基于IRS2/PI3K/FOXO4信號通路研究復方仙草顆粒抑制糖尿病腎病足細胞上皮-間充質轉化的作用機制

劉丹寧，黃國東，楊鑫勇，周嫦艷，王亞南

基于IRS2/PI3K/FOXO4信號通路研究復方仙草顆粒抑制糖尿病腎病足細胞上皮-間充質轉化的作用機制

劉丹寧1，黃國東2*，楊鑫勇1，周嫦艷1，王亞南1

1. 廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530000 2. 廣西中醫藥大學附屬國際壯醫醫院，廣西 南寧 530000

基于胰島素受體底物2（insulin receptor substrate 2，IRS2）/磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/叉頭框蛋白O4（forkhead box O4，FOXO4）信號通路探討復方仙草顆粒抑制糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）大鼠腎足細胞上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用機制。采用單側腎切除、高糖高脂飼料喂養及一次性ip鏈脲佐菌素制備DN模型大鼠，另設置對照組和假手術組，將造模成功的大鼠隨機分為模型組、厄貝沙坦（15.75 mg/kg）組和復方仙草顆粒組低、中、高劑量（315.0、472.5、945.0 mg/kg）組，各給藥組ig相應藥物，連續6周。檢測各組大鼠空腹血糖、腎臟指數（kidney index，KI）、尿微量白蛋白/肌酐比值（urinary albumin-to-creatinine ratio，UACR）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察腎組織病理變化；采用透射電鏡（TEM）觀察腎足細胞超微結構變化；采用qRT-PCR和Western blotting檢測大鼠腎組織足細胞裂孔膜蛋白（）、P-鈣黏蛋白（）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，）、、成纖維細胞特異蛋白-1（fibroblast specific protein-1，）及IRS2/PI3K/FOXO4信號通路相關因子mRNA和蛋白表達。與對照組比較，模型組大鼠KI、UACR、BUN水平均顯著升高（＜0.05），腎小球肥大，腎小管廣泛擴張，上皮細胞變性脫落，足突融合或丟失；腎組織nephrin、P-cadherin表達顯著降低（＜0.05），α-SMA、Desmin、FSP-1表達顯著升高（＜0.05），IRS2/PI3K/FOXO4信號通路相關因子mRNA和蛋白表達均顯著降低（＜0.05）。與模型組比較，復方仙草顆粒組大鼠KI、UACR、BUN水平顯著降低（＜0.05），腎臟病理結構和足細胞超微結構明顯改善；腎組織nephrin、P-cadherin表達顯著升高（＜0.05），α-SMA、Desmin、FSP-1表達顯著降低（＜0.05），IRS2/PI3K/FOXO4信號通路相關因子mRNA和蛋白表達均顯著升高（＜0.05）。復方仙草顆粒能夠通過調節IRS2/PI3K/FOXO4信號通路改善DN大鼠腎功能，抑制DN大鼠足細胞EMT，減輕足細胞損傷。

復方仙草顆粒；糖尿病腎病；足細胞；上皮-間充質轉化；胰島素受體底物2/磷脂酰肌醇-3-激酶/叉頭框蛋白O4信號通路

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）作為糖尿病的嚴重并發癥之一，已成為一個日趨嚴重的全球性健康問題，目前我國糖尿病患者大約為9500萬，還有約1.5億患者處于糖尿病前期階段[1]。1型和2型糖尿病均可發展為DN，DN主要由微血管病變引起，是導致糖尿病患者終末期腎功能衰竭甚至死亡的重要因素，但現代醫學針對DN缺乏特異性有效的治療方法[2]。因此，尋找預防和治療的新靶點已成為治療DN急需解決的問題。

高糖誘導的氧化應激、線粒體損傷等導致腎足細胞凋亡和功能損傷，是推進DN發生發展的重要因素。足細胞是腎小球濾過膜的最后一道屏障，蛋白尿是腎小球濾過屏障受損的標志，DN的進展與足細胞功能障礙密切相關，但其作用機制尚未明確[3-4]。上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是DN中足細胞功能障礙和足細胞減少的潛在機制，當受到損傷時，足細胞會發生一系列的表型改變，其高度特化的足細胞標志物如足細胞裂孔膜蛋白（nephrin）、P-鈣黏蛋白（P-cadherin）停止表達，而纖維細胞特異蛋白-1（fibroblast specific protein-1，FSP-1）、Desmin、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）等開始表達[5]。

