外周血外泌體與類風濕關節炎輔助性T細胞-17/調節性T細胞應答失衡的相關性研究

陳秋華，黃小梅，梁 量，路 杰，謝 彤

（廣東醫科大學附屬醫院風濕免疫科，廣東湛江 524000）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床常見的慢性、對稱性、進行性多關節破壞的自身免疫性疾病。流行病學研究顯示，RA在我國的發病率在0.3%左右，5年內致殘率在30%以上[1]。RA早期臨床表現以關節腫脹、疼痛及晨僵為主，若未及時治療，晚期將會出現骨侵蝕或關節軟骨破壞等病理特征[2]。類風濕關節炎發病機制復雜，目前尚未完全明確，可能與自身免疫紊亂有關，其中輔助性T細胞17（Th17）和調節性T細胞（Treg）應答失衡是較為明確的發病機制[3]。Th17/Treg在正常狀態下處于動態平衡狀態，一旦Th17活化或Treg數量減少，均會引發RA，而相關研究發現，外泌體可調節Th17/Treg細胞應答失衡，且外泌體攜帶的miRNAs還能反映疾病的病理狀態。基于此，本研究就外泌體在RA與Th17/Treg細胞應答失衡的相關性進行分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2020年1月至2022年1月廣東醫科大學附屬醫院收治的90例RA患者的臨床資料，根據疾病活動度（DAS28）積分[4]將其分為輕度組（2.6分＜DAS28積分≤3.2分）、中度組（3.2分＜DAS28積分≤5.1分）和重度組（DAS28積分＞5.1分），每組30例；另回顧性分析同期廣東醫科大學附屬醫院院內30例健康體檢者的臨床資料，將其作為對照組。輕度組患者中男性18例，女性12例；年齡35～75歲，平均年齡（49.52±5.31）歲；體質量指數（BMI）23.57～25.15 kg/cm2，平均BMI（24.35±2.54）kg/cm2。中度組患者中男性19例，女性11例；年齡37～78歲，平均年齡（51.02±5.37）歲；BMI 23.41～25.02 kg/cm2，平均BMI（24.41±2.47）kg/cm2。重度組患者中男性17例，女性13例；年齡38～71歲，平均年齡（50.89±5.41）歲；BMI 23.37～25.67 kg/cm2，平均BMI（24.61±2.31）kg/cm2。對照組研究對象中男性12例，女性18例；年齡30～80歲，平均年齡（50.43±5.21）歲；BMI 23.54～25.34 kg/cm2，平均BMI（24.27±2.35）kg/cm2。4組研究對象一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），組間具有可比性。本研究經廣東醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會批準。納入標準：①符合《2018中國類風濕關節炎診療指南》[5]中RA的診斷標準；②關節功能分級為Ⅰ～Ⅳ級；③入組前未接受相關治療。排除標準：①精神或認知障礙者；②合并骨折的患者；③合并循環系統疾病者。

1.2 檢測方法 于患者入院后第2天清晨或研究對象體檢當天清晨，采集其空腹肘靜脈血6 mL，分為3等份；其中2 mL利用外泌體試劑盒（德國QIAGEN公司）提取，采集血清外泌體；另外2等份分別用于檢測Th17細胞、Treg亞群水平。外泌體檢測：利用外泌體RNA提取試劑盒（美國Life公司生產）提取血清外泌體總RNA，試劑盒富集miRNAs，將細胞內有核小RNA（U6）作為內參，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應技術對外泌體miR-223、miR-155表達水平進行檢測。Th17細胞檢測：取靜脈血2 mL，以3 000 r/min轉速離心10 min、棄血清，將10 μL CD4-FITC單抗加入沉淀細胞中，常溫、避光條件下孵育15 min，采用5 mL PBS緩沖液洗滌，并加入100 μL固定液，再次孵育15 min，二次加入PBS洗滌；離心、棄血清，將100 μL破膜劑加入沉淀細胞中，混合，避光孵育5 min，加入10 μL Alexa Fluor647IL-17 抗體，混合，避光孵育15 min，3次加入PBS洗滌；離心、棄血清，采用ZE5流式細胞儀測定Th17細胞含量。Treg亞群檢測：在2 mL靜脈血中加入50 μL乙二胺四乙酸抗凝處理，隨后分別加入10 μL單克隆抗體（CD25-PE、CD4-FITC、CD127-PE-CY5）混勻，室溫下孵育20 min，隨后加入500 μL紅細胞裂解液，、混勻后再加入5 mL 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）；離心棄血清，并于沉淀細胞中加入300 μL PBS緩沖液重懸細胞，同時采用流式細胞儀（上海艾研生物科技有限公司，型號：ZE5）測定Treg亞群含量。計算Th17/Treg。

