M10河北 H3M3安徽H11 M11河北 H4M4安徽H12 M12山東 H5M5安徽H13 M13河北 H6M6安徽H14 M14河北 H7M7安徽H15 M15山東 H8M8山東H16 M16河北

2.2 對照品溶液的制備

取5-羥甲基糠醛、沒食子酸、蘆丁、染料木苷、槲皮苷和槐角苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成分別含30.85 μg/mL 5-羥甲基糠醛、47.35 μg/mL沒食子酸、55.07 μg/mL蘆丁、57.39 μg/mL染料木苷、50.10 μg/mL槲皮苷和53.04 μg/mL槐角苷的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率300 W，頻率10 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質量，以50%甲醇補足減失質量，搖勻，采用0.22 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密稱取編號為M9的樣品1份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄色譜圖。選取峰面積較大且為槐角指標性成分[1]的21號峰槐角苷峰作為參照峰，計算各特征峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.06%，相對峰面積的RSD為0.02%～2.19%。

2.4.2 穩定性試驗 精密稱取編號為M9的樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h時，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以21號峰槐角苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.16%，相對峰面積的RSD為0.11%～3.76%。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取編號為M9的樣品6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以21號峰槐角苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間的RSD為0.01%～0.09%，相對峰面積的RSD為0.01%～4.47%。

2.5 UPLC特征圖譜研究

2.5.1 UPLC特征圖譜的建立 按“2.3”項下方法分別制備16批槐角和蜜槐角供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對色譜圖進行匹配，建立槐角和蜜槐角的特征圖譜。分別以H1和M1圖譜作為參照圖譜，設置時間窗寬度為0.1 min，通過多點校正、全譜峰匹配分別生成16批槐角和蜜槐角的共有特征圖譜，同時采用中位數法分別生成對照特征圖譜。16批槐角共有特征圖譜中共標定了23個共有峰，16批蜜槐角中共標定了24個共有峰，其中24號峰為槐角炮制后生成。共有特征圖譜見圖1，對照特征圖譜見圖2。

圖1 槐角(A)和蜜槐角(B) 的UPLC特征圖譜

圖2 槐角(a) 和蜜槐角(b) 的對照特征圖譜

2.5.2 色譜峰的指認 取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，見圖3。通過對比圖3與圖2，指認出槐角和蜜槐角UPLC特征圖譜中的2號峰為沒食子酸、15號峰為蘆丁、16號峰為染料木苷、20號峰為槲皮苷、21號峰為槐角苷，蜜槐角UPLC特征圖譜中的24號峰為5-羥甲基糠醛。

2.5.3 UPLC特征圖譜的相似度評價 根據《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）分析軟件，計算每批樣品特征圖譜相似度，每批槐角與其對照特征圖譜相似度分別為0.993、0.997、0.996、0.999、0.997、0.997、0.996、0.999、0.998、0.996、0.997、0.999、0.988、0.999、0.999、0.988，蜜槐角與其對照特征圖譜相似度分別為0.995、0.997、0.997、0.998、0.997、0.998、0.996、0.998、0.998、0.998、0.999、1.000、0.987、0.998、1.000、0.987，表明不同批次槐角與蜜槐角質量一致性較好；每批槐角與蜜槐角對照特征指紋圖譜相似度分別為0.993、0.997、0.996、0.999、0.997、0.997、0.996、0.998、0.998、0.995、0.996、0.998、0.988、0.998、0.998、0.988，每批蜜槐角與槐角對照指紋圖譜相似度分別為0.995、0.996、0.996、0.997、0.996、0.996、0.996、0.998、0.998、0.998、0.998、0.999、0.986、0.998、0.999、0.986，同批次槐角與蜜槐角相似度分別為1.000、0.997、0.998、0.999、0.999、0.998、0.999、0.999、0.999、0.998、0.999、0.998、0.999、0.999、0.998、0.999，且槐角對照特征圖譜與蜜槐角對照特征圖譜相似度為0.999，相似度均高于0.98，根據特征圖譜相似度結果，完全無法區分槐角與蜜槐角。