復方仙草顆粒由八仙草、三七、黃芪、（制）大黃、薏苡仁、甘草組成，有健脾益腎、清熱利濕、活血解毒之功效，是壯醫有效驗方，臨床應用證實該方能夠改善早期DN患者的腎功能、內皮功能、血液流變學及免疫功能[6]，并對IgA腎病起到有效的治療作用[7]；能夠影響腎臟線粒體自噬從而保護腎功能，抑制腎損傷[8]。毒理研究顯示該方安全無毒[9]，并制定了行業質量標準（以人參皂苷Rb1計）[10]。本研究擬從分子細胞水平、基因水平闡述復方仙草顆粒對DN大鼠與EMT相關指標的影響，為復方仙草顆粒的臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，6周齡，體質量（180±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號No.430727211100630627。動物飼養于廣西中醫藥大學SPF級屏障環境內，相對濕度50%～70%，溫度23～26 ℃，自然晝夜節律。動物實驗經廣西中醫藥大學動物倫理委員會批準（批準號DW20210321-056）。

1.2 藥品與試劑

復方仙草顆粒（批號201202，人參皂苷Rb1質量分數為5.89 mg/g，10 g/包）由廣西國際壯醫醫院壯瑤藥研發中心生產；厄貝沙坦（150 mg/片，批號210329JT）購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，批號S8050）購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠尿微量白蛋白ELISA試劑盒（批號RR7B2Q48AG）、胰島素ELISA試劑盒（批號FTNR2NC6Z9）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒（批號C013-2-1）、肌酐試劑盒（批號C011-2-1）購自南京建成生物工程研究所；叉頭框蛋白O4（forkhead box O4，FOXO4）抗體（批號BC106761）、P-cadherin抗體（批號BC041846）、α-SMA抗體（批號BC017554）、Desmin抗體（批號BC032116）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號BC00100134）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抗體（批號BC030815）、FSP-1抗體（批號BC016300）購自武漢Proteintech公司；胰島素受體底物2（insulin receptor substrate 2，IRS2）抗體（批號ab134101）購自英國Abcam公司；提取總RNA試劑盒（批號A6010）購自普洛麥格生物技術有限公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號C31430100）、HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體（批號C31430101）、nephrin抗體（批號AB-11153994）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）抗體（批號bs-3332R）、磷酸化IRS2（phosphorylated IRS2，p-IRS2）抗體（批號bs-5397R）購自北京博奧森生物有限公司。

1.3 儀器

HT7700型透射電子顯微鏡（TEM，日本HITACHI公司）；GA-3型血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；732BR2019型化學發光成像儀、4100624型高通量酶標儀篩選系統（美國Bio Rad公司）；2809152型PCR儀（Biometer公司）；UC7型超薄切片機（德國Leica公司）；58595型超微量紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；05815916001型qRT-PCR儀（瑞士Roche公司）。

2 方法

2.1 DN模型的制備

SD雄性大鼠適應性喂養5 d后，取40只大鼠制備DN模型[11-14]。大鼠喂食高糖高脂飼料，以右側臥位固定于鼠板上，在大鼠耳尖與尾巴連線和右肋弓下緣交點處做1 cm左右的橫行切口，切口后將右腎從切口中推擠出體外，充分暴露右腎，切除右腎，縫合后消毒切口；術后1個月，大鼠禁食不禁水12 h，一次性ip STZ（40 mg/kg），3 d后，連續3 d尾靜脈采血測得血糖≥16.7 mmol/L為DN大鼠。同時連續2次留取24 h尿，測尿微量白蛋白、24 h尿蛋白定量。當24 h尿蛋白定量≥30 mg或尿微量白蛋白與肌酐比值（urinary albumin-to-creatinine ratio，UACR）＞30 mg/g，則認定DN模型成立。另取10只大鼠作為對照組，10只大鼠作為假手術組，對照組不做任何處理，自由進食飲水，用普通飼料喂養；假手術組切口后行暴露左腎縫合切口，并ip 0.1 mmol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。實驗過程中，2只大鼠因術中失血過多死亡，4只大鼠因無法耐受STZ毒性死亡，4只未達DN成模標準予以剔除。

