siRNA干擾LOXL2基因在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的相關性研究

王 猛，王 品，黃 謙，沈 劍，曾佳佳，蔣濤濤

（深圳市龍華區人民醫院 1.燒傷整形外科；2.超聲影像科；3.產科 廣東 深圳 518109）

瘢痕疙瘩（Keloid）是整形外科研究的難題之一，它是一種皮膚纖維化疾病，被認為是皮膚的良性腫瘤[1]。該病的特征是瘢痕超出最初損傷邊緣呈浸潤性生長[2]，且無自行消退傾向。瘢痕疙瘩不僅影響美觀，還能引起疼痛、瘙癢等伴隨癥狀，若發生在關節部位還有可能影響關節功能，造成患者終生的痛苦。瘢痕疙瘩目前多采用瘢痕疙瘩內藥物注射、外科手術、局部放療、加壓療法等多種治療方案相結合來治療，但療效大都不盡如人意，因此該疾病的治療仍是一個世界性難題[3-8]。賴氨酰氧化酶樣蛋白2（Lysyl oxidase like 2，LOXL2）屬于賴氨酸氧化酶（LOX）家族，LOXL2基因定位于人類染色體8p21.3，編碼蛋白質含744個氨基酸殘基，分子質量約87kD，可激活膠原蛋白和彈力蛋白的賴氨酸殘基，引起膠原蛋白和彈力蛋白的交聯，還可通過細胞外基質調控腫瘤細胞生長增殖。此外，張浩[9]等研究發現，LOXL2可能在增生性瘢痕發病中發揮重要作用，是一個新的潛在的治療靶點。因此，本研究欲探索抑制LOXL2表達對瘢痕疙瘩成纖維細胞（KFs）增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響，以期為防治病理性瘢痕提供科學的理論導向。

1 資料和方法

1.1 正常皮膚離體標本10例：取皮膚外科修整“貓耳”切除術中切除的正常皮膚組織作為立體標本。

入選標準：①性別不限；②年齡18～60歲；③排除重大系統疾患；④組織標本采集前獲得所有患者的知情同意，患者在手術協議書上簽字同意手術；⑤研究得到醫院醫學倫理委員會的批準。

1.2 瘢痕疙瘩標本10例：取自2017年01月-2020年01月深圳市龍華區人民醫院整形外科門診及住院手術患者經手術切除的瘢痕組織作為離體標本。

入選標準：①參考2018年的《中國瘢痕疙瘩臨床治療推薦指南》，符合瘢痕疙瘩的診斷標準[10]；②瘢痕邊緣呈“蟹足狀”樣突起，質地堅硬；病理組織學檢查證實所取瘢痕疙瘩組織內有膠原及基質成分的大量沉積，成纖維細胞很多，并有分裂像；皮損處無感染病灶；病程大于1年且無自愈傾向、無自行消退；③皮損處未接受過任何藥物、放射、激光等治療；④排除其他重大系統性疾病；⑤年齡18～60歲，性別不限；⑥研究得到本院醫學倫理委員會的批準。瘢痕疙瘩基線資料見表1。

表1 基線資料表

1.3 試劑：DEME培養基、胎牛血清和PBS(美國Gibco公司)；CCK-8試劑(上海東仁化學科技有限公司)；cDNA反轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(大連 Meilunbio生物技術有限公司)；DKK3、CAPDH一抗和HRP羊抗兔二抗(美國Abcam公司)；Lipofectamine2000轉染試劑盒(Invitrogen 公司)；PCR引物、小干擾RNA（Small interfering RNA,siRNA）由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 瘢痕疙瘩成纖維細胞（KFs）及正常皮膚成纖維細胞（NFs）的獲取和培養：將收集的瘢痕疙瘩組織及正常皮膚組織塊放置于培養皿中，用含青、鏈霉素（1 000 U/ml）的無菌PBS反復漂洗至無血色；無菌眼科剪去除表皮、結締組織和血管，用眼科剪反復剪切成1～3 mm2的小碎塊，并分散接種于經FBS潤濕的5 cm×5 cm細胞培養瓶中；倒置培養瓶并加1 ml 50% FBS完全培養基，置于37℃，5% CO2的恒溫培養箱內培養；8～12 h后翻轉培養瓶；繼續培養至鏡下可見長梭形的細胞爬出（約3～5 d），每隔2～3 d更換一次50% FBS完全培養基；待原代細胞爬滿大部分培養瓶底時，敲除組織塊；PBS洗滌2遍，更換一次50% FBS完全培養基，繼續培養。待原代培養的細胞生長至單層時加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，繼續傳代培養。選取第4～6代的成纖維細胞進行后續實驗。