2-沒食子酸 15-蘆丁 16-染料木苷 20-槲皮苷 21-槐角苷 24-5-羥甲基糠醛

2.6 槐角與蜜槐角UPLC特征圖譜多元統計分析

2.6.1 方差分析 采用SPSS 20.0軟件對16批槐角和蜜槐角共有特征峰的單位峰面積進行單因素方差分析。結果顯示，槐角與蜜槐角的2、10、23號峰的單位峰面積差異均有顯著統計學意義（＜0.05），1、22號峰的單位峰面積差異有極顯著統計學意義（＜0.01）。經過炮制后，1、2號峰的單位峰面積顯著增加，10、22、23號峰的單位峰面積顯著下降，其余各特征峰單位峰面積無顯著變化，24號峰在16批槐角中未檢出，經炮制后產生，增長率為100%。16批槐角和蜜槐角特征圖譜共有峰單位峰面積的方差分析結果見表2。

2.6.2 聚類分析 聚類分析是一種無監督模式識別方法，將槐角和蜜槐角樣本數據在沒有先驗知識的前提下，基于樣品所表現的各特征峰單位峰面積的變量特征，按照相似度進行歸類，可直觀地得到槐角和蜜槐角的樣本分類結果[15]。以24個共有峰單位峰面積為變量，采用Origin 2018軟件以Ward連接法結合Euclidean距離進行聚類分析。結果顯示（圖4），槐角和蜜槐角樣品無法較好地聚類，其中H1與M1、H5與M5、H7與M7、H8與M8樣品完全聚在一起，其余槐角樣品、蜜槐角樣品部分批次可分別聚在一起，表明槐角和蜜槐角樣品相似度高，區分不明顯。

2.6.3 PCA與OPLS-DA分析 PCA是一種無監督的多元統計分析方法，其主要是通過數學降維的原理，從槐角和蜜槐角原數據中提取幾個具代表的綜合性指標，根據貢獻率大小代替多個原始變量，因此在相似度分析的基礎上，可進一步采用主成分分析對槐角炮制前后進行比較[15-16]。

以24個共有峰單位峰面積為變量，采用SIMCA（14.0）軟件對槐角和蜜槐角樣品進行PCA分析，結果提取到6個特征值大于1的主成分（PC），可用于反映槐角和蜜槐角UPLC特征圖譜91.75%以上信息，其中PC1貢獻率為45.29%，貢獻率最大，PC2貢獻率為16.30%，PC3貢獻率為12.09%，見表3。由前3個主成分建立坐標系，得到槐角和蜜槐角的PCA得分圖（圖5），由圖可見，在相似度大于0.9的基礎上，槐角和蜜槐角樣品能夠分別集中地聚在一起，說明提取到的前3個主成分已能反映出槐角炮制前后的主要特征，可區分槐角和蜜槐角樣品。

PCA可以直觀地區分出槐角和蜜槐變量間的差異程度，但為更好地觀察2組間的差異，基于PCA結果，采用監督模式識別法進行兩組間OPLS-DA分析，繪制OPLS-DA模型得分圖，計算出對差異貢獻較大的因素，尋找槐角炮制前后主要的差異成分。通過OPLS-DA得分圖發現，槐角與蜜槐角明顯集中分布在2個象限，槐角在模型得分圖的左側，蜜槐角在右側，與PCA分析結果較為一致，表明其化學成分具有一定差異性。

表2 槐角和蜜槐角特征圖譜共有峰單位峰面積方差分析結果()

與槐角比較*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01

圖4 槐角和蜜槐角聚類分析樹狀圖

表3 特征值和累積方差貢獻率

Table 3 Eigenvalues and cumulative variance contribution rates

成分特征值方差貢獻率/%累積方差貢獻率/% 110.86945.28945.289 2 3.91316.30361.592 3 2.90112.08973.681 4 1.674 6.97480.654 5 1.562 6.50887.162 6 1.101 4.58691.748