2.2 分組及給藥

根據隨機數表法，將DN大鼠分為模型組、厄貝沙坦（15.75 mg/kg）組和復方仙草顆粒低、中、高劑量（315、472.5、945 mg/kg）組，每組6只。各給藥組ig相應藥物，對照組和模型組ig等體積的蒸餾水，1次/d，連續6周。每周測定1次空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），給藥結束后，留取24 h尿，禁食不禁水12 h，腹主動脈取血；取腎臟，稱定質量，隨后立刻取腎皮質（2 mm×2 mm），置于電鏡固定液中常溫固定2 h后，4 ℃固定24 h；沿腎臟縱軸切開，一半置于4%多聚甲醛溶液中，另一半取腎皮質部分于?80 ℃保存備用。

2.3 大鼠一般情況、腎臟指數（kidney index，KI）及腎功能指標的檢測

觀察給藥前后大鼠的精神狀態、飲食、飲水以及皮毛色澤變化等情況，計算KI；按試劑盒說明書測定血清中BUN和肌酐含量，按ELISA試劑盒說明書測定尿微量白蛋白含量。

KI＝腎臟質量/體質量

2.4 FBG、FINS及HOMA-IR的檢測

末次給藥后，于大鼠進食6～8 h后測量大鼠FBG；按ELISA試劑盒說明書測定空腹胰島素（fasting insulin，FINS）后，計算胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment，HOMA-IR）。

HOMA-IR＝FINS×FBG/22.5

2.5 腎組織病理及足細胞超微結構的檢測

將固定于4%多聚甲醛溶液的腎組織修剪至合適大小，梯度脫水，石蠟包埋，將蠟塊切成4 μm厚度，置于載玻片上，烤片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腎組織病理形態結構。

將固定于電鏡固定液的組織進行梯度脫水，使用丙酮-812包埋劑（1∶1）包埋，丙酮-812包埋劑（1∶2）滲透過夜，37 ℃烤箱過夜，60 ℃烤箱聚合48 h；超薄切片機切片，鈾鉛雙染色，切片室溫干燥過夜，于TEM下觀察足細胞結構，采集圖像后用Image pro plus 6.0軟件進行數據分析。

2.6 免疫組化法檢測腎組織足細胞標志物和EMT標志物蛋白表達

將腎組織切片脫蠟，梯度乙醇水化后，PBS沖洗3次；95 ℃微波抗原修復10 min，PBS沖洗3次；加入山羊血清封閉20 min，分別滴加α-SMA抗體（1∶200）、nephrin抗體（1∶500）、P-cadherin抗體（1∶500）、Desmin抗體（1∶200）、FSP-1抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜；漂洗后，滴加二抗，孵育后沖洗，加入DAB顯色液，二甲苯透明，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察蛋白陽性表達，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析平均吸光度（）值。

2.7 qRT-PCR檢測腎組織足細胞標志物、EMT標志物和IRS2/PI3K/FOXO4信號通路相關因子mRNA表達

取低溫保存的腎組織5～10 mg，放入鋼珠，用冷凍研磨儀將組織研磨成勻漿，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