1.5 qRT-PCR檢測KFs及NFs中的LOXL2 mRNA的表達：取凍存正常皮膚和瘢痕疙瘩組織置于預冷研缽，加液氮后研磨至粉末，移入勻漿器中。Trizol法提取總RNA，反轉錄為cDNA，以GAPDH為內參進行qRT-PCR。LOXL2引物序列：上游（F），5’-GTGGATCTGGCACGACTGTCA-3’；下游（R），5’-TTGAGCTTCAGCAGGTCATAGTGG-3’。GAPDH引物序列：上游（F），CCCTTCATTGACCTCAACTACAR；下游（R），5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。根據試劑盒及儀器使用說明書，設置實驗程序反應溫度及時間。PCR反應條件：預變性95℃ 2 min，95℃ 10 s，退火60℃ 1 min，延伸70℃，40個循環，4℃保存。反應結束后確認qPCR的擴增曲線和融解曲線，并按照2-△△t方法進行運算，從而得出相應的結論。

1.6 細胞轉染：取第4～6代的瘢痕疙瘩成纖維細胞后，分為3組（KF組、si-NC、si-LOXL2），使用Primer Premier 6.0設計LOXL2特異性小的干擾RNA。si-LOXL2組RNA序列，5'-CAGUCUAUUAUAGUCACAU-3'；si-NC組（陰性對照組）RNA序列，5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'。上海吉瑪制藥技術有限公司采用脂質體介導法合成，使用LipofectamineTM2000按照說明書將脂質體分別轉染三組瘢痕疙瘩成纖維細胞中，詳細步驟見說明書。

1.7 Western Blot檢測3組相關蛋白表達情況：提取樣本總蛋白，進行蛋白定量后，各取50μg蛋白樣本上樣，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至PVDF膜，將其放入TBST配制的5%脫脂奶粉中封閉1 h。一抗孵育：取下PVDF膜用PBST漂洗1次，再小心把一抗稀釋（按說明書配制通常為，抗體:稀釋液=1:5 000）滴入孵育膜中，4℃搖床過夜。二抗孵育：使用二抗稀釋液（按說明書配制通常為，抗體:稀釋液=1:5 000），滴入PBST洗滌3次的PVDF，孵育，室溫搖床1 h，取膜置于PBST洗滌3次，每次10 min，再轉入干凈PBST中。顯影：在暗室中，使用ECL化學發光法，按照試劑盒說明書進行顯影，用化學發光凝膠成像儀采集，顯影所得條帶用Image J軟件進行灰度值掃描分析。

1.8 CCK-8檢測KFs組，LOXL2陰性對照組（si-NC），LOXL2抑制表達組（si-LOXL2）的細胞增殖能力：分別取轉染0、24、48、72 h的3組實驗細胞，調整細胞濃度為4×104個/毫升，接種于96孔板，每組設3個復孔。37℃培養48 h后，加入10μL的CCK-8試劑，酶標儀檢測測定450 nm波長各孔的吸光度值，取均值繪制生長曲線。

1.9 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測3組瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡情況：取對數生長周期的3組細胞培養24 h。調整細胞密度為每毫升1×105，PBS洗滌2次，加入100 μl Binding Buffer和10 μl FITC標記的Annexin-V，室溫避光30 min，再加入5 μl PI，避光反映5 min后，加入400 μl Binding Buffer，試劑分別加入離心管中重懸細胞，要求細胞數達到1×106細胞/毫升；上機定量檢測。結果計算方法：細胞凋亡率=(凋亡細胞數量/正常細胞數量)×100%。

1.10 TransweⅡ細胞侵襲實驗：在無菌條件下冰浴融化Matrigel，用PBS稀釋成1 mg/ml，-20℃凍存備用。取出已經稀釋好的Matrigel，冰浴融化，以50 ml的體積鋪于TramweⅡ小室（24孔板），37℃放置1 h，使Matrigel聚合成凝膠。每孔加入200 μl 1640培養基使凝膠重構。在Transwell下室中加入趨化因子。在上室孔中準確加入細胞1×105個/孔，KFs組，LOXL2陰性對照組（si-NC），LOXL2抑制表達組（si-LOXL2）后，對數生長期細胞制備懸液后取200 μl，培養48 h。培養時間結束后，棄去上室液體，小心取出上室，用濕棉簽擦去膜上微穿過膜的細胞。4%中性甲醛固定10 min，Giemsa染色10 min，PBS洗滌3次，干燥，取下微孔濾膜，倒置顯微鏡下直接觀察穿過膜的細胞

1.11 統計學分析：應用SPSS 26.0分析，采用兩獨立樣本t檢驗，多組采用單因素方差分析和SNK-q檢驗，檢驗水準P＜0.05。

2 結果

2.1 KFs和NFs中LOXL2 mRNA的表達：運用qRT-PCR檢測兩組組織中LOXL2 mRNA相對表達水平，分別為1.002±0.158 vs 0.465±0.104，差異具有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 KFs和NFs中LOXL2 mRNA的表達

2.2 KFs組，LOXL2陰性對照組（si-NC），LOXL2抑制表達組（si-LOXL2）成纖維細胞相關蛋白表達情況：運用Western Blot檢測三組LOXL2蛋白含量，si-LOXL2組對比其他兩組，LOXL2蛋白表達明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 三組瘢痕成纖維細胞的LOXL2蛋白含量

