甘露糖修飾雷公藤紅素脂質體處方工藝優化及體外靶向性評價

司佳奇，劉 洋，蔡佳雨，劉婉瀅，李灃芮，孔 亮, 2，李學濤*

甘露糖修飾雷公藤紅素脂質體處方工藝優化及體外靶向性評價

司佳奇1，劉 洋1，蔡佳雨1，劉婉瀅1，李灃芮1，孔 亮1, 2，李學濤1*

1. 遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600 2. 遼寧中醫藥大學中醫臟象理論及應用教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110847

制備甘露糖修飾的雷公藤紅素脂質體（mannose-celastrol-liposomes，Man-Cel-Lips），對其處方進行優化，并初步評價其體外靶向性。采用薄膜分散法制備Man-Cel-Lips。以包封率為考察指標，采用Box-Behnken設計-響應面法優化處方中膽固醇加入量、Cel加入量和探頭超聲時間間隔；按最優處方制備3批脂質體，對其進行表征并考察其體外釋放情況。以香豆素為熒光探針，采用流式細胞儀和熒光顯微鏡法考察甘露糖對脂多糖誘導的RAW264.7細胞的攝取和靶向作用。通過Box-Behnken響應面法，確定最優處方工藝為膽固醇4 mg、Cel 1 mg、磷脂22 mg，超聲間隔時間5 s，總處方量為5 mL。所制得3批脂質體平均粒徑為（93.50±1.04）nm，多分散指數為0.22±1.81，ζ電位為（?5.70±0.26）mV，平均包封率為（92.75±0.61）%，相比于游離Cel，Man-Cel-Lips具有一定緩釋效果。體外細胞攝取實驗結果表明，Man-Cel-Lips對細胞的攝取效率高于其他組，且呈劑量相關性（＜0.05）。成功制備并優化Man-Cel-Lips，經甘露糖修飾的Cel-Lips靶向性增強，為后續研究其抗炎活性奠定基礎。

雷公藤紅素；甘露糖；處方優化；巨噬細胞；靶向性；脂質體；薄膜分散法；Box-Behnken設計-響應面法；抗炎

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是最常見的慢性、全身自身免疫性疾病，以慢性滑膜炎和軟骨破化為主要特征，患者常伴有持續性關節疼痛、腫脹、僵硬，嚴重者則會引發心血管、肺、骨骼等多種并發癥，嚴重影響患者的生活水平與生活質量[1-2]。

雷公藤是衛矛科雷公藤屬植物雷公藤Hook. f.的干燥根，其藥用最早記載于明朝蘭茂所著的《滇南本草》，具有“治禁錮疼痛、風寒濕痹、麻木不仁、癱瘓痿軟”等功效[3]。其中雷公藤紅素（celastrol，Cel），又名南蛇藤素，是從雷公藤根皮中分離提取得到的天然活性產物，具有抗炎、抗氧化、抗血栓、心臟保護等多種生物活性[4-8]，早在2011年已有應用Cel治療關節炎小鼠的報道[9]，雖然Cel具有很好的藥理活性，但由于其自身毒性大、口服生物利用度低以及水溶性差，很大程度上限制了其臨床應用[10]。

脂質體是以類脂質（如磷脂和膽固醇）構成的雙分子層為膜材包合而成的微粒。修飾靶向分子后的脂質體能選擇性地分布于某些組織和器官，提高藥物在靶部位的質量濃度，既可提高藥效、減少劑量，又能降低藥物帶來的毒副作用，是1種最具有開發潛力的新型納米給藥系統之一[11-12]。甘露糖是唯一用在臨床上的糖質營養素，廣泛分布于體液和組織中[13]。作為1種具有潛力的靶向基團，甘露糖具有無毒、無免疫原性、生物相容性和生物可降解性良好等諸多優點，并且甘露糖受體在巨噬細胞表面高表達[14]。本研究制備甘露糖修飾的雷公藤紅素脂質體（mannose-celastrol-liposomes，Man-Cel-Lips），對其進行處方優化，并初步考察其體外靶向性，為后續抗RA治療研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agress1100型高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司；T1-S型倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；B-220型電熱恒溫水浴鍋、RE52CS型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；JY92-2D型超聲波細胞搗碎機，寧波新芝生物股份有限公司；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡（TEM），日本JEOL公司；ZS90型激光散射粒徑測定儀，英國Malvern公司。