2.8 Western blotting檢測腎組織足細胞標志物、EMT標志物和IRS2/PI3K/FOXO4信號通路相關蛋白表達

取低溫保存的腎組織20 mg，置于裝有RIPA裂解液的離心管，放入鋼珠，用冷凍研磨儀將組織勻漿（10 000 r/min、5 min），取出鋼珠，冰上裂解20 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，將上清液與5×上樣緩沖液混勻煮沸，得到變性蛋白。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉；分別加入p-IRS2抗體（1∶10 000）、IRS2抗體（1∶3000）、p-PI3K抗體（1∶10 000）、PI3K抗體（1∶10 000）、FOXO4抗體（1∶3000）、α-SMA抗體（1∶6000）、nephrin抗體（1∶2000）、P-cadherin抗體（1∶2000）、Desmin抗體（1∶50 000）和GAPDH抗體（1∶20 000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌5次，加入相應二抗，常溫孵育1 h，TBST洗滌5次，加入ECL發光試劑顯色，使用Image J軟件分析條帶灰度值。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因序列 NephrinF: 5’-GGCTCTGACCACACCAACATCC-3’ R: 5’-GAGTGAGGGCTTATGCTGACAAC-3’ α-SMAF: 5’-GGCTATGCTCTGCCTCAT-3’ R: 5’-GGACGATCTCACGCTCA-3’ DesminF: 5’-CAGCAACAGGGACAATGA-3’ R: 5’-CACAGCCAACATGGAAGA-3’ P-cadherinF: 5’-TGTCTTGCCTCGGAACA -3’ R: 5’-TAAGCACCACCCCATT-3’ IRS2F: 5’-CCACTGCTGGCTCCTCA-3’ R: 5’-GTCACTCGGGCACCTTCT-3’ PI3KF: 5’-TGTCTTGCCTCGGAACA-3’ R: 5’-CAAACTCCAGCCACACATT-3’ FOXO4F: 5’-CTGTCACCCTTGTCCTTGA-3’ R: 5’-TGCAGAACTCATCAGCCA-3’ FSP-1F: 5’-CAGCAACAGGGACAATGA-3’ R: 5’-CACAGCCAACATGGAAGA-3’ β-actinF: 5’-ATCATTGCTCCTCCTGAGCG-3’ R: 5’-CAGCTCAGTAAVAGTCCGCC-3’

2.9 統計學分析

3 結果

3.1 復方仙草顆粒對DN大鼠一般情況和腎臟外觀的影響

對照組和假手術組大鼠毛發順滑，反應靈敏，一般情況較好；模型組大鼠精神欠佳，反應遲鈍，毛發枯黃雜亂，掉毛嚴重，身上出現斑禿現象，進食量和飲水量與日劇增，但體質量減輕，尿量增多。各給藥組大鼠相較于模型組大鼠精神稍好，反應稍遲鈍，進食量和飲水量相較于對照組大鼠增加，但少于模型組大鼠，體質量變化起伏不大。

如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠由于單側腎切除術后僅有1個腎臟進行全身的代謝活動并且無藥物干預，因此腎臟明顯大于對照組大鼠腎臟；與模型組比較，各給藥組腎臟略小于模型組大鼠腎臟，且各組間基本無差別。

3.2 復方仙草顆粒對DN大鼠KI及腎功能的影響

如表2所示，與對照組比較，假手術組大鼠KI、UACR、BUN無統計學差異，模型組大鼠KI、UACR和BUN水平均顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠KI、UACR和BUN水平均顯著降低（＜0.05）。

3.3 復方仙草顆粒對DN大鼠FBG、FINS及HOMA-IR的影響

如表3所示，與對照組比較，假手術組大鼠FBG、FINS及HOMA-IR無統計學差異，模型組大鼠FBG、HOMA-IR均顯著升高（＜0.05），FINS顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠FBG、HOMA-IR均顯著降低（＜0.05），FINS顯著升高（＜0.05）。

圖1 復方仙草顆粒對DN大鼠腎臟外觀的影響

表2 復方仙草顆粒對DN大鼠KI及腎功能指標的影響()

與對照組比較：*＜0.05；與模型組比較：#＜0.05，下表同

*< 0.05control group;#< 0.05model group, same as below tables

表3 復方仙草顆粒對DN大鼠FBG、FINS及HOMA-IR的影響()

