NRTUAs感染對小鼠的組織荷蟲量及脾臟細胞因子轉錄水平的影響

任 超 王超越 盧春霞 王 思 段春慧 劉賢勇 索 勛*

(1.天津農學院 動物科學與動物醫學學院/天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室，天津 300384；2.中國農業大學 動物醫學院，北京100193)

非增殖型尿嘧啶營養缺陷型弓形蟲(Nonreplicating toxoplasma uracil auxotrophs，NRTUAs)是敲除弓形蟲的乳清酸核苷-5’-單磷酸脫羧酶(Orotidine-5’-monophosphate decarboxylase，ompdc)和尿嘧啶核苷磷酸化酶(Uridine phosphorylase，up)基因的蟲體[1-2]。NRTUAs體外必須在含有尿嘧啶的培養基中才能增殖，而在動物體內只能入侵宿主細胞卻不能增殖，進而降低蟲體的毒力和致病性[1]。NRTUAs感染免疫缺陷的動物，如IFN-γ敲除的小鼠或NOD/scid/gamma小鼠，NRTUAs表現為無致病性，而且感染小鼠能安全耐受，為NRTUAs能夠應用于腫瘤的治療提供安全保障[2-4]。NRTUAs能夠調節宿主的免疫系統，改善腫瘤的免疫抑制微環境。針對黑色素瘤、卵巢癌和胰腺癌，NRTUAs刺激機體迅速產生Th1型細胞因子，如IL-12和IFN-γ，并激活腫瘤相關區域和脾臟CD8+和CD4+T細胞，進而調節荷瘤小鼠的免疫機能，活化腫瘤抗原特異性CD8+T細胞，激發荷瘤小鼠產生顯著的抗腫瘤反應；NRTUAs還能促進腫瘤細胞分泌趨化因子CXCL9和CXCL10，招募T細胞，并影響腫瘤細胞的抗原呈遞和對T細胞分泌的IFN-γ的響應能力，從而調節T細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷[4-7]。

NRTUAs抗腫瘤效應基于弓形蟲自身抗原和蟲體的分泌抗原能夠調節宿主的免疫反應。弓形蟲profilin蛋白能夠激活單核巨噬細胞的TLR11與TLR12，活化MyD88并啟動下游信號通路，產生IL-12，激活先天性免疫和適應性免疫反應[8-9]。TLR7識別弓形蟲的單鏈RNA，TLR9識別弓形蟲基因組中非甲基化CpGDNA和寡核苷酸，當TLR11缺乏時，TLR7和TLR9能誘導MyD88活化發揮作用[10-11]。研究表明，具有活性的NRTUAs主動入侵宿主細胞并能產生和分泌微線體(MIC)、棒狀體(ROP)和致密顆粒(GRA)，調節宿主細胞的信號傳導和轉錄途徑的調控，才能誘導T細胞產生IFN-γ并激活抗腫瘤特異性CD8+T細胞免疫反應，而ROP5、ROP18、ROP35、ROP38、GRA2、GRA12和GRA24的缺失顯著降低了NRTUAs的抗腫瘤反應[5,12-13]。TLR2能夠識別弓形蟲MIC，如MIC1和MIC4，也可被弓形蟲表面的糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl phosphatidyl inositol，GPI)、弓形蟲熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)所激活，進而調節TNF-α和CCL2的表達[14-15]。TLR2與TLR1和TLR6形成二聚體表達于細胞表面，受抗原刺激后引起細胞活化，并上調 IL-12 的表達[16]。MIC1和MIC4通過TLR4內吞作用誘導巨噬細胞產生IL-10，從而抑制宿主的炎癥反應，減輕過度炎癥反應造成的病理損傷[17]。上述研究表明，NRTUAs能夠激發宿主多種TLRs，通過刺激先天性免疫與適應性免疫，能夠打破腫瘤微環境的免疫耐受，激活腫瘤抗原特異性CD8+T細胞群的強效殺傷功能，表現出類似免疫增強劑的功效[1]。