圖5 槐角和蜜槐角的PCA分析得分圖

OPLS-DA模型中的擬合參數2＝0.791，2＝0.920，模型預測參數（2）＝0.842，均大于0.5，表明所建模型穩定且預測能力較強[15]。以模型變量投影（VIP）值為指標對引起槐角和蜜槐角組間差異的成分進行分析，篩選貢獻較大的6個變量（以VIP值＞1為標準），分別為1號峰（VIP＝1.932 7）、24號峰（VIP＝1.901 8）、22號峰（VIP＝1.417 9）、10號峰（VIP＝1.332 5）、23號峰（VIP＝1.128 9）和2號峰（VIP＝1.120 4），提示上述6個成分是引起槐角和蜜槐角間成分差異的主要標志性成分，其余峰VIP值小于1，對樣品的區分影響較小，與方差分析結果一致。見圖6、7。

2.7 槐角與蜜槐角色度值分析

取16批槐角和蜜槐角粉末適量，壓制于載玻片上，壓制厚度約為1 mm，以國際照明委員會認可的D65光源作為光源，白色作為背景，對粉末圖像進行色彩采集，采用Adobe Photoshop CS6軟件讀取飲片粉末色度值（、、），平行3次，取平均值，色度值見表4。Lab色彩模式中L值表示物體明度指數，（紅-綠軸）、（黃-藍軸）值代表色品指數，樣品顏色可用總色值（）表達。

圖6 槐角和蜜槐角的OPLS-DA得分圖

圖7 槐角和蜜槐角24個共有峰的VIP值

＝(2＋2＋2)1/2

明度差（Δ）與色差（Δ）用于表達生品到炮制品的顏色變化，當Δ為負值代表樣品顏色明度低、顏色深，為正值則相反；Δ值越大，代表炮制品與生品色度值相差越大，Δ＞3.5時，其色差可被肉眼識別。由表4可知，Δ中正負值均有，無法明顯區分16批次的生品與炮制品，炮制品中整體上較生品明度下降，顏色加深；Δ范圍為5～13，即色差可被肉眼識別，可用于輔助區分同批次槐角生品與炮制品。

3 討論

本實驗考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、50%乙醇、70%乙醇等提取溶劑，結果表明，選擇乙醇系統作為提取溶劑時，1和24號峰5-羥甲基糠醛的色譜峰峰形內陷，以甲醇作為提取溶劑系統且以50%甲醇作為提取溶劑時各色譜峰的分離效果好且響應值高，故選擇50%甲醇作為提取溶劑；同時考察了不同柱溫（25、30、35 ℃）及不同體積流量（0.2、0.3 mL/min）條件下樣品的UPLC特征圖譜。結果發現柱溫25 ℃、體積流量0.2 mL/min時，樣品分離度較高、峰形對稱，能夠滿足分析要求。

本研究從槐角和蜜槐角共有特征圖譜中直觀得知炮制后1、2號峰的峰面積明顯增加，經方差分析證實1、2號峰的增加具有顯著統計學意義，24號峰5-羥甲基糠醛為槐角炮制后產生。槐角炮制前后各批次樣品間的相似度均大于0.98，依據相似性進行無監督模式聚類分析和PCA，聚類分析顯示槐角炮制前后區分不明顯，PCA分析提取前3個主成分時可以將槐角和蜜槐角大致分為2類，表明在各樣品相似度極高的基礎上通過化學計量學方法進行分析，可有效區分槐角和蜜槐角樣品間的細微差別。通過監督模式識別法進行2組間OPLS-DA分析，能將原始數據中與因變量不相關的信息去除，提高類內聚集性，使類與類之間的差異性得到最大化，結果顯示槐角和蜜槐角明顯區分為2類，且1、2、10、22、23、24號峰是引起槐角和蜜槐角間成分差異的主要標志性成分，與方差分析結果一致。在外觀顏色上通過色差Δ＞3.5，可輔助識別槐角和蜜槐角。化學成分是中藥發揮療效的物質基礎，槐角炮制前后所含各種成分信息無法直觀地通過個體之間的差異展現，本研究所采用的多模式識別結合UPLC特征圖譜和色度值分析模式可區分槐角和蜜槐角樣品間的細微差別，用以解釋測量值與槐角炮制前后體系狀態之間的聯系，可為槐角和蜜槐角質量整體性評價提供依據，也為其他炮制品種的研究提供參考。