1.2 藥品與試劑

Cel對照品，批號21081001，質量分數＞99%，購自成都普菲德生物技術有限公司；膽固醇（批號N1018A，質量分數＞95%）、脂多糖（批號M0509A/ N1120A）均購自大連美侖生物科技有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（distearoyl phosphoethanolamine-PEG2000，DSPE-PEG2000，批號RA0221417）、DSPE-PEG2000-Man（批號RF0221713）均由西安瑞禧生物科技有限公司合成；香豆素，批號MKBV4602V，購自美國Sigma-Aldrich公司；卵磷脂，批號120025，購自日本NOF公司；胎牛血清（FBS），批號G211HN，購自浙江天杭生物科技有限公司；DMEM完全培養基（批號20210619）、Sephadex G-100葡聚糖凝膠（批號20190307）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號1022Q）均購自北京索萊寶科技有限公司；其余試劑為分析純，水為純凈水。

1.3 細胞

RAW264.7細胞購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司，培養于含10% FBS、1%雙抗的DMEM完全培養基中，置37℃、5% CO2培養箱中培養。

2 方法與結果

2.1 脂質體制備

采用薄膜分散法制備Man-Cel-Lips。精密稱取處方量的DSPE-PEG2000、Cel、DSPE-PEG2000-Man、卵磷脂、膽固醇，以適量甲醇溶解并超聲片刻，于40℃水浴中減壓旋蒸，待燒瓶底部形成一層均勻的薄膜時取下，加入5 mL PBS超聲輕搖直至薄膜完全溶解，將混懸液轉移至10 mL EP管中，置功率600 W探頭下，超聲破壁10 min，待混懸液澄清透明，過2次0.22 μm微孔濾膜，收集濾液，即得Man- Cel-Lips。同上述操作，除不加入Cel以制備Man- Lips；除不加入DSPE-PEG2000-Man以制備Cel-Lips。

2.2 Cel含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.05%磷酸鹽緩沖液（92∶8）；檢測器為紫外吸收檢測器，檢測波長425 nm；柱溫25 ℃；體積流量1 mL/min；進樣量20 μL。

2.2.2 溶液的制備

（1）對照品溶液：精密稱取Cel 2 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，混勻，即得質量濃度為0.2 mg/mL的對照品母液。以甲醇為溶劑稀釋上述對照品母液，即得質量濃度為10、15、20、25、30、35 μg/mL的對照品溶液。

（2）供試品溶液：精密吸取Man-Cel-Lips 1 mL，加甲醇定容至10 mL，混勻并超聲破乳，以0.45 μm微孔濾膜濾過2次，收集濾液，即得。

（3）陰性對照溶液：精密吸取Man-Lips 1 mL，同供試品溶液制備方法操作，即得陰性對照溶液。

2.2.3 專屬性實驗 分別取適量供試品溶液、對照品溶液（20 μg/mL）和陰性對照溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。如圖1所示，Cel在9.4～9.6 min出峰，色譜峰分離度良好，主峰與雜質峰基線分離，陰性對照溶液對Cel測定無干擾，表明本方法專屬性良好。

圖1 Man-Cel-Lips供試品溶液(A)、Cel對照品溶液(B)和陰性對照溶液(C)的HPLC圖

2.2.4 線性關系考察 取“2.2.2（1）”項下各對照品溶液適量，按“2.2.1”項色譜條件進樣測定并記錄。以Cel質量濃度為橫坐標（）、峰面積為縱坐標（）繪制標準曲線，進行線性回歸，得Cel回歸方程＝35.793－2.232，2＝0.999 9，結果表明Cel在10～35 μg/mL線性關系良好。

2.2.5 重復性試驗 取Man-Cel-Lips 6份，按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。結果表明Cel平均質量濃度為20 μg/mL，RSD為0.20%，表明該方法重復性良好。

2.2.6 精密度試驗 取“2.2.2”項下Cel對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續測定6次，考察精密度。結果Cel峰面積的RSD為0.23%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，取樣按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果Cel峰面積的RSD為0.34%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密吸取6份Man-Cel- Lips，各1 mL，分別加入Cel對照品溶液（20 μg/mL）1 mL，按“2.2.2（2）”項方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果Cel的平均加樣回收率為101.90%，RSD為0.18%，表明該方法準確度良好。

2.3 包封率及載藥量的測定

取Man-Cel-Lips 2 mL，逐滴加入Sephadex G-100凝膠柱中并以PBS洗脫，收集橘黃色乳光液體，定容至2 mL，按“2.2.2（2）”項方法處理，并按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，代回“2.2.4”項回歸方程計算Cel質量濃度，并計算其包封率和載藥量。