目前，很多NRTUAs均以I型強毒株為背景構建[2-3,18-19]，而昆明小鼠對I型蟲株非常敏感，1個速殖子感染都可以導致小鼠死亡[20]。因此，將NRTUAs作為畜禽免疫增強劑開展功能性研究之前，都要以小鼠為模型，檢測NRTUAs對小鼠的致病性，以初步評估NRTUAs能否進一步應用。鄂立林等[18]構建NRTUAs，并發現NRTUAs對小鼠無致死性，是一種減毒甚至基本無毒的弓形蟲活疫苗，具有作為生物免疫治療載體的應用潛力。任超等[19]以弓形蟲Δku80RH蟲株為背景蟲株，利用CRISPR-Cas9系統敲除其ompdc和up基因，構建NRTUAs，通過初步探討NRTUAs對小鼠的致病性，發現NRTUAs對小鼠無致死性，且感染NRTUAs的小鼠各器官無病理變化。然而NRTUAs在小鼠重要器官的組織分布與清除情況，以及NRTUAs激發宿主先天性免疫相關細胞因子的表達情況均未知，這些也是影響NRTUAs實際應用的安全性與有效性。因此，本研究通過分析NRTUAs感染小鼠的組織荷蟲量與脾臟相關細胞因子的轉錄水平，進一步研究NRTUAs對小鼠的致病性，為NRTUAs作為畜禽免疫增強劑的應用奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗動物

7周齡雌性SPF級昆明小鼠72只，體重為(20±2) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼料充足，飲水不限，健康狀況良好。

1.1.2細胞與蟲株

人包皮成纖維細胞(HFF)、弓形蟲Δku80RH蟲株和NRTUAs，由中國農業大學國家動物原蟲實驗室保存。其中NRTUAs以弓形蟲Δku80RH蟲株為背景蟲株，利用CRISPR-Cas9系統敲除弓形蟲ompdc和up基因而構建，體外培養中，細胞培養液中需要添加250 μmol/L尿嘧啶維持NRTUAs增殖[19]。

1.1.3精密儀器和試劑

分光光度計，購自ThermoFisher公司；Real-time PCR儀和PCR儀，購自美國ABI公司；基因組提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；質粒小提試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；RNA提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；反轉錄試劑盒，購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；相對定量qPCR SuperMix，購自美國ABI公司；絕對定量Probe qPCR SuperMix，購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1非增殖型尿嘧啶營養缺陷型弓形蟲感染小鼠的組織荷蟲量檢測

(1)組織荷蟲量檢測方法建立

參考NCBI Genebank中B1基因的部分序列(AF179871)，按照基因組提取試劑盒的說明書提取Δku80蟲株的基因組，并以此為模板，擴增B1序列，引物參考Lin等[21]2000年發表的文章，檢測引物和探針見表1。將獲得的B1片段連接到pEASY-T1 Simple克隆載體上構建標準質粒。將10-1～10-12稀釋倍數的B1標準質粒進行熒光定量PCR反應，檢測引物見表1。根據試驗結果形成的溶解曲線和擴增曲線，來判斷熒光定量引物是否適合，并選擇適宜稀釋倍數的B1標準質粒，繪制標準曲線。

(2)組織荷蟲量檢測

將雌鼠隨機分成3組，每組24只，在實驗第0天，各組以腹腔注射方式分別感染NRTUAs、Δku80蟲株，速殖子懸液濃度為107個/mL，感染劑量為0.1 mL/只，同時腹腔注射等劑量的無菌PBS為空白對照。在試驗第0～7天，每日各組隨機剖檢3只小鼠，取脾臟、肝臟、肺臟和腦組織，用于荷蟲量檢測。按試劑盒要求，每個待檢組織取適量，稱重并記錄，用組織研磨機進行勻漿處理。11 000 r/min離心2 min，完全棄去上清，后續步驟詳見基因組提取試劑盒說明書。取1 μL待檢組織基因組進行絕對熒光定量PCR，反應條件為94 ℃，30 s；94 ℃，5 s；60 ℃，30 s。獲得待檢組織的拷貝數，根據B1標準質粒的初始濃度，推算出待檢組織的荷蟲量。

表1 組織荷蟲量qPCR反應引物和探針[21]Table 1 qPCR primers and probe of parasite load[21]

1.2.2非增殖型尿嘧啶營養缺陷型弓形蟲感染小鼠后脾臟細胞因子轉錄水平分析

(1)RNA提取與純化：采集實驗第1～3天的各組脾臟，分別取5 mg，加入350 μL裂解液 RLT Plus，電動勻漿器將組織徹底研磨勻漿，離心13 000 r/min，3 min，后續按照RNA提取試劑盒說明書提取脾臟組織的RNA。