3.4 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織病理及足細胞超微結構的影響

如圖2所示，HE染色結果顯示，對照組和假手術組大鼠腎組織結構正常，腎小管上皮細胞未見明顯變性，腎小球結構正常，系膜細胞未見增生，組織未見明顯炎癥細胞浸潤；與對照組比較，模型組大鼠腎組織結構重度異常，腎小管廣泛擴張，上皮細胞變性脫落，部分上皮細胞氣球樣變，胞質完整消失，間質可見少量炎癥細胞浸潤，腎小球肥大，毛細血管袢擴張；與模型組比較，各給藥組腎組織各種損傷較輕，部分腎小管擴張，個別腎小管上皮細胞數量減少并可見氣球樣變，腎小球輕度肥大，未見炎癥細胞浸潤。

TEM結果顯示，假手術組大鼠腎皮質與對照組無明顯差異；模型組大鼠足突約有80%融合，部分足突變寬，基底膜局部增寬，厚薄不均勻，線粒體可見輕度腫脹，大小不均，部分嵴減少，基質溶解空泡變。與模型組比較，厄貝沙坦組和復方仙草顆粒高劑量組足突融合40%左右，基底膜厚薄較均勻；復方仙草顆粒低劑量組足突融合程度70%左右，基底膜局部增寬，線粒體未見腫脹；復方仙草顆粒中劑量組足突融合程度60%左右，基底膜局部增寬，線粒體未見腫脹。

3.5 免疫組化法檢測腎組織足細胞標志物和EMT標志物蛋白表達

如圖3和表4所示，與對照組比較，假手術組大鼠EMT標志物（Desmin、α-SMA、FSP-1）和足細胞標志物（nephrin、P-cadherin）蛋白表達無統計學差異意義，模型組大鼠腎組織Desmin、α-SMA、FSP-1蛋白表達顯著升高（＜0.05），nephrin、P-cadherin蛋白表達顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組α-SMA蛋白表達顯著降低（＜0.05），nephrin蛋白表達顯著升高（＜0.05）；厄貝沙坦組和復方仙草顆粒中、高劑量組Desmin、FSP-1蛋白表達顯著降低（＜0.05），P-cadherin蛋白表達顯著升高（＜0.05）。

圖2 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織病理(A) 及足細胞超微結構(B) 的影響

圖3 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織α-SMA、nephrin、P-cadherin、Desmin和FSP-1蛋白表達的影響 (免疫組化, ×400)

表4 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織α-SMA、nephrin、P-cadherin、Desmin和FSP-1蛋白表達的影響()

3.6 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織α-SMA、Desmin、FSP-1、nephrin和P-cadherin mRNA表達的影響

如表5所示，與對照組比較，假手術組大鼠腎組織、、、和mRNA表達無統計學差異，模型組大鼠腎組織、、mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05），、mRNA表達水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織、、mRNA表達水平顯著降低（＜0.05），、mRNA表達水平顯著升高（＜0.05）。

3.7 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織IRS2、PI3K和FOXO4 mRNA表達的影響

如表6所示，與對照組比較，假手術組大鼠腎組織、和mRNA表達無統計學差異，模型組大鼠腎組織、mRNA表達水平顯著升高（＜0.05），mRNA表達水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織mRNA表達水平顯著降低（＜0.05），、mRNA表達水平顯著升高（＜0.05）。

表5 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織α-SMA、Desmin、FSP-1、nephrin和P-cadherin mRNA表達的影響(, n = 3)

表6 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織IRS2、PI3K和FOXO4mRNA表達的影響(, n = 3)

3.8 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織α-SMA、nephrin、P-cadherin和Desmin蛋白表達的影響

如圖4和表7所示，與對照組比較，假手術組大鼠腎組織α-SMA、Desmin蛋白表達無統計學差異，模型組大鼠腎組織α-SMA、Desmin蛋白表達水平顯著升高（＜0.05），nephrin、P-cadherin蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織α-SMA、Desmin蛋白表達水平顯著降低（＜0.05），nephrin、P-cadherin蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）。

圖4 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織α-SMA、nephrin、Desmin和P-cadherin蛋白表達的影響

表7 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織α-SMA、nephrin、Desmin和P-cadherin蛋白表達的影響(, n = 3)

3.9 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織IRS2/PI3K/ FOXO4信號通路相關蛋白表達的影響