1.3 觀察指標 ①比較各組研究對象Th17、Th17/Treg和Treg亞群水平。②比較各組研究對象miR-223、miR-155表達水平。③分析外泌體與Th17/Treg水平對RA的診斷效能。敏感度=真陽性例數/（真陽性例數+假陰性例數）×100%；特異度=真陰性例數/（真陰性例數+假陽性例數）×100%。④分析外泌體miR-223、miR-155水平與RA Th17/Treg水平相關性。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據處理。符合正態分布的計量資料以（x）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以[例(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗；診斷效能采用受試者操作特征（ROC）曲線分析；相關性采用Pearson檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組研究對象Th17、Treg亞群和Th17/Treg水平比較 重度組、中度組及輕度組患者Th17、Th17/Treg水平均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），重度組、中度組及輕度組患者Treg亞群水平均低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 4組研究對象Th17、Treg亞群和Th17/Treg水平比較（%，x）

2.2 4組研究對象外泌體miR-223、miR-155表達水平比較 重度組、中度組及輕度組患者miR-223、miR-155表達水平明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 4組研究對象外泌體miR-223、miR-155表達水平比較（x）

2.3 外泌體與Th17/Treg水平對RA的診斷效能分析 Th17細胞、Treg亞群、Th17/Treg、miR-223、miR-155對RA的 敏 感 度 分 別 為87.04%、88.89%、94.59%、87.04%、88.89%，特異度分別為75.00%、75.00%、81.25%、68.75%、81.25%，見表3、圖1。

圖1 外泌體與Th17 /Treg水平對RA的診斷效能分析

表3 外泌體與Th17/Treg水平對RA的診斷效能分析

2.4 外泌體miR-223、miR-155水平與RA Th17/Treg水平相關性分析 外泌體miR-223、miR-155水平與Th17細胞、Th17/Treg均呈正相關性，與Treg亞群呈負相關性（P＜0.05），見表4。

表4 外泌體miR-223、miR-155水平與RA Th17/Treg水平相關性分析

3 討論

RA目前僅能通過服用非甾類抗炎藥或糖皮質激素等藥物穩定病情、改善臨床癥狀，因此只有明確患者的疾病嚴重程度，才能給予其合適的藥物治療。相關研究表明，炎癥反應、免疫細胞活性失衡等均在RA的發生、發展中發揮重要的作用[6]，因此，通過檢測RA相關生物指標的方式，在RA早期診斷和治療中可發揮重要作用。

Treg細胞屬于調節性T細胞，而Th細胞則屬于輔助性T細胞，Treg細胞不僅能夠激活Th17細胞，而且還能對Th細胞的部分功能進行限制，使Th細胞在機體中保持平衡，從而保證機體內免疫功能的正常運轉[7]。Th17細胞可對局部炎癥反應進行誘導，同時還能上調滑膜成纖維細胞上的破骨細胞分化因子(RANKL)，從而對關節炎骨組織造成破壞。RA的發生與免疫系統和骨骼系統功能失衡有關，因此，RA發病時，體內的Th17數量和功能也會隨之出現異常。

本研究結果顯示，重度組、中度組及輕度組患者Th17、Th17/Treg水平均高于對照組，Treg亞群水平均低于對照組，與李智偉等[8]研究結果相似，說明研究結果可信度較高。這提示Th17/Treg細胞應答失衡會引發RA，且Th17/Treg細胞應答失衡越嚴重，RA病情也會隨之加重。外泌體主要由多種細胞產生，含有脂類、蛋白質及核酸等物質，外泌體中的miRNA與自身免疫性疾病、呼吸系統疾病的發生、發展均存在一定關聯。本研究結果顯示，重度組、中度組及輕度組患者miR-223、miR-155表達水平明顯高于對照組，與孫廣等[9]研究結果基本一致。這說明根據外泌體miR-223、miR-155表達水平上調情況可有效評估RA的疾病嚴重程度。另外，本研究對Th17/Treg細胞應答失衡與外泌體miR-223、miR-155水平進行相關性分析后發現，外泌體miR-223、miR-155水平與Th17細胞、Th17/Treg均呈正相關，與Treg亞群呈負相關性。這提示外泌體異常表達可反映RA Th17/Treg細胞應答失衡狀態，進而有效評估RA患者的疾病嚴重程度。

綜上所述，RA的發生、發展與外泌體miR-223、miR-155和Th17/Treg均存在一定關聯，可根據外泌體miR-223、miR-155表達情況明確RA患者體內的Th17上升和Treg亞群下降情況，在判斷RA病情嚴重程度方面具有重要意義。