豬群中牛病毒性腹瀉病毒的流行病學(xué)調(diào)查

陶 潔,李本強(qiáng),程靖華,石 迎,劉惠莉

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室,上海市種豬工程技術(shù)中心,上海 201106)

牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)主要感染牛,引起以腹瀉、流產(chǎn)、免疫抑制和持續(xù)感染等為主的臨床癥狀,給牛群帶來了很大的危害[1]。由于牛群中BVDV普遍存在,導(dǎo)致以胎牛血清為主的牛源性生物制品中BVDV污染嚴(yán)重[2-4],增加了豬用疫苗的潛在危害。豬是BVDV的易感宿主之一,各年齡段的豬均易感。目前,國內(nèi)外豬群中BVDV感染情況屢見不鮮[5-7],有逐漸增長的趨勢。BVDV和豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)屬于同一個病毒屬,豬群中BVDV抗體對豬瘟病毒有一定的抑制作用,會干擾豬瘟疫苗的免疫,降低豬瘟疫苗的免疫效果。此外,BVDV可導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制,普遍降低豬群免疫力,從而增加其他病原的感染風(fēng)險,造成臨床疾病的復(fù)雜化[8]。因此,BVDV感染給豬群造成了較大的間接危害,應(yīng)重視該病原的防控工作。

本研究對2017—2020年間上海地區(qū)豬群中BVDV的流行情況進(jìn)行調(diào)查,從年度流行趨勢、季節(jié)流行情況、不同豬場流行情況等方面進(jìn)行分析,旨在了解目前BVDV的感染情況,為豬場有效做好防控工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DL2000 DNA Marker、TRIzol、Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、5×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer、Recominant RNase Inhibitor、dNTP Mixture(2.5 mmol∕L)均購自日本TaKaRa公司;磁珠法糞便RNA提取試劑盒購自上海醫(yī)脈賽科技有限公司。

1.2 樣品來源

在2017—2020年間從上海崇明、金山、浦東等地區(qū)6個豬場,分不同季節(jié)共采集仔豬腹瀉糞便樣品1 078份,各年度采樣數(shù)量分別為134份、235份、584份和125份。

1.3 磁珠法提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄

取適量采集的糞便樣品懸浮于500 μL PBS中,振蕩混勻,室溫靜置10 min;吸取上清,-40℃保存,用于提取總RNA。

按照磁珠法糞便RNA試劑盒說明書,提取糞便樣品總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

1.4 RT-PCR檢測樣品中的病毒性腹瀉病原

首先,以cDNA為模板,利用BVDV Npro特異性引物進(jìn)行PCR檢測,確定樣品中BVDV的陽性率。然后,以BVDV陽性的樣品為模板,利用四重RT-PCR方法[9],檢測樣品中豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬瘟病毒(CSFV)的感染情況;同時利用七重RT-PCR方法[10]檢測樣品中的豬星狀病毒(PAstV)、豬嵴病毒(PKoV)、豬薩佩羅病毒(PSV)、豬捷申病毒(PTV)、豬札幌病毒(PSaV)、豬環(huán)曲病毒(PToV)、豬丁型冠狀病毒(PDCoV);確定樣品中BVDV與其他腹瀉病原的混合感染情況。

1.5 上海地區(qū)豬群中BVDV的流行模式

統(tǒng)計所有樣品的PCR檢測結(jié)果,明確2017—2020年BVDV的陽性率,以及BVDV與其他腹瀉病原的混合感染率,分析上海地區(qū)豬群中BVDV的流行趨勢及感染模式。

1.6 不同豬場BVDV的流行差異

按照不同豬場統(tǒng)計所有樣品的PCR檢測結(jié)果,明確各豬場中BVDV的流行情況,結(jié)合各豬場的養(yǎng)殖、管理等情況,分析導(dǎo)致這種流行差異的原因。

1.7 不同季節(jié)BVDV的流行情況

按照采樣的不同月份,統(tǒng)計所有樣品的PCR檢測結(jié)果,明確不同月份BVDV的流行情況,分析不同季節(jié)BVDV的流行規(guī)律。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年度豬群中BVDV的流行情況