如圖5和表8所示，與對照組比較，假手術組大鼠腎組織IRS2、p-IRS2、PI3K、p-PI3K、FOXO4蛋白表達無統計學差異，模型組大鼠腎組織p-IRS2、p-PI3K和FOXO4蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織p-IRS2、p-PI3K和FOXO4蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05）。

圖5 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織IRS2/PI3K/FOXO4信號通路相關蛋白表達的影響

4 討論

糖尿病是由于胰島素分泌相對或絕對不足、靶細胞胰島素敏感性下降或胰島素自身結構缺陷而導致代謝紊亂的慢性疾病[15-16]。持續性高血糖、胰島素抵抗和脂代謝紊亂可導致DN、糖尿病足和神經病變等一系列并發癥。腎足細胞是黏附于腎小球基底膜外側高度分化的細胞，與腎小球血管內皮細胞、基底膜共同構成腎小球濾過屏障[17]。EMT是上皮細胞通過特定程序轉化為具有特定表型細胞的生物學過程，是腎間質纖維化和腎功能喪失的主要機制之一[18]。研究表明，當足細胞出現EMT時，可促使足細胞具有運動性，導致足細胞三維結構及表型破壞，進而使其骨架改變[19]，是腎足細胞脫落和凋亡前的一個過程[17]。本研究發現復方仙草顆粒干預后，DN大鼠腎組織病理形態改善，足細胞足突融合減少，基底膜厚度相對均一，線粒體未見腫脹，高度特化的足細胞標志物nephrin、P-cadherin蛋白表達顯著增加，而EMT標志蛋白α-SMA、Desmin、FSP-1等表達則顯著降低。表明復方仙草顆粒能夠改善DN足細胞損傷，抑制腎足細胞EMT，改善腎功能。

厄貝沙坦為血管緊張素II受體拮抗劑，能夠選擇性切斷血管緊張素轉換酶I和受體血管緊張素II結合，減少醛固酮分泌從而控制血管收縮，減輕腎臟損害[20]，具有降血壓、減少蛋白尿、組織相容性好、脂溶性高等特點，能選擇性對出球小動脈進行擴張[21]，從而降低腎小球內高壓情況，改善腎小球的高濾過[22]；并且能夠明顯改善腎足細胞相關標志蛋白表達，保護腎足細胞，改善腎功能[23-24]；對腎組織的炎癥因子有抑制作用[25]，能夠延緩腎間質的纖維化[26]。研究已證實，厄貝沙坦能夠激活PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）[27-28]、IRS2/PI3K/葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter，GLUT）[29-30]等信號通路，因此選用厄貝沙坦作為陽性對照藥物。

表8 復方仙草顆粒對DN大鼠腎組織IRS2/PI3K/FOXO4信號通路相關蛋白表達的影響(, n = 3)

胰島β細胞功能受損引發胰島素分泌不足或胰島素抵抗是引起2型糖尿病的重要發病機制[31]。IRS2是有絲分裂發生的主要介質[32]，能夠調節胰島素、胰島素樣生長因子1等細胞因子；p-IRS2可以激活PI3K/Akt通路[33-36]，從而介導FOXO4活性。FOXO因子可與多種靶基因的啟動子結合，并控制細胞內環境穩定的幾個關鍵過程[3]，大量研究證明，FOXO作為調節下游靶基因以抵消細胞壓力的轉錄因子，調控體內的氧化應激、代謝、免疫以及細胞凋亡等生物過程[32-33]。研究表明，IRS2與腎皮質纖維化有關[37-38]，PI3K能夠改善DN大鼠腎臟細胞的葡萄糖代謝和水鹽代謝紊亂[38]，也可通過Akt途徑上調FOXO3、FOXO3a、FOXO4[39-41]。FOXO4與糖尿病及其并發癥的發生發展起關鍵性作用，且具有促進細胞增殖[42]、抗腫瘤細胞轉移的作用[43]。本研究結果表明復方仙草顆粒能夠改善DN大鼠胰島素功能，從而分泌胰島素，與胰島素受體結合，導致胰島素磷酸化和IRS2酪氨酸位點磷酸化，p-IRS2可以激活PI3K及其下游分子[33-35]，促進葡萄糖轉運及糖原合成。酪氨酸磷酸化后的IRS2與PI3K的調節亞基p85結合，進而激活PI3K。活化的PI3K將磷脂酰肌醇一磷酸轉化為磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸，并作為其第二信使激活Akt[36,44-45]，從而介導FOXO家族的活性。

