miR-892a通過(guò)細(xì)胞外因子/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路調(diào)控對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

伍宏亮，李文永，汪 盛，陳志軍，關(guān) 翰

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽蚌埠 233004）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是一種發(fā)生于前列腺的上皮惡性腫瘤，是老年男性最常見(jiàn)的癌癥[1]。目前，臨床上多采用根治性前列腺切除術(shù)和放療治療前列腺癌, 約70%的患者得到治愈[2]。然而，前列腺癌晚期大多數(shù)患者發(fā)展成去勢(shì)抵抗性前列腺癌從而導(dǎo)致治療效果欠佳，易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其5年生存率不足30%[3]。微小RNA （miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性長(zhǎng)度為20～22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)中發(fā)揮著重要作用。miR-892a作為一種重要的抑癌基因，已被證實(shí)參與了肝癌、喉癌、口腔癌的發(fā)展進(jìn)程[4]。本研究旨在探討miR-892a在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及其過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響和相關(guān)機(jī)制，為診治前列腺癌尋找新的生物學(xué)指標(biāo)提供了理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 人正常前列腺上皮細(xì)胞系（RWPE-1）及人前列腺癌細(xì)胞系（DU145、PC3）來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。RPMI 1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清（FBS）、二甲亞砜（DMSO）均購(gòu)自美國(guó)ThemoFisher公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司。磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體、放射免疫沉淀試驗(yàn)（RIPA ）裂解液、喹啉甲酸（BCA）試劑盒和總RNA抽提試劑（TRIzol）試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技公司。實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司、Olympus熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。miR NC及miR-892a mimic由上海生工合成本研究經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的DU145細(xì)胞接種于6孔板（5×105個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h后, 嚴(yán)格按照Lip2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組（BC）即BC組，轉(zhuǎn)染空載病毒陰性對(duì)照組（NC）即miR-NC組；轉(zhuǎn)染miR-892a過(guò)表達(dá)慢病毒序列為miR-892a mimic組。每組6個(gè)復(fù)孔。慢病毒載體由上海吉瑪生物制藥有限公司構(gòu)建（提供慢病毒序列）。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將過(guò)表達(dá)miR-892a細(xì)胞接種至96孔板（1×105個(gè)/孔），參照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入CCK-8試劑檢測(cè)各組細(xì)胞活性，采用酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad；型號(hào)：1680）檢測(cè)450 mm波長(zhǎng)吸光度值（OD）值表示細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=[實(shí)驗(yàn)孔吸光度-空白孔吸光度]/[對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度] ×100%。

1.4 qRT-PCR檢測(cè) miR-892a、細(xì)胞外因子（Wnt）、β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）、c-myc基因及轉(zhuǎn)錄因子SOX5的mRNA（信使核糖核酸）表達(dá) 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的DU145細(xì)胞，加入TRIzol提取總RNA。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 °C保存?zhèn)溆?。以cDNA為模版進(jìn)行qRT-PCR法擴(kuò)增。反應(yīng)體系：cDNA 2.5 μL，2×SYBR mix 10 μL，上下游引物各1 μL，加水至20 μL。反應(yīng)條件：95 °C 20 s，60 °C 30 s，68 °C延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。U6作為內(nèi)參,根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算 miR-892a、Wnt、β-Catenin、c-myc基因及轉(zhuǎn)錄因子SOX5的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組的DU145細(xì)胞，制成1×106/mL懸浮細(xì)胞。根據(jù)Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別加入5 μL的Annexin V-FITC，充分混勻，再加入5 μLPI，室溫下遮光孵育20 min，置于流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD，型號(hào)：FACS Calibur）中，并采用Cellauest軟件檢測(cè)分析各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（x）表示，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-892a在前列腺癌細(xì)胞和正常前列腺上皮細(xì)胞中的mRNA表達(dá)，人前列腺癌細(xì)胞DU145、PC3中miR-892a的表達(dá)水平顯著低于人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 miR-892a在前列腺癌細(xì)胞和正常前列腺上皮細(xì)胞中的mRNA表達(dá)

2.2 過(guò)表達(dá)miR-892a對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響 慢病毒轉(zhuǎn)染之后miR-892a mimic組的miR-892a表達(dá)水平顯著高于BC組及miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-892a mimic組24、48、72 h的前列腺癌細(xì)胞增殖活力均顯著低于BC組及miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1、圖2。

表1 過(guò)表達(dá)miR-892a對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響（x）

