柳枝稷與苜蓿的共發酵對厭氧發酵體系產氣效率及微生物群落的影響

孫 宇 劉 燕 陳嘯天 于海茹 袁旭峰 趙洪顏* 崔宗均*

(1.延邊大學 農學院,吉林 延吉133002；2.中國農業大學 農學院，北京100193；3.四川碩盟農業科技有限公司，成都 610093；4.延邊州特色產業中心，吉林 延吉 133002)

隨著我國生物質能源的生產規模不斷擴大，對生產生物質能源的原料需求也急劇增長。在保證糧食安全和耕地面積的基礎上，合理且充分地利用我國的各種邊際土地，種植能源草等植物可以有效地解決生物質原料短缺的問題[1]。柳枝稷原產于美國，為多年生C4草本植物，生物質產量可達20 t/hm2，是一種高生產和低投入的能源作物[2]。由于其在栽培上適應性廣、抗逆性強的特點，被作為能源草廣泛利用于水土保持和風障植物。紫花苜蓿為多年生豆科植物，含有豐富的營養成分，尤其是蛋白質含量高，具備很高的綜合利用價值[3]，并且紫花苜蓿也是一種較好的能源草，其在改善邊際土地生物多樣性具有重要意義。

厭氧發酵是含纖維素能源作物轉化為能源為數不多的成功途徑，作為一種能源作物柳枝稷的沼氣發酵也備受關注。但柳枝稷作為厭氧發酵的原料，首先遇到的問題是由于柳枝稷的碳氮比高，在單獨發酵時，有機酸過度積累，pH下降，從而導致沼氣發酵過程受阻[4]。楊富裕等[5]以柳枝稷為原料通過微波，蒸汽加熱和NaOH預處理方法，研究柳枝稷的結晶度和纖維結構的影響及厭氧發酵特性，結果表明：3種預處理方法都可以降低原料結晶度，但由于碳氮比較高，對厭氧發酵并無明顯改善作用。這是因高碳氮比會抑制沼氣的產生，對厭氧發酵的穩定性產生負面影響[6]。原料與緩沖基質共發酵是可以克服物料高碳氮比問題的一種方法，并可以提高發酵過程穩定性。與單發酵法相比，共發酵法具有提高沼氣產量、平衡整個系統、易于處理混合廢物等優點。鄭澤慧[7]將柳枝稷與牛糞按不同比例(柳枝稷與牛糞原料的含固率配比分別為4∶0、3∶1、2∶2、1:3、0∶4)混合共發酵探索其產甲烷特性，結果表明：3種混合比例的甲烷產量均高于單一原料發酵的疊加產量；Zheng等[8]在柳枝稷與牛糞共發酵研究中采用定量PCR和克隆文庫分析，結果表明：共發酵底物比例不同，細菌群落存在顯著差異，共發酵可以顯著增加細菌的總量，并且綠彎菌門、厚壁菌門的豐度均顯著增加，因此混合發酵可以很好的提高發酵效率。目前在畜牧區，牛糞已經大量用于厭氧發酵中，但由于生物質能源的生產規模不斷擴大，導致一些非畜牧區甚至畜牧區出現了厭氧發酵高含氮原料短缺的問題。為解決因此出現的發酵體系中碳氮營養平衡問題，本研究擬以苜蓿作為牛糞的高含氮替代原料與柳枝稷共發酵，設置不同的柳枝稷和苜蓿原料含固率配比，探討和對比其產氣效率以及微生物群落的影響，得出柳枝稷與苜蓿的合理發酵組合配比，以期為非牧區能源作物種植區，沼氣-生物天然氣產業技術在非畜牧區的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

柳枝稷、苜蓿均取自中國農業大學上莊實驗站，收割后切成2～3 cm長度，后在105 ℃烘箱殺青10 min后，60 ℃烘干至恒重，粉碎并密封保存，其具體組成見表1。污泥取自中國農業大學生物質工程中心，活性污泥的pH 7.2，總固體(TS)，揮發性固體(VS)分別為6.0%和4.1%。