(2)反轉錄：獲得的RNA通過分光光度計檢測RNA濃度，利用反轉錄試劑盒實施反轉錄試驗，獲得的cDNA保存于-20 ℃。

(3)相對熒光定量PCR：將cDNA稀釋10倍進行檢測，反應引物見表2，反應條件為 50 ℃，2 min；95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min。

1.2.3數據處理與統計學分析

2 結果與分析

2.1 非增殖型尿嘧啶營養缺陷型弓形蟲感染小鼠的組織荷蟲量檢測

2.1.1組織荷蟲量檢測方法建立

B1片段的擴增大小為98 bp(圖1(a))，構建好的標準質粒大小為3 927 bp，標準質粒的分子量為2.59×106g/mol，標準質粒質量濃度為0.335 g/mL，根據公式計算出標準質粒的拷貝數為7.786×1013copies/μL。B1標準質粒經過逐級稀釋，選擇其中呈線性較好的5個數量級梯度，每個梯度的Ct值相差約-3.3，R2>0.99，效率>95%(圖1(b)和(c))，可用于后續的絕對熒光定量檢測。

表2 小鼠細胞因子qPCR反應引物Table 2 Primers for qPCR of mouse cytokines

(a) B1標準質粒鑒定：1、2：B1標準質粒鑒定為陽性；M：DNA標準AL5000；(b)標準曲線；(c)擴增曲線。(a) Identification of B1 standard plasmid:1,2:Identification of B1 standard plasmid was positive;M:AL5000 DNA Marker；(b) Standard curve;(c) Amplification curve。圖1 組織荷蟲量檢測方法建立Fig.1 Establishment of a method to detect parasite load

2.1.2組織荷蟲量檢測

試驗前各組小鼠組織中未檢出蟲體，試驗中每日檢測脾臟、肝臟、肺臟、腦組織的荷蟲量，NRTUAs組各器官組織荷蟲量的平均水平不高于Δku80組(圖2)。由于Δku80組小鼠在第6天全部死亡，所以Δku80組的組織荷蟲量只檢測感染后第0～6天。NRTUAs組小鼠一直檢測到感染后第7天，發現均無死亡。

(a)～(d)分別為兩組脾臟、肝臟、肺臟和腦組織的荷蟲量；(e)～(h)分別為NRTUAs組脾臟、肝臟、肺臟和腦組織的荷蟲量。*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.000 1，無標記代表P>0.05。(a)-(d) respectively represent parasite load in spleen,liver,lung and brain of two groups.(e)-(h) respectively represent parasite load in spleen,liver,lung and brain of NRTUAs group.* means P<0.05,** means P<0.01,*** means P<0.001,**** means P<0.000 1,no sign means P>0.05.圖2 小鼠脾臟、肝臟、肺臟、腦組織的荷蟲量Fig.2 Parasite load in spleen,liver,lung and brain of mice

脾臟的荷蟲量，僅在感染后第5天，NRTUAs組極顯著低于Δku80組(P<0.001)，其他時間兩組差異不顯著(P>0.05)。NRTUAs組每日的荷蟲量也是上下浮動，變化趨勢無規律，僅在感染后1～4 d有個別脾臟未檢出蟲體DNA，其他脾臟均能檢出荷蟲量。Δku80組隨時間的延長，脾臟的荷蟲量水平不斷提高(圖2(a)和(e))。

肝臟的荷蟲量，在感染后第5天，NRTUAs組極顯著低于Δku80組(P<0.001)，在感染后第6天，NRTUAs組顯著低于Δku80組(P<0.05)，其他時間兩組差異不顯著(P>0.05)。NRTUAs組幾乎每日出現個別肝臟未檢出蟲體DNA，其他肝臟均能檢出荷蟲量。Δku80組隨時間的延長，肝臟的荷蟲量水平不斷提高(圖2(b)和(f))。