利用BVDV特異性檢測引物對2017—2020年采集的1 078份糞便樣品進(jìn)行RT-PCR檢測,結(jié)果顯示:共檢測出77份BVDV陽性樣品,總陽性率為7.14%。2017—2020年BVDV的陽性率分別為0.75%(1∕134)、7.66%(18∕235)、9.42%(55∕584)和4.80%(6∕125)。2017—2019年,上海豬群中BVDV檢出率呈逐年遞增的趨勢,而2020年BVDV檢出率有所回落,可能與該年度采樣量較少有一定關(guān)系。

2.2 BVDV與其他腹瀉病原的混合感染情況

利用實驗室建立的四重RT-PCR和七重RT-PCR方法,進(jìn)一步對這77份BVDV陽性樣本進(jìn)行其他腹瀉病原篩查。結(jié)果發(fā)現(xiàn):BVDV與其他腹瀉病原的混合感染情況較嚴(yán)重,占51.95%(40∕77);且混合感染模式比較復(fù)雜,二重感染占65%(26∕40),三重感染占25%(10∕40),四重感染占10%(4∕40)。

進(jìn)一步分析BVDV的混合感染模式(圖1),結(jié)果顯示:BVDV分別與PAstV、PEDV、PKoV、PSV和TGEV發(fā)生了二重感染(圖1A),其中BVDV∕PAstV混合感染占比最高,其次為BVDV∕PEDV、BVDV∕PSV和BVDV∕TGEV。

BVDV與其他腹瀉病原的三重感染中出現(xiàn)了5種不同的混合感染模式(圖1B),其中BVDV∕PAstV∕PKoV混合感染占比最高,其次是BVDV∕PEDV∕PAstV混合感染,其余3種混合感染模式BVDV∕PEDV∕PKoV、BVDV∕PAstV∕PDCoV、BVDV∕PEDV∕TGEV的占比相等。

BVDV與其他腹瀉病原的四重感染中(圖1C)出現(xiàn)了3種混合感染模式,其中BVDV∕PEDV∕PAstV∕PSV混合感染占比最高,其余2種混合感染模式BVDV∕PKoV∕PAstV∕PSV、BVDV∕PSaV∕PToV∕PKoV的占比相等。可見,上海地區(qū)豬群中BVDV與其他腹瀉病原的混合感染模式較復(fù)雜。

圖1 BVDV不同的混合感染模式Fig.1 Different mixed infection modes of BVDV

2.3 不同季節(jié)豬群中BVDV的流行情況

根據(jù)樣品采集時間(圖2A),統(tǒng)計不同月份BVDV的陽性率,其中5月、6月和8月未檢出BVDV,4月BVDV陽性率最高,其次是9月。整體而言,后半年BVDV陽性率較前半年高。

按季節(jié)分析(圖2B),發(fā)現(xiàn)春季(3月、4月、5月)和秋季(9月、10月、11月)BVDV檢出率較高,而夏季(6月、7月、8月)和冬季(12月、1月、2月)BVDV檢出率較低。可能是由于春秋兩季處于氣溫冷熱交替的節(jié)點,群體抵抗力較弱,更容易誘發(fā)BVDV感染。

2.4 不同豬場BVDV的流行情況

根據(jù)樣品采集地點,統(tǒng)計分析不同豬場BVDV的流行情況,發(fā)現(xiàn)有3個豬場未檢測到BVDV,另3個豬場均有BVDV的流行。其中,豬場4中BVDV的檢出率最高,達(dá)24.07%(13∕54);豬場2和豬場6中BVDV檢出率分別為5.68%(44∕775)、13.54%(13∕96)。這可能與各豬場的養(yǎng)殖環(huán)境、管理模式及免疫現(xiàn)狀密切相關(guān)。

2.5 豬場2中BVDV的感染情況

豬場2是本課題組長期監(jiān)測病毒性腹瀉病原的一個養(yǎng)殖場,2017—2020年間共采集仔豬糞便樣品775份。結(jié)果顯示:2017—2019年BVDV陽性率分別為2.5%(1∕40)、3.18%(5∕157)和8.61%(42∕488),呈逐年遞增的趨勢;而2020年BVDV檢出率為6.67%(6∕90)。BVDV陽性率的趨勢可能與年采樣量有一定關(guān)系。