表1 柳枝稷及苜蓿的基本性質Table 1 Chemical composition of switchgrass and alfalfa

1.2 試驗裝置

發酵裝置采用800 mL抽濾瓶，集氣袋為2 L容量的鋁箔復合膜采樣袋，裝置示意圖如圖1。

1.3 試驗設計

批次試驗采用中溫發酵(35±1 ℃)，試驗周期為30 d。柳枝稷和苜蓿不同TS配比如下：A組為0∶4；B組為1∶3；C組為1∶1；D組為3∶1；E組為4∶0。發酵裝置有效體積為600 mL，專門設一取樣瓶，有效體積為1.2 L，物料是發酵瓶的兩倍。試驗依照總TS為4%添加原料，料泥比(原料與污泥比例)為1.4，每天均勻攪拌一次。發酵瓶3個平行處理，用于測定每日產氣量以及氣體成分的測定。發酵前9 d每天取樣，9 d之后3 d取樣一次，從取樣瓶抽取10 mL在-20 ℃保存以及用于pH的測定，同時監測取樣瓶產氣情況，保證與發酵瓶的狀態一致。

圖1 發酵裝置主要結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of the major structure for fermentation experiments

1.4 測定方法

1.4.1理化指標測定

產氣量采用集氣排水法收集測量，氣體成分采用氣相色譜法測定。TS、VS采用干重法測定[9]，纖維素采用范式洗滌法，總碳、總氮分別用重鉻酸鉀容量法-稀釋熱法和凱氏定氮法[10]。pH用日本Horiba公司生產的B-212型微量pH計進行測定。VFA用日本島津QP2010型液相色譜儀測定[11]。

1.4.2微生物分析

DNA提取與Q-PCR擴增：對0、5、9、15、30 d后發酵體系的樣品進行微生物檢測，將樣品8 000 r/min 離心10 min，取0.1～0.3 g沉淀，提取DNA，用多功能DNA純化回收試劑盒純化DNA；在ABI 7500 定量PCR儀(型號7500,Applied Biosystems,USA)上進行Q-PCR反應。細菌引物是B27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和B907r(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTT-3′)，古菌引物為A109f(5′-ACKGCTCAGTAACACGT-3′)和A912rt(5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCTTTA-3′)。

細菌16S rRNA基因克隆文庫構建：將純化后的PCR產物與載體pGEM-T Easy Vector(A1360，Promega，USA)連接，采用熱激轉化法將連有目的片段的載體導入感受態細胞(BMJM109，BIOMED，北京)，37 ℃ 150 r/min振蕩培養1 h。涂布在含有LBA培養基的培養皿上，每個樣品涂兩個培養皿，陰性對照和陽性對照，各涂一個培養皿，37 ℃倒置培養16 h進行藍白斑篩選。每個樣品隨機挑選200個陽性克隆子構成該點的克隆文庫，再進行菌落PCR，引物T7(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)和Sp6(5′-ATTTAGGTGACACTATAG-3′)，對PCR產物進行酶切，根據不同酶切帶型將克隆子進行分類，挑取不同種類的一個陽性克隆子送去測序(上海生工生物工程有限公司)。

細菌、古菌的定量PCR：在ABI 7500 定量PCR儀(型號7500，Applied Biosystems，USA)上進行Q-PCR反應。不同的古菌有特定的引物和探針序列，本試驗所用的5 種古菌特異引物及探針(TaqMan探針上標有FAM熒光基團和BHQ-1猝滅基團)：甲烷桿菌(MBT)(MBT857F，MBT929F，MBT1196R；擴增長度：343 bp)；甲烷微菌(MMB)(MMB282F，MMB749F，MMB832R；擴增長度：506 bp)；甲烷八疊球菌(MSC)(Msc380F，Msc492F，Msc828R；擴增長度:408 bp)和甲烷鬃毛菌(MST)(Mst702F，Mst753F，Mst862R；擴增長度：164 bp)。定量PCR反應體系使用2×TaqMan Universal PCR Master mix(DRR390A，TaKaRa，大連)。用上述引物對每個菌株的rRNA基因序列進行常規PCR擴增，將PCR產物純化后采用多功能DNA回收試劑盒回收DNA，并將DNA連接到載體pGEM-T Easy Vector(Promega，USA)上，隨后通過熱轉化法轉化到大腸桿菌中，擴大培養后采用高純質粒小量快速提取試劑盒(PL0301，博邁德，北京)提取質粒，在分光光度計測定質粒濃度后，通過公式將質粒濃度變換成以copies/μL為單位的數值，最后分別對5種質粒以10倍的梯度進行逐級稀釋，用來制作標準曲線。根據標準曲線，分析樣品中菌群16S rRNA基因克隆文庫。