肺臟的荷蟲量，僅在感染后第6天，NRTUAs組極顯著低于Δku80組(P<0.001)，其他時間兩組差異不顯著(P>0.05)。NRTUAs組僅在感染后1～3 d有個別肺臟未檢出蟲體DNA，其他肺臟均能檢出荷蟲量。兩組隨時間的延長，肺臟的荷蟲量水平不斷提高(圖2(c)和2(g))。

腦組織的荷蟲量，每日兩組差異均不顯著(P>0.05)。NRTUAs組每日都有腦組織未檢出蟲體DNA。Δku80組在感染后第2～6天，腦組織的荷蟲量平均水平高于NRTUAs組(圖2(d)和(h))。

2.2 非增殖型尿嘧啶營養缺陷型弓形蟲感染小鼠后脾臟細胞因子轉錄水平分析

在本試驗中，研究NRTUAs感染對小鼠脾臟相關細胞因子表達的影響(圖3)。其中，IL-12在感染第1天，NRTUAs組和Δku80組極顯著高于PBS組(P<0.01)(圖3(a))；TNF-α在感染第3天，NRTUAs組極顯著高于PBS組(P<0.01)，Δku80組顯著高于PBS組(P<0.05)(圖3(b))；IFN-γ在感染第2和3天，Δku80組顯著高于PBS組(P<0.05)(圖3(c))；IL-1β在感染第1天，Δku80組顯著高于NRTUAs組(P<0.05)，極顯著高于PBS組(P<0.000 1)，在感染第2天，Δku80組極顯著高于NRTUAs組(P<0.01)和PBS組(P<0.000 1)，在感染第3天，Δku80組顯著高于PBS組(P<0.05)(圖3(d))；IL-6在感染第1天，Δku80組顯著高于PBS組(P<0.05)，在感染第2天，Δku80組極顯著高于NRTUAs組(P<0.001)和PBS組(P<0.000 1)，在感染第3天，Δku80組極顯著高于NRTUAs組(P<0.01)和PBS組(P<0.001)(圖3(e))；IL-10在感染第2天，Δku80組顯著高于PBS組(P<0.05)，在感染第3天，NRTUAs組(P<0.001)和Δku80組(P<0.000 1)極顯著高于PBS組(圖3(f))。

3 討論與結論

尿嘧啶營養缺陷型弓形蟲有弓形蟲ΔcpsIIRH蟲株(cps1-1)、弓形蟲ΔompdcΔku80RH 蟲株和弓形蟲ΔompdcΔupΔku80RH蟲株[2-3]。其中cps1-1蟲株和ΔompdcΔku80RH 蟲株阻斷了嘧啶從頭合成途徑，減輕了蟲體的毒力和致病性，但蟲體存在嘧啶補救途徑，在宿主體內能夠緩慢增殖，長期存在動物體內，蟲體的毒力具有返強的風險，不能應用于畜禽養殖中[2-3]。因此，弓形蟲 ΔompdcΔupΔku80RH蟲株才是真正的NRTUAs[1]。由于嘧啶從頭合成途徑和嘧啶補救途徑均被阻斷，NRTUAs可能沒有能力去利用宿主細胞的UP來完成嘧啶補救途徑進而維持蟲體的增殖，或是NRTUAs利用宿主細胞的UP并獲得宿主細胞的尿嘧啶，但這條途徑產出的UMP不足以維持NRTUAs的增殖，進而不能在宿主細胞內增殖，這就確保了NRTUAs在畜禽養殖中使用的安全性[22]。

研究表明，NRTUAs能夠激發宿主良好的細胞免疫應答，既是優秀的抗弓形蟲疫苗株，又是潛在的抗腫瘤神器[1]。然而蟲體入侵宿主細胞，在宿主體內的存續時間亦對蟲體的使用安全性提出新的挑戰。研究表明，NRTUAs感染小鼠后，5 d左右就能被機體的免疫系統快速清除[1，23]。然而在本研究中，通過絕對熒光定量PCR進行檢測，發現NRTUAs組小鼠的脾臟、肝臟、肺臟和腦組織，在感染后第7天，仍然能檢出蟲體DNA，這與前人的研究相悖。Dupont等[23]研究NRTUAs在小鼠體內的存續時間中，只檢測了脾臟、淋巴結等免疫系統，對于其他器官并未進行系統檢測，而且其檢測手段通過對免疫系統的相關組織分離抗原遞呈細胞，經過流式細胞術分選蟲體感染的特異性抗原遞呈細胞。然而受檢測樣本的廣度和樣本處理方式的影響，這種研究方法并不能全面判斷NRTUAs被機體徹底清除。因此，未來還需要延長檢測時間，擴大檢測器官組織的種類，并結合其他技術手段，如免疫組織化學、可見光活體成像技術等，進一步研究NRTUAs在體內的遷移、分布與清除過程。