進(jìn)一步分析該豬場BVDV的混合感染情況,結(jié)果顯示:二、三、四重感染率分別為57.58%(19∕33)、21.21%(7∕33)、21.21%(7∕33)。二重感染以BVDV∕PAstV(57.89%,11∕19)感染模式為主,三重感染以BVDV∕PAstV∕PSV(85.71%,6∕7)為主,四重感染以BVDV∕PAstV∕PSV∕PSaV(71.43%,5∕7)為主。可見,該豬場BVDV的感染情況比較復(fù)雜。

3 討論

世界動物衛(wèi)生組織將BVD列入必須報告的動物疾病名錄,但僅僅是牛報告疾病名錄,這就容易讓人們忽略BVDV還可引起豬等其他動物感染發(fā)病[11]。豬感染BVDV后表現(xiàn)出類似慢性豬瘟的臨床表征,增加了臨床中豬瘟的鑒別診斷難度。近年來,養(yǎng)殖環(huán)境、生產(chǎn)管理及疫病免疫等因素的不可控性,導(dǎo)致臨床病原感染模式日益復(fù)雜,疾病診斷難上加難。

本研究對上海地區(qū)豬群中BVDV的感染情況進(jìn)行了摸查,發(fā)現(xiàn)2017—2019年間豬群中BVDV感染有逐年遞增的趨勢,但2020年BVDV檢出率有所下降,這可能與之前非洲豬瘟的暴發(fā)以及今年疫情的發(fā)生有一定關(guān)系,由于樣品采集量的下降,間接導(dǎo)致BVDV檢出率較之前低。但總體還是能說明豬群中BVDV感染不可忽視,特別是BVDV與其他腹瀉病原的混合感染情況較復(fù)雜,主要以BVDV∕PAstV二重感染為主,在此感染模式基礎(chǔ)上,繼而發(fā)生三重感染、四重感染。近年來,豬群中PAstV檢出率呈上升趨勢,但其臨床致病性表現(xiàn)不明顯,對豬群的危害尚無法預(yù)判[12-13]。本研究室前期數(shù)據(jù)證實,PAstV與PEDV、PSaV等病原的混合感染也相當(dāng)嚴(yán)重,推測可能存在協(xié)同致病性。而BVDV可導(dǎo)致持續(xù)感染、免疫抑制等,因此BVDV與PAstV、PEDV等病原的混合感染,無疑增加了豬群的疫病防控難度。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),BVDV在春、秋兩季的陽性率明顯高于夏季和冬季,存在著一定的季節(jié)流行規(guī)律。可能是由于春秋季處于氣溫變化的交叉點,早晚溫差大,容易導(dǎo)致豬群抵抗力下降,因而仔豬更容易感染BVDV。所以,在這兩個季節(jié)要注意豬舍的保暖措施。此外,發(fā)現(xiàn)各養(yǎng)殖場的管理對BVDV感染存在較大影響,豬場1是全封閉型自動化養(yǎng)殖場,管理規(guī)范,BVDV檢出率為0;而豬場4管理較欠缺,外人隨意進(jìn)出豬舍,無固定飼養(yǎng)人員,飼喂設(shè)施也較差,BVDV檢出率高達(dá)24.07%。豬場2是本課題組的一個腹瀉病原持續(xù)監(jiān)測點,前期發(fā)現(xiàn)以PAstV、PKoV、PEDV為主的腹瀉病原檢出率一直較高,因此本研究監(jiān)測了BVDV的感染情況,發(fā)現(xiàn)該豬場仔豬感染BVDV的情況也一直存在,而且混合感染模式也較復(fù)雜,仔豬最多同時感染4種腹瀉病原。這也與該豬場的養(yǎng)殖環(huán)境和管理水平等有一定關(guān)系。該豬場豬舍設(shè)備較陳舊,養(yǎng)殖人員更換頻繁,藥物和疫苗使用過多,疫苗免疫程序時常調(diào)整,缺乏科學(xué)性。因此,在免疫防控的同時,養(yǎng)殖場的管理水平需有效提升,提高生物安全措施。

BVDV感染豬群的途徑除了與牛群直接或間接接觸以外,最重要的是目前使用的疫苗等生物制劑的潛在污染性[14]。因此,在購買這些豬用生物制劑時,一定要選擇正規(guī)渠道、經(jīng)過嚴(yán)格檢驗的產(chǎn)品,盡量避免使用自家苗等,從源頭控制BVDV感染的可能性。