1.5 數據處理

采用Excel 2020，并且使用SPSS 26對原始數據進行方差分析與相關性分析，方差分析使用Duncan的多范圍檢測，其顯著性P<0.05。

2 結果與分析

2.1 不同配比的柳枝稷與苜蓿共發酵的日產甲烷量與累積產甲烷量變化

沼氣產量可作為監測反應器運行效率的指標[12]，對試驗中5組的產甲烷量進行數據處理，如圖2為每g VS的日產甲烷量與累計產甲烷量。圖2(a)為柳枝稷與苜蓿共發酵30 d的日甲烷量變化，可見5組的產甲烷量均表現三峰趨勢，總體由高逐漸下降；5個組均在24 h后出現第1次產氣高峰，之后略有回落，在4～6 d出現2次產氣峰，3次產氣峰出現在8～11 d。從時間上，苜蓿成分多者產氣峰出現得早，柳枝稷成分多者產氣峰推后。柳枝稷與苜蓿A、B、C組在10 d時已結束大量產氣，分別達到總產氣量的95.6%、93.3%和93.8%，D組在13 d，E組在16 d產氣量回落到很低水平。這時D組與E組產氣量分別達到總產氣量的94.4%和97.2%。從產氣周期變化可見，原料中的不同成分分別在不同時間陸續被分解利用。純苜蓿的處理產氣都集中在前2次峰值上，說明苜蓿產氣主要依靠可溶性成分，這與表1中的數值相吻合；隨著原料中柳枝稷含量的增加，半纖維素、纖維素被逐漸降解利用，發酵周期就要往后延長，總產氣量也隨之增加，從表1可見柳枝稷的半纖維素含量顯著高于苜蓿，而纖維素含量兩者接近，說明柳枝稷后端的產氣主要靠半纖維素的分解利用。表2為柳枝稷與苜蓿日產甲烷量顯著性差異，從表中可以看出整個產氣周期中D組整體顯著性優于A、B、C、E組。

由圖2(b)可見，試驗剛開始時，苜蓿成分越多產氣積累越快，發酵到8 d左右后A、B、C組產氣積累乏力，逐漸被D、E組超越，最終累積產氣以E組最高，D組次之。A、B、C、D、E，5個組的累計產甲烷量分別達到291.7、287.7、320.3、357.4和362.2 mL/g VS，表3為柳枝稷與苜蓿累積產甲烷量顯著性差異，從表3中可知累積產甲烷量D、E組顯著優于A、B、C組。而且D組和E組的產甲烷量沒有顯著差異。

柳枝稷與苜蓿TS比：A為0∶4；B為1∶3；C為1∶1；D為3∶1；E為4∶0。TS ratio of switchgrass to alfalfa:A was 0∶4;B to 1∶3;C is 1∶1;D is 3∶1;E is 4∶0.圖2 柳枝稷與苜蓿不同含固率配比下日產甲烷量(a)和累計產甲烷量(b)Fig.2 Daily methane production (a) and cumulative methane production (b) of switchgrass and alfalfa under different solid content ratios