包封率＝a/b

載藥量＝e/m

a為過柱后含量，b為過柱前含量，e為包封于脂質體內的藥量，m為載藥脂質體的總質量

2.4 脂質體處方工藝的優選

根據課題組前期研究結果[15]及文獻方法[16]，選定膽固醇質量（1）、Cel質量（2）與超聲間隔時間（3）作為考察因素，以包封率（）為考察指標，固定處方量5 mL，卵磷脂用量22 mg，確定各考察因素范圍，采用Box-Benhken設計-響應面法實驗優選脂質體處方工藝。考察因素、實驗設計與結果見表1，方差分析見表2。

將表1中包封率數據輸入Design-Expert 8.0.6.1軟件，得擬合方程＝93.81＋3.581＋2.712－1.403－3.2812－0.7813－0.2023－15.4612－4.6022－2.6132（＝0.976 5，＜0.05）。通過顯著性檢驗可知，擬合模型中1、2、12、12、22、32對值有顯著影響（＜0.05），失擬項不顯著（≥0.05），各因素對包封率影響的順序為1＞2＞3，即膽固醇質量＞Cel質量＞超聲間隔時間。使用Design-Expert 8.0.6.1軟件繪制各因素之間效應面圖與等高線圖，結果見圖2。

可見，交互因素中2與3的效應面較平緩，橢圓形不明顯，而1與2、1與3的等高線均呈明顯橢圓形，說明后2者交互作用更為突出，1與2對值影響顯著。根據課題組前期研究結果以及上述實驗結果，確定最終的處方工藝為磷脂22 mg、膽固醇4 mg、Cel 1 mg、處方量5 mL、超聲時間間隔5 s。按上述最優處方工藝制備3批Man-Cel-Lips，按“2.2”項下HPLC法測定Cel含量，3批脂質體的包封率分別為92.75%、92.14%、93.36%。經計算，Cel平均包封率為（92.75±0.61）%，與模型預測值（94.54%）的相對誤差僅為1.93%，平均載藥量為（2.99±0.02）%，可見優選處方質量穩定可行。

表1 Box-Behnken設計-響應面法實驗設計方案與結果

Table 1 Experimental design scheme and results of Box-Behnken design-response surface method

序號X1/mgX2/mgX3/sY/%序號X1/mgX2/mgX3/sY/%序號X1/mgX2/mgX3/sY/% 17 (+1)1.8 (+1)5 (0)78.69711.0771.301340.27 (+1)84.86 24 (0)1.0595.34841.0594.271471.0774.81 371.03 (?1)81.75941.0594.081541.0592.16 41 (?1)0.2 (?1)562.241070.2578.051641.8788.10 540.2384.701141.0593.201711.8576.01 641.8388.731211.0375.11

表2 方差分析結果

Table 2 Analysis results of variance

來源平方和自由度方差F值P值來源平方和自由度方差F值P值 模型1 411.559156.8432.29＜0.000 1X121 006.2011 006.20207.18＜0.000 1 X1102.531102.5321.110.002 5X2289.24189.2418.370.003 6 X258.75158.7512.100.010 3X3228.66128.665.900.045 5 X315.74115.743.240.114 9殘差34.0074.86 X1X243.10143.108.870.020 5失擬項28.2839.436.590.050 0 X1X32.4512.450.500.500 6純誤差5.7241.43 X2X30.1610.160.0320.862 8總離差1 445.5516

圖2 各因素對Man-Cel-Lips包封率影響效應面圖和等高線圖

2.5 脂質體表征

吸取適量Man-Cel-Lips，滴加至專用銅網，以2%磷鎢酸溶液染色，室溫晾干，隨后置TEM下觀察其形態（加速電壓120 kV）。另取Man-Cel-Lips適量，置激光散射粒徑測定儀測定其粒徑、多分散指數及ζ電位。結果如圖3、4所示，Man-Cel-Lips呈球狀或類球狀，分布均勻，平均粒徑為（93.50±1.04）nm（＝3），多分散指數為0.22±1.81（＝3），ζ電位為（?5.70±0.26）mV（＝3），表明該脂質體粒徑分布均勻且穩定不易絮凝。

圖3 Man-Cel-Lips的TEM圖

圖4 Man-Cel-Lips粒徑分布(A)和ζ電位 (B)