圖2 過(guò)表達(dá)miR-892a后前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.3 過(guò)表達(dá)miR-892a對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，miR-892a mimic 組的前列腺癌細(xì)胞凋亡率顯著高于BC組及miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2、圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)過(guò)前列腺癌細(xì)胞的凋亡情況

表2 過(guò)表達(dá)miR-892a對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響（x）

2.4 過(guò)表達(dá)miR-892a對(duì)前列腺癌細(xì)胞中Wnt、β-Catenin、c-myc基因及轉(zhuǎn)錄因子SOX5表達(dá)的影響 miR-892a mimic 組的Wnt、β-Catenin、c-myc基因及轉(zhuǎn)錄因子SOX5的mRNA 表達(dá)水平顯著低于BC組及miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖4。

圖4 過(guò)表達(dá)miR-892a后前列腺癌細(xì)胞中Wnt、β-Catenin、c-myc基因及轉(zhuǎn)錄因子SOX5的mRNA表達(dá)水平

表3 過(guò)表達(dá)miR-892a對(duì)前列腺癌細(xì)胞中Wnt、β-Catenin、c-myc基因及轉(zhuǎn)錄因子SOX5表達(dá)的影響（x）

3 討論

miRNA的組織特異性和時(shí)序性決定了組織和細(xì)胞的功能特異性，表明miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著多種作用[5]。既往報(bào)道證實(shí)在去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞中miR-616的表達(dá)顯著上升，過(guò)表達(dá)的miR-616能增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的增殖能力，抑制細(xì)胞凋亡[6]。前期通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miRNA-892a在正常前列腺組織和前列腺癌患者的腫瘤組織中的表達(dá)存在明顯的差異，miR-892a在前列腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，預(yù)示著miR-892a的表達(dá)水平可能與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

本研究分析了 miR-892a 在前列腺癌細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與人正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1比較，人前列腺癌細(xì)胞DU145、PC3中miR-892a的表達(dá)水平明顯較低，提示miR-892a的表達(dá)缺失與前列腺癌的發(fā)生相關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)CCK-48法檢測(cè)研究前列腺癌細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果表明，miR-892a mimic 組的前列腺癌細(xì)胞增殖活力明顯低于BC組及miR NC組。以上結(jié)果證實(shí)miR-892a能抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，對(duì)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展起到負(fù)向調(diào)控的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-892a mimic 組的前列腺癌細(xì)胞凋亡率顯著高于 BC 組及 miR-NC 組，提示miR-892a過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡。

Wnt蛋白是一種通過(guò)自分泌或旁分泌發(fā)揮作用的細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)因子，其異常表達(dá)或激活能引起腫瘤[7]。β-Catenin作為Wnt信號(hào)通路的重要調(diào)解蛋白，在Wnt信號(hào)激活的細(xì)胞中由胞漿進(jìn)入胞核成為轉(zhuǎn)錄激活因子[8]。c-myc 是一種可以使細(xì)胞無(wú)限增殖、促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因[9]。于婷等[10]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的miR-181能抑制 Wnt/β-Catenin 信號(hào)通路從而抑制急性B淋巴細(xì)胞的增殖。同時(shí)，SOX5作為一種轉(zhuǎn)錄因子，已被證實(shí)可以結(jié)合DNA或其他蛋白調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究表明，miR-132通過(guò)靶向調(diào)控SOX5在垂體腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用[11]。本研究結(jié)果顯 示，miR-892a mimic 組 的Wnt、β-Catenin、c-myc及SOX5的mRNA 表 達(dá) 水 平 低 于BC組 合miR-NC，與韓兵等[12]研究結(jié)果相似，證實(shí)miR-892a過(guò)表達(dá)可以通過(guò)下調(diào)Wnt/β-Catenin信號(hào)通路及下游蛋白，使其活性受到抑制從而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但本研究只初步驗(yàn)證了miR-892a對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，涉及的具體通路作用機(jī)制尚不明確，后續(xù)研究將繼續(xù)展開(kāi)分子實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入探究。

綜上所述，miR-892a在前列腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)狀態(tài)，過(guò)表達(dá)miR-892a能抑制抑制前列腺細(xì)胞的增殖、促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡，其可能通過(guò)調(diào)控Wnt /β-Catenin信號(hào)通路而發(fā)揮作用，提示miR-892a在診治前列腺癌中具備成為生物學(xué)指標(biāo)的潛力。