2.3 KFs組，LOXL2陰性對照組（si-NC），LOXL2抑制表達組（si-LOXL2）細胞增殖情況：通過CCK-8實驗結果顯示，接種24 h后各組成纖維細胞增殖能力無明顯差異，無統計學意義（P＞0.05）；48 h時后KFs組與si-NC組成纖維細胞增殖活性逐漸增高，差異具有統計學差異（P＜0.05）；si-LOXL2組在48 h及72 h時生長速度低于其他組，降低程度與si-NC組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05），提示抑制LOXL2基因表達能抑制成纖維細胞增殖，見表2，圖3。

表2 三組瘢痕成纖維細胞不同時段的OD值 （±s）

表2 三組瘢痕成纖維細胞不同時段的OD值 （±s）

組別 時間 0 h 24 h 48 h 72 h KFs組 0.490±0.021 0.530±0.014 0.791±0.020 1.130±0.125 si-NC組 0.496±0.023 0.535±0.024 0.790±0.030 1.248±0.015 si-LOXL2組 0.493±0.025 0.550±0.023 0.520±0.021 0.435±0.016

圖3 三組瘢痕成纖維細胞不同時段OD值

2.4 KFs組，LOXL2陰性對照組（si-NC），LOXL2抑制表達組（si-LOXL2）細胞凋亡情況：運用流式細胞儀檢測，KFs組與si-NC組細胞凋亡未見明顯差異，無統計學意義（P＞0.05）。si-LOXL2組相對其他兩組細胞凋亡明顯增加，發現凋亡程度與si-NC組相比差異有統計學意義（P＜0.05），特別是細胞早期凋亡，提示抑制LOXL2可以促進瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡，見圖4。

圖4 三組瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡情況

2.5 si-RNA對瘢痕疙瘩成纖維細胞侵襲的影響：通過TransweⅡ小室檢測三實驗組細胞，si-NC組與KFs組細胞轉移到小室下壁的細胞數目無明顯差別，無統計學意義（P＞0.05），而si-LOXL2組細胞數明顯減少，抑制LOXL2可明顯降低KF細胞侵襲性，與si-NC組相比，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 三組瘢痕疙瘩成纖維細胞侵襲性情況

3 討論

瘢痕疙瘩是一種皮膚纖維增生性疾病，其病理特征主要是皮膚受損后成纖維細胞大量增殖，以及以膠原纖維為主的細胞外基質過度增生和沉積[11-12]，較少自行消退，多數將伴隨著患者的一生。學者認為瘢痕疙瘩形成與腫瘤相關基因的遺傳和表觀遺傳改變有關。因此尋找瘢痕疙瘩的相關調控基因已成為當前瘢痕研究的熱點之一。然而，瘢痕疙瘩的具體發病機制尚未完全了解[13]。近些年來，研究者發現瘢痕疙瘩中成纖維細胞的過度增殖和膠原的堆積沉淀可能與某些原癌基因和抑癌基因的突變有關[14-15]。

賴氨酰氧化酶樣2（LOXL2），一種促進細胞外間質膠原纖維網絡的酶。通過細胞外基質調控腫瘤細胞生長增殖，在多種腫瘤中高表達[16-20]，抑制LOXL2可以促進癌細胞凋亡，抑制侵襲等相關生物特性。Puente[21]等人發現LOXL2抑制劑能減少瘢痕疙瘩成纖維細胞數量、增殖、集落形成和細胞生長，并能誘導細胞周期阻滯和增加細胞凋亡。Matsuo[22]等人發現抑制LOXL2表達可以抑制轉化生長因子-β1誘導的肌成纖維細胞前體標志物的表達、原肌成纖維細胞的出現以及肺成纖維細胞分化成肌成纖維細胞的進化.Mohseni[23]通過靶向賴氨酰氧化酶（LOX）發現可以減緩肝纖維化進程，考慮其抑制轉化生長因子-β1通路從而抑制成纖維細胞增值及炎癥介質產生。另有研究者發現抑制LOXL2不僅僅能抑制細胞纖維化，還能作用于加速膠原降解，促進MMPs分泌[24]。Wu[25]在肝細胞癌體外實驗中發現上調LOXL2表達能激活了JNK/c-JUN信號通路影響纖連蛋白產生、MMP9的表達、細胞粘附等，從而影響細胞外基質合成。因此，LOXL2在創傷愈合[26]、器官纖維化[27]、腫瘤侵襲[28]等過程中發揮重要作用。

本研究中發現LOXL2基因在瘢痕疙瘩中高表達。研究發現其一方面可能通過激活了JNK/c-JUN信號通路影響纖連蛋白生成、MMP、細胞黏附等，從而影響細胞外基質合成，促進瘢痕疙瘩發生發展，而另一方面可能間接激活TGF-β通路促進成纖維細胞的增殖，誘導合成以膠原蛋白為主的細胞外基質的過度沉積，形成瘢痕疙瘩[29]。此次研究通過抑制LOXL2轉錄發現可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、侵襲，促進凋亡等相關生物特性。提示LOXL2可能是一個新的潛在的治療靶點。然而，關于LOXL2在瘢痕成纖維細胞中具體介導了哪些信號通路還有待深入研究。