2.6 體外釋放研究

取2 mL Man-Cel-Lips置透析袋（截留相對分子質量8000～14 000）中，放入15 mL PBS（pH 7.4）釋放介質中，37 ℃、100 r/min低速攪拌，分別于2、4、6、8、12、24、48 h取樣1 mL，并補充等量等溫釋放介質。取液加1 mL甲醇混勻，按“2.2.1”項色譜條件測定，計算各時間點累積釋放率（＝3），同時考察相同條件下游離Cel與Cel-Lips體外釋放行為。結果如圖5所示，游離Cel在8 h內釋放速度較快，12 h后藥物釋放基本平穩，而Cel-Lips與Man-Cel-Lips呈緩慢釋放，表明經制備成的脂質體具有緩釋作用。

2.7 細胞攝取

2.7.1 熒光顯微鏡觀察脂質體攝取情況 精密稱取處方量的膽固醇、卵磷脂、DSPE-PEG2000-Man、DSPE-PEG2000以及熒光探針香豆素（coumarin，Cou），按“2.1”項下方法制得Man-Cou-Lips，除不加DSPE-PEG2000-Man以制備Cou-Lips。取對數生長的RAW264.7細胞以每孔密度1×104個接種于48孔板中，于37 ℃、5% CO2條件下培養，待其貼壁后，向每孔加入2 μg/mL的脂多糖誘導12 h，隨后分別加入Man-Lips（對照）、Man-Cou-Lips與Cou-Lips，給藥組濃度分別為1.5、3.0、6.0 μmol/L。2 h后棄培養基，以PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，棄固定液用PBS洗板2次，每孔加DAPI染液避光染色15 min，棄染液用PBS洗板2次，在熒光顯微鏡下觀察并記錄各組成像。結果如圖6所示，對照組未見綠色熒光，Man-Cou- Lips組細胞內熒光明顯。

圖5 Man-Cel-Lips釋放曲線

使用Image J軟件對圖片進行熒光強度統計分析，相鄰組間比較采用檢驗分析。結果如圖7所示，與Cou-Lips相比，Man-Cou-Lips 3.0、6.0 μmol/L組熒光強度增強（＜0.05），表明脂質體經過甘露糖修飾可增強其對RAW264.7細胞的靶向性，且熒光強度隨劑量增加逐漸增強。

2.7.2 流式細胞儀檢測脂質體攝取情況 取對數生長的RAW264.7細胞以每孔密度3×105個接種于6孔板中，同“2.7.1”項操作處理。給藥2 h后棄培養基，加入新鮮培養基，并用移液槍輕吹使細胞脫落，離心收集細胞，以PBS洗1次，再加適量PBS復懸并移至流式管，用流式細胞儀檢測并記錄，相鄰組間比采用檢驗分析。

結果如圖8、9所示，Man-Cou-Lips 3.0、6.0 μmol/L組細胞的熒光強度顯著高于其他組（＜0.05），且熒光強度隨劑量增加而逐漸增強，與熒光顯微鏡觀察結果一致。

A～C分別為1.5、3.0、6.0 μmol?L?1藥物對應的熒光強度圖

3 討論

RA是最嚴重的自身免疫性疾病之一，風濕性關節炎在全球的患病率為1%，女性的發病率是男性的2～3倍[17]，被稱為“不死的癌癥”。目前常用于治療RA的藥物主要有非甾體類抗炎藥、糖皮質激素藥及其他化學合成類抗風濕藥等，這幾類藥物雖能有效緩解炎癥引起的臨床癥狀和體征，但無法根治疾病，且體內特異性低，毒副作用較為明顯[18]。傳統中藥具有多成分、多靶點協同且不良反應小等優勢，目前成為研發抗RA新藥熱點之一[19-21]。作為一種新型給藥系統，脂質體具有包封親脂性藥物和親水性藥物的能力，因其生物相容性、生物可降解性、無毒和免疫原性而具有多種優勢[22-23]。

與Cou-Lips組比較：*P＜0.05

a-對照組 b-Cou-Lips組 c-Man-Cou-Lips組 A～C分別為1.5、3.0、6.0 μmol?L?1藥物對應的熒光強度圖

與Cou-Lips組比較：*P＜0.05

當機體產生炎癥反應時，會激活大量巨噬細胞，已有學者研究發現，Cel可通過調節核因子-κB和Notch1通路抑制巨噬細胞復極化，減少多種促炎細胞因子分泌來治療RA，并且甘露糖受體（MR）在活化的巨噬細胞表面高表達[24-25]。使用納米技術作為載體將Cel送達體內后，可使Cel治療RA的功效最大化且降低其全身不良反應[26]。本研究將中藥天然產物與靶向分子結合，采用薄膜分散法構建Man-Cel-Lips，制備工藝簡單可行。