2.2 不同含固率配比的柳枝稷與苜蓿共發酵pH、揮發性脂肪酸(VFAs)的變化

柳枝稷與苜蓿共發酵pH，VFAs情況如圖3所示，pH整體變化趨勢是試驗開始后1～3 d較明顯下降后上升，在第9 天和12 天附近2次略有下降，15 d之后基本穩定在7.5～7.7。pH的這種變化與日產氣量變化曲線(圖2(a))完全吻合。在活躍的活性污泥的作用下，試驗第1天最容易分解的可溶物質表現出較高產氣量，但第2天開始pH迅速下降，隨之產氣量也陡然下降。之后pH的回升速度與柳枝稷和苜蓿的量緊密相關，柳枝稷少苜蓿多者pH回升快而高，柳枝稷多苜蓿少者pH回升慢，上升幅度也小，隨之產氣量比苜蓿多者高得多。在不同組合之間，苜蓿成分多者在初期pH下降幅度小，并且上升多，隨著柳枝稷成分的增加pH下降明顯，回升幅度減小，純柳枝稷的E組pH下降幅度大，最低時下降到6.2，回升比其他組緩慢，最終回升到穩定點需要21 d。由圖3(a)可見在所有組合中，A、B、C、D組的pH均未出現劇烈波動，說明苜蓿增強了反應體系的C、N平衡和系統緩沖能力，使發酵系統更加穩定，E組柳枝稷單發酵雖然最終累積產氣量最高，從pH曲線上看，其對發酵體系帶來一定酸敗的風險。

表2 柳枝稷與苜蓿不同含固率配比下日產甲烷量Table 2 Methane production of switchgrass and alfalfa under different solid content ratios

表3 柳枝稷與苜蓿不同含固率配比下發酵體系累積產甲烷量Table 3 Cumulative methane production of switchgrass and alfalfa under different solid content ratios

揮發性脂肪酸(VFAs)是直接影響發酵體系pH的因素，在厭氧發酵體系中，VFAs含量不應過高，過量的酸會導致發酵反應過度酸化，導致甲烷產量下降甚至停止。在厭氧發酵體系中常見的酸有：甲酸、乳酸、乙酸、丁酸和丙酸等有機酸，其中被認為比較理想的VFAs為乙酸和丁酸，這些有利于甲烷的生成[13]。本試驗中，也檢測到了常見的5種有機酸(圖3)，其中5個組中都出現酸有甲酸、乙酸、丙酸。甲酸出現在發酵過程的后期，乙酸主要出現在發酵過程的前期，主要存在于前8 d，5個組的第1天到第4天均有乙酸大量積累，使pH迅速下降，并奠定了第1個產氣高峰。柳枝稷含量高的處理，乙酸存在時間也越長，5個組合中乙酸消失的時間分別為5 d(A組、B組)、6 d(C組)、7 d(D組)、8 d(E組)，且在這階段pH下降最明顯，產氣量上升也最明顯；丙酸在整個發酵過程中均存在的時間較長，且不同組的丙酸含量差別不大，在第6天積累達到最大值后慢慢被降解利用，丁酸主要出現在C、D、E 3個組的前期，且柳枝稷含量越高的處理，丁酸出現的時間越長，濃度越高；而乳酸僅僅在苜蓿含量高的A、B、C 3個組中檢測到，而且僅出現在原料沒經過厭氧發酵前，這有可能是因為苜蓿本身含有乳酸。

3）凝膠時間變化。膠凝時間需要根據被加固土體的性質調整。地層含水量大時，漿液易被地下水稀釋，影響固結效果，需要縮短凝膠時間；含水量少，為了擴散一定范圍，需延長凝膠時間。

圖3 柳枝稷與苜蓿不同含固率配比下pH變化與揮發性脂肪酸含量變化Fig.3 Changes in pH and volatile fatty acid of switchgrass and alfalfa under different solid content ratios

2.3 柳枝稷與苜蓿共發酵細菌定性、定量分析

為確定發酵體系中微生物群落結構，采用16S rRNA基因克隆文庫方法對發酵液進行了細菌多樣性分析，每個處理隨機挑取細菌陽性克隆子200個，通過RFLP帶型分析以及在數據庫進行相似性檢索，分析微生物菌群親緣關系及相似性，各配比序列分析結果如表4所示。通過細菌16S rRNA基因序列進化分析，表明細菌主要屬于6個門，主要包括變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、互養菌門(Synergistetes) 以及一些尚未歸類的不可培養菌。