弓形蟲刺激機體分泌的細胞因子與全身性炎癥反應休戚相關。IL-12刺激T細胞和NK細胞分泌IFN-γ，增強CD8+T細胞和NK細胞的殺傷功能；促進CD4+T細胞向Th1型分化，有利于提高吞噬細胞的活性，作為固有免疫和適應性免疫的橋梁有效提高機體的細胞免疫功能進而對抗弓形蟲的感染[24-25]。小鼠的CD8α+DC通過TLR11和TLR12識別并結合弓形蟲profilin蛋白，活化MyD88并啟動下游信號通路，產生IL-12，并在急性感染期間，刺激T細胞和NK細胞分泌IFN-γ，促進巨噬細胞的吞噬功能[8-9]。NRTUAs刺激小鼠脾臟極顯著上調IL-12、TNF-α和IL-10的表達，IL-12和TNF-α能夠促進Th1型反應。盡管Th1型反應有利于弓形蟲的清除，但Th1型反應過度會加劇炎癥，增強組織損傷。IL-10 是介導免疫抑制的細胞因子，抑制Th1型反應，抑制巨噬細胞的細胞因子分泌與抗原遞呈功能，緩解因過度炎癥反應而導致的器官和組織損傷[26-27]。IL-10、IL-12和TNF-α 3種細胞因子共同作用，以溫和的方式協調機體的炎癥反應，避免因過度的炎癥反應而導致器官組織損傷。研究發現NRTUAs感染小鼠的各器官無顯著的病理變化[19]，而細胞因子的變化恰好揭示NRTUAs對小鼠的致病性低。

*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001，****代表P<0.000 1，無標記代表P>0.05。* means P <0.05,** means P<0.01,*** means P<0.001,**** means P<0.000 1,no sign means P>0.05.圖3 小鼠脾臟細胞因子轉錄水平分析Fig.3 Analysis of cytokine transcription levels in mice spleen

IL-1能夠促進抗原遞呈細胞上調MCHII分子、各種黏附分子、IFN-γ受體的表達水平；直接作用于Th細胞，輔助其活化，在啟動適應性免疫應答的過程中發揮重要作用[28]。Δku80組刺激小鼠脾臟表達高水平的TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ，其中IL-6與IL-1和TNF協同刺激T細胞，促進全身性炎癥反應，IFN-γ的分泌又進一步加重了炎癥反應。上述細胞因子聯合誘導急性炎癥反應，雖然IL-10的分泌也顯著提高，但由于誘導的炎癥反應過于猛烈，加速組織損傷，進而影響器官功能的發揮，最終導致小鼠死亡。研究表明，Δku80蟲株感染主要誘發小鼠的急性炎癥反應進而導致全身性組織的變性壞死，典型的病變如壞死性肝炎、間質性肺炎、急性炎性脾腫、非化膿性腦炎等[19]，而上述細胞因子的變化也佐證了Δku80蟲株對小鼠的高致病性。

綜上所述，本研究以NRTUAs和Δku80蟲株分別感染小鼠，檢測各組小鼠的組織荷蟲量與脾臟相關細胞因子的轉錄水平。結果表明，NRTUAs感染的小鼠不能在7 d內清除蟲體，刺激小鼠脾臟上調IL-12、TNF-α和IL-10的表達，誘導溫和的炎癥反應，而Δku80蟲株感染的小鼠在感染后6 d內死亡，組織荷蟲量平均水平高于NRTUAs感染的小鼠，刺激小鼠脾臟上調IL-12、TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-10的表達，誘導劇烈的炎癥反應而導致小鼠死亡。說明NRTUAs對小鼠的致病性較低，NRTUAs組織荷蟲量平均水平低于Δku80蟲株，誘導機體的炎癥反應顯著輕于Δku80蟲株，本研究為NRTUAs作為畜禽免疫增強劑的開發提供基礎數據。