綜上所述，復方仙草顆粒能夠改善DN大鼠足細胞EMT，減輕足細胞損傷，具有較好的保護腎臟的作用，其作用機制可能與調控IRS2/PI3K/FOXO4信號通路有關。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Compound Xianchao Granules on inhibiting epithelial mesenchymal transformation in diabetic nephropathy podocytes based on IRS2/ PI3K/FOXO4 signaling pathway

LIU Dan-ning1, HUANG Guo-dong2, YANG Xin-yong1, ZHOU Chang-yan1, WANG Ya-nan1

1. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, China 2. Guangxi International Zhuang Medicine Hospital, Nanning 530000, China

To investigate the mechanism of Compound Xiancao Granules (復方仙草顆粒) on inhibiting epithelial-mesenchymal transition (EMT) of renal podocytes in diabetic nephropathy (DN) rats based on insulin receptor substrate 2 (IRS2)/phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/forkhead box O4 (FOXO4) signaling pathway.DN model rats were prepared by unilateral nephrectomy, high sugar and high fat diet and one-time ip streptozocin, control group and sham-operated group were set up. Successfully modeled rats were randomly divided into model group, irbesartan (15.75 mg/kg) group, Compound Xiancao Granules low-, medium- and high-dose (315, 472.5, 945 mg/kg) groups, and each administration group was ig corresponding drugs for six weeks. Fasting blood glucose, kidney index (KI), urinary albumin-to-creatinine ratio (UACR) and blood urea nitrogen (BUN) of rats in each group were measured; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe histopathology changes in renal; Transmission electron microscopy was used to observe ultrastructural changes in renal pedicle cells; qRT-PCR and Western blotting were used to detect mRNA and protein expressions of,, α-smooth muscle actin (),, fibroblast specific protein-1 () and IRS2/PI3K/FOXO4 signaling pathway related factors.Compared with control group, KI, UACR and BUN in model group were significantly increased (< 0.05); Glomerular hypertrophy, extensive tubular dilatation, epithelial cell degeneration and shedding, fusion or loss of peduncle were observed; Nephrin and P-cadherin expressions in renal were significantly decreased (< 0.05), α-SMA, Desmin and FSP-1 expressions were significantly increased (< 0.05), mRNA and protein expressions of IRS2/PI3K/ FOXO4 signaling pathway related factors were significantly decreased (< 0.05). Compared with model group, KI, UACR and BUN in Compound Xiancao Granules groups were significantly decreased (< 0.05), renal pathological structure and podocyte ultrastructure were significantly improved; Nephrin and P-cadherin expressions in renal were significantly increased (< 0.05), α-SMA, Desmin and FSP-1 expressions were significantly decreased (< 0.05), mRNA and protein expressions of IRS2/PI3K/FOXO4 signaling pathway related factors were significantly increased (< 0.05).Compound Xiancao Granules can improve kidney function in DN rats by regulating IRS2/PI3K/FOXO4 signaling pathway, inhibit EMT of podocytes in DN rats and reduce podocyte injury.

Compound Xiancao Granules; diabetic nephropathy; podocytes; epithelial-mesenchymal transformation; insulin receptor substrate 2/phosphatidylinositol-3-kinase/forkhead box O4 signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)21 - 6795 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.017

2022-07-04

國家自然科學基金資助項目（81960913）；廣西中醫藥大學2021年研究生教育創新計劃項目區級課題（YCSW2021235）

劉丹寧，碩士，從事中西醫結合治療腎臟疾病研究。Tel: 15878778767 E-mail: 353580454@qq.com

黃國東，博士，教授，博士生導師，從事中西醫結合治療腎臟疾病研究。Tel: 13768372258 E-mail: 644781538@qq.com

[責任編輯 李亞楠]