上海地區蘇云金芽孢桿菌的分離及其對草地貪夜蛾室內殺蟲活性的測定

陳詩杰,曹越平

(上海交通大學農業與生物學院,上海 200240)

蘇云金芽孢桿菌廣泛分布于土壤中,國內學者近年來從各地土壤樣品中分離得到對某些害蟲具有高毒力的Bt菌株,其殺蟲譜各異[9-11]。上海屬長江下游沖積平原,土壤類型以水稻土、潮土、濱海鹽土為主[12],目前對當地的蘇云金芽孢桿菌資源的搜集工作鮮見報道。本研究以分離自上海地區土壤樣品中的Bt菌株為主要對象,通過伴孢晶體蛋白形態觀察、16S rDNA序列及cry基因類型鑒定和SDS-PAGE蛋白分析,并以草地貪夜蛾為受試昆蟲,篩選出具有高毒殺活性的Bt菌株,以期進一步豐富蘇云金芽孢桿菌菌株的資源儲備,并為促進Bt生物制劑的可持續應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集與Bt菌株的分離

遴選上海市26個地區挖取地表下5—10 cm處土壤50 g,共計165份,記錄經緯度、植被情況等采樣信息。預處理后利用NaAc-抗生素篩選法[13]進行Bt菌株的分離,鏡檢觀察后根據采集地點和分離順序予以編號。菌株經平板劃線增殖后制備成甘油菌保存。

1.2 蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白的形態觀察

將篩選到的Bt分離菌株劃線于1∕2 LB培養基上,28℃恒溫培養72 h,每4 h定期涂片,石碳酸復紅染色后100×油鏡鏡檢,觀察晶體形態、大小、數量。

1.3 16S rDNA序列測定

從平板純培養物挑取單菌落提取總DNA,經紫外分光光度計檢測其濃度后作為PCR反應模板,引物為16S rDNA通用引物27F和1492R。20 μL PCR反應體系如下:LA Taq(TaKaRa)0.2 μL,引物27F(10 μmol∕L)和1492R(10 μmol∕L)各1 μL,DNA模板1 μL,dNTP Mix 3.5 μL,Buffer II 4 