原始污泥中的細菌多樣性最高，共獲得25個OTUs，Bacteroidetes、Proteobacteria和Firmicutes為優勢菌群，分別占細菌克隆總數的28.6%、18.8%和18.8%；A組共獲得18個OTUs，Bacteroidetes、Firmicutes和Chloroflexi為優勢菌群，分別占細菌克隆總數的31.8%、20.5%和9.4%；B組共獲得24個OTUs，Bacteroidetes和Firmicutes為優勢菌群，分別占細菌克隆總數的37.1%和25.8%；C組共獲得16個OTUs，Chloroflexi、Firmicutes和Bacteroidetes為優勢菌群，分別占細菌克隆總數的30.0%、25.7%和20.0%；D組共獲得15個OTUs，Bacteroidetes和Synergistetes為優勢菌群，分別占細菌克隆總數的35.3%和21.6%；E組合共獲得23個OTUs，Bacteroidetes、Firmicutes和Synergistetes為優勢菌群，分別占細菌克隆總數的41.7%、31.3%和12.5%。不同試驗組之間優勢菌群稍有差別，但是擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)在所有配比中含量均較高，豐度在20.0%～41.7%和7.8%～31.3%。有研究表明：厚壁菌門和擬桿菌門是厭氧發酵的重要細菌。其可以將有機物分解為甲烷古菌可以利用的氫或乙酸[14]。擬桿菌門細菌參與了水解與酸化階段，可以將水解產生的碳水化合物、蛋白質、脂類分別通過糖酵解、氧化、脫氨基轉化為古菌可用的有機物。厚壁菌門(Firmicutes)被認為是一種可以降解各種底物并產生VFAs的共養細菌[12]，本試驗中的厚壁菌門的克隆子大多屬于Clostridia(梭菌綱)，這是一種嚴格厭氧的革蘭氏陽性桿菌，是一種水解酸化菌，喜歡中溫環境，為嗜氫產乙酸，可以通過分泌纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶降解纖維素成揮發性有機酸及醇類。

表4 接種污泥及柳枝稷與苜蓿不同含固率配比的細菌16S rRNA克隆子序列分析結果Table 4 Sequence analysis of bacterial 16S rRNA clones inoculated sludge and switchgrass and alfalfa under different solid content ratio

除了優勢菌群外，發酵體系內還含有一些豐度較低的門，如浮霉菌門(Planctomycetes)、互養菌門(Synergistetes)等。浮霉菌門被認為是細菌中分支多樣性最高的門。浮霉菌門菌體形態均為梨形，化能異養生長，可利用葡萄糖等多種糖類作為底物，不能利用有機酸、醇類、氨基酸作為碳源生長[15]。綠彎菌門(Chloroflexi)是自養型細菌，普遍存在于厭氧顆粒污泥中，包括在中溫和高溫條件下處理不同種類的有機廢物的厭氧反應器。該菌主要利用不同碳水化合物及氨基酸來進行自我生長，具有降解大分子有機物的能力，并能促進污泥顆粒結構的形成[16]。

圖4為試驗期5組細菌總量的定量PCR含量圖，從圖中可知細菌總量與產氣量變化呈現對應關系。苜蓿成分多，產氣反應進程快的A組與B組第5天細菌總量達到最大值，之后逐漸下降；而產氣反應進程比前者慢的C組與D組則在第9天細菌總量達到最大，如圖4，純柳枝稷的處理，細菌總量在第9天出現較高值，但前期一直沒有其他組合高，反而到30 d時才細菌量最高值。此外，30 d的檢測結果發現:純苜蓿A組細菌總量最少，各組隨著柳枝稷成分的提高,細菌總量也在增加。結合產氣變化、pH變化以及細菌總量可以發現，柳枝稷與苜蓿混合處理對發酵系統有利，在D組中，其pH變化溫和，細菌增殖活躍，產氣量多，厭氧反應體系穩定；純苜蓿雖然有利于細菌增殖，但產氣量不足；純柳枝稷雖然產氣量大，但反應體系穩定性較差。