Box-Behnken設計-響應面法是一種多因素之間關系考察的設計方法，其特點是建立因素與響應值之間數學預測模型，確定各因素及其相互作用對響應值的影響，從而選擇最佳工藝參數，準確度高、驗證次數少、效率高[27-29]，因而本研究采用該方法優化Man-Cel-Lips處方。按上述最優處方制備的脂質體，包封率較高，穩定性較好，具有一定緩釋作用，且加入DSPE-PEG2000有助于脂質體躲避網狀內皮系統的清除，符合《中國藥典》2020年版四部的要求[30]。

Cel本身不具有熒光特性，課題組選用具有熒光活性的香豆素作為熒光探針，采用脂多糖誘導RAW264.7細胞模擬關節炎細胞環境，結合熒光顯微鏡和流式細胞儀結果對不同脂質體進行定性定量比較。結果表明，經甘露糖修飾的脂質體組熒光強度顯著增強，且熒光強度隨劑量增加而逐漸增強，說明甘露糖與活化巨噬細胞表面MR特異性結合，經甘露糖修飾可增加載藥脂質體在炎癥細胞內的分布，提高藥物的靶向性，增強炎癥細胞對藥物的攝取能力，使脂質體發揮更好的抗炎效果，且熒光顯微鏡和流式細胞儀結果一致。

綜上所述，本研究成功制備Man-Cel-Lips，篩選其最優處方，同時測定脂質體中藥物含量，并通過體外攝取實驗考察靶向性，為后續深入研究Man-Cel-Lips抗炎機制提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of mannose-modified celastrol liposome formulation and targeting evaluation

SI Jia-qi1, LIU Yang1, CAI Jia-yu1, LIU Wan-ying1, LI Feng-rui1, KONG Liang1, 2, LI Xue-tao1

1. School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China 2. Key Laboratory of TCM Viscera-State Theory and Applications, Ministry of Education, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China

To optimize the prepared prescription of Mannose celastrol liposomes (Man-Cel-Lips) and preliminarily evaluate itstargeting.Man-Cel-Lips was prepared by thin-film dispersion method. Box-Behnken design-response surface methodology was used to optimize the dosage of cholesterol, the dosage of Cel and the ultrasonic time interval using encapsulation efficiency as index. Three batches of liposomes were prepared according to the optimal formula, and the liposomes were characterized and their releasewas investigated. The uptake and targeting effects of MAN on lipopolysaccharide induced RAW264.7 cells were investigated by flow cytometry and fluorescence microscopy using coumarin as fluorescence probe.Box-Behnken design-response surface method was used to determine the optimal prescription process: 4 mg cholesterol, 1 mg Cel, 22 mg phospholipid, 5 s ultrasonic interval and 5 mL total prescription. The average particle size, polydispersion index, ζ potential and encapsulation efficiency of the three batches of liposomes were (93.50 ± 1.04) nm, 0.22 ± 1.81, (?5.70 ± 0.26) mV and (92.75 ± 0.61)% respectively. Compared with free Cel, MAN-Cel-lips had a certain sustained release effect.cell uptake experiment results showed that the uptake efficiency of Man-Cel- Lips was higher than that of other groups (< 0.05), and increased with the increase of dose (< 0.05).Man-Cel-Lips were successfully prepared and optimized, and the targeting activity of Man-Cel-Lips was enhanced, which laid a foundation for the follow-up study of its anti-inflammatory activity.

celastrol; mannose; prescription optimization; macrophage; targeting; liposomes; membrane dispersion method; Box- Behnken design-response surface method; anti-inflammation

R283.6

A

0253 - 2670(2022)21 - 6726 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.009

2022-05-18

中國醫藥教育學會“2020年重大科學攻關問題和醫藥技術難題”項目（2020KTS004）；遼寧中醫藥大學中醫臟象理論及應用教育部重點實驗室開放基金（zyzx2102）

司佳奇（1998—），女，碩士研究生，研究方向為新型給藥系統。Tel: (0411)85890145 E-mail: 2667544783@qq.com

李學濤（1979—），男，教授，博士生導師，研究方向為新型給藥系統。Tel: (0411)85890145 E-mail: lixuetao1979@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]