表4 槐角和蜜槐角色度值數據

Table 4 Chromatic value data of Sophorae Fructus and its processed products

批次槐角色度值蜜槐角色度值差值 LabELabEΔLΔaΔbΔE 1403274953 32960 130113 2442295244 83155 162 6 3403274942113355 28610 4347234238 92848 435 7 5368274640103051 423 6 6412274942 93153 174 8 7414244739102547 ?261 6 8510305956 43064 430 5 9434285143 93153 053 6 10445285245 93156 244 5 11435295243112953 060 6 12464275441102951 ?562 8 13435305341113253 ?252 6 14434285143 93153 053 6 15464275441102951 ?562 8 16435305341113253 ?252 6

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparative study on UPLC characteristic chromatogram combined with multiple chemical pattern recognition and chromatic value ofand its processed products

DENG Li-hong, WANG Shou-fu, CHEN Shi-yan, KUANG Min, HUANG Gui-fa, LIN Wei-xiong, ZHANG Zhi-peng

Guangdong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Formula Granule, Guangdong Yifang Pharmaceutical Co., Ltd., Foshan 528244, China

To determine Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) characteristic chromatogram and chromatic value ofand its processed products, and to compare their difference according to multiple chemical pattern recognition method, and to provide reference for quality control and evaluation of Huaijiao () and its processed products.and its processed products were determined by UPLC. According to the(2012 edition), the chromatograms were matched to generate the UPLC characteristic chromatogram ofand its processed products, and the chromatic value (,,) before and after fried with honey was determined. The chromatograms ofand its processed products were analyzed according to multiple chemical pattern recognition by variance analysis, cluster analysis, principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA).UPLC characteristic chromatogram ofand its processed products were established respectively, and 23 common peaks were confirmed for; 24 common peaks were confirmed forstir-fried with honey. No. 2, 15, 16, 20, 21 peaks were identified as gallic acid, rutin, genistin, quercitrin and sophoricoside respectively, and the new component No. 24 peaks were identified as 5-hydroxymethylfurfural after fried with honey. The results of similarity analysis showed that the similarity ofand its processed products was greater than 0.98. Cluster analysis showed that there were only a small part of distinctions ofand its processed products, and PCA can roughly divideand its processed products into two categories respectively. PLS-DA can distinguishand its processed obviously, and showed that No. 1, 2, 10, 22, 23, and 24 peaks were the main marker components that caused the differences of chemical components ofand its processed products, which is consistent with the results of variance analysis. The ΔE range of chromatic value was 5—13, and the color difference ofand its processed products can be recognized by the naked eye.The characteristic chromatogram of multiple indicators and chromatic value identification method established in this study has vital significance for to the quality control and overall evaluation ofand its processed products.

;stir-fried with honey; UPLC characteristic chromatogram; variance analysis; cluster analysis; gallic acid; rutin; genistin; quercitrin; sophoricoside; 5-hydroxymethylfurfural

R286.2

A

0253 - 2670(2022)21 - 6881 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.027

2022-03-03

廣東省科技計劃項目（2018B030323004）；“廣東特支計劃”科技創業領軍人才項目（2017TY04R197）

鄧李紅（1995—），女，學士，從事中藥飲片及配方顆粒工藝和質量標準研究。Tel: (0757)85128603 E-mail: denglihongyz@163.com

林偉雄Tel: (0757)85128603 E-mail: linwx2020@163.com

[責任編輯 時圣明]