圖4 柳枝稷與苜蓿不同含固率配比下細菌總量定量PCRFig.4 Quantitative PCR of total bacterial population in switchgrass and alfalfa under different solid content ratios

2.4 柳枝稷與苜蓿共發酵體系古菌的定量分析

利用本試驗樣品中檢測到的4種優勢甲烷菌-甲烷鬃毛菌(Mst)、甲烷桿菌(MBT)、甲烷八疊球菌(Msc)及甲烷微菌(MMB)的16S rDNA為模板，對本試驗的5個試驗組的樣品進行了定量PCR(Q-PCR)分析，結果如圖5所示。可見：各個組合中總體數量上，甲烷鬃毛菌(Mst)絕對優勢；其次是甲烷桿菌(MBT)和甲烷八疊球菌(Msc)；最少的是甲烷微菌(MMB)。

圖5 柳枝稷與苜蓿不同含固率配比下產甲烷古菌定量PCRFig.5 Quantitative PCR of methanogenic archaea of switchgrass and alfalfa under different solid content ratios

甲烷鬃毛菌是一類專營性嗜乙酸型古菌，以乙酸為唯一底物進行物質能量代謝[17]。其占優勢說明本試驗中各處理均是以嗜乙酸產甲烷途徑為主要的產甲烷途徑，甲烷鬃毛菌底物的親和性是甲烷八疊球菌的5～10倍，而且甲烷鬃毛菌屬是中溫厭氧發酵系統中的優勢菌群[18]。在共發酵的5個組中甲烷鬃毛菌的總體趨勢基本一致，為先增加后減少，最后在發酵結束時數量基本恢復到原始污泥中的水平甚至更低，可以推測甲烷鬃毛菌的盛衰與底物中可利用有機物的量同步，可見本研究的底物和發酵條件與甲烷鬃毛菌有高度的親和性。相對于原始污泥中，A、B、C、D、E 5組的甲烷鬃毛菌數量最大值，分別增長了70%、101%、42%、62%、35%。苜蓿含量多的處理，產氣進程快，甲烷鬃毛菌相應的在前期數量增長較快；而柳枝稷含量多的配比，產氣進程慢，甲烷鬃毛菌數量的增長則相對延遲，有研究表明，厭氧發酵過程中約70%的甲烷產量來自嗜乙酸型產甲烷菌[19]。甲烷桿菌是一類重要的嗜氫產甲烷菌，其在厭氧發酵過程中的總體趨勢與甲烷鬃毛菌基本一致，前期增加快后迅速降低，最后數量接近原始污泥中。而總量比甲烷鬃毛菌少得多。A、B、C、D、E 5組的甲烷桿菌數量最大值，分別是原始污泥數量的5.24、5.14、5.86、6.14、2.51倍。甲烷八疊球菌的數量變化趨勢與甲烷鬃毛菌和甲烷桿菌不同，在整個發酵反應進程中，數量逐漸增加，后期比前期多，與原始污泥相比，5組的發酵后期甲烷八疊球菌的數量出現了較大的增長，相對數量雖然增加很多，但在甲烷菌群總量的比例卻比較少。甲烷微菌是一種嗜氫型產甲烷菌，只能利用二氧化碳作為唯一碳源，利用氫氣或甲酸鹽為電子供體還原，而不能利用乙酸[20]。甲烷微菌的數量變化趨勢與甲烷八疊球菌相似，前期相對增殖緩慢，發酵后期逐漸增加，但增殖量卻不像甲烷八疊球菌那么劇烈。甲烷八疊球菌和微菌，常常在反應體系相對處于逆境時表現相對數量增加，而本研究中未出現這兩者突然增殖的現象，說明本研究的原料組合及反應條件對甲烷菌比較適合，并且本研究的累積甲烷產量高于大多數同類以柳枝稷為原料的試驗數據也證明這一點。

表5為產甲烷量與不同產甲烷菌的相關性分析結果。表中可知產甲烷量與甲烷桿菌(MBT)在P<0.01 呈極顯著正相關，與甲烷鬃毛菌呈正相關，與甲烷微菌(MMB)，甲烷八疊球菌(Msc)呈負相關，以上相關系數分別為0.577、0.349、-0.365、-0.202，以上與前文中甲烷鬃毛菌的富集有利于產氣量的提升，這與此相關性分析結果一致。

3 討論與結論

目前，已經有大量的研究探討了含纖維素原料與牛糞的共發酵。本研究中柳枝稷與苜蓿共發酵30 d的日甲烷量變化均出現三峰趨勢，總體由高逐漸下降。這與Zhao等[21]的結果類似，A、B、C、D、E 5個組的累計產甲烷量分別達到291.7、287.7、320.3、357.4、362.2 mL/g VS，此均高于Zheng等[8]柳枝稷與牛糞在產氣最高產甲烷量(158.6 mL/g VS)。其比ünyay等[4]用成熟干燥的柳枝稷為材料的甲烷產量(203.9 mL/g VS)高出77.6%。與柳枝稷的理論甲烷產量442.8 mL/g VS相比，本研究中E組的最高產甲烷量為理論值的81.8%。該產甲烷率在柳枝稷的厭氧發酵文獻中罕見。應該可以指出，能夠獲得如此高的甲烷產量，與本研究的柳枝稷原料取自正在生長中的綠色樣品有關，樣品可溶性物質含量較大，C/N也比較低(42)。結合上述產氣量和表1的C/N數據可見在C/N21～42均能得到較高的產氣量。ünyay等[4]指出干燥的柳枝稷C/N120，厭氧發酵時即使與大量的活性污泥混合也仍表現出養分不足。因此，柳枝稷中配比苜蓿共發酵其產氣效率在一定范圍內優于糞便、污泥等物料的混合發酵，本試驗結果證明高碳作物與高氮作物的共發酵可以為遠離牧區的地區以純植物為原料的沼氣工程解決發酵體系營養平衡問題提供重要途徑。

表5 產甲烷量與不同產甲烷菌相關性分析Table 5 Correlation analysis between methane production and different methanogens

另外，在柳枝稷與苜蓿共發酵中，原始污泥中的微生物多樣性最高，共發酵可以降低發酵體系的多樣性，這是因為發酵使得優勢菌群大量富集，相對降低了其他菌群的豐度，此與賈述飛[22]的觀點一致。發酵體系中細菌主要有6個門，其中最優勢菌門為擬桿菌門與厚壁菌門，這與喬江濤等[23]的研究相似，在含有纖維素的物料中，擬桿菌門與厚壁菌門，一般為主要的菌門。不同的是，除優勢菌門以外的其他菌門不同，可能的原因是發酵條件與物料不同。古菌方面，5個組中甲烷鬃毛菌為絕對優勢古菌，其含量遠大于其他菌種，有研究表明，當乙酸的濃度高于0.25～0.5 g/L時，同為嗜乙酸甲烷菌的甲烷八疊球菌將會成為優勢菌群，本試驗中，乙酸濃度一直維持于較小的水平，所以此時甲烷鬃毛菌含量較高，這與Luo等[24]、閆晶等[25]的研究一致，因此可以得出，柳枝稷、苜蓿共發酵菌群情況與牛糞、秸稈共發酵的菌群情況較為相近，不同的是牛糞發酵可以顯著增加發酵體系菌群的總量，但從產氣效率來看，柳枝稷與苜蓿共發酵菌群方面較為穩定。

通過研究和對比柳枝稷與苜蓿5組不同含固率配比的共發酵，本研究主要結論如下：

1)以新鮮柳枝稷和苜蓿為原料的批次厭氧發酵，5個組均在前15 d釋放出總產氣量的96%以上；

2)雖然純柳枝稷的累積產氣量最高，但其發酵系統發酵過程中pH偏低，D組(柳枝稷和苜蓿TS配比為3∶1)在緩沖能力和體系穩定性最優；

3)甲烷鬃毛菌為發酵體系微生物群的絕對優勢菌群，說明柳枝稷與苜蓿厭氧共發酵是較優越的厭氧發酵體系。

因此，柳枝稷與苜蓿厭氧共發酵可推薦作為無動物糞污地區高纖維原料厭氧發酵的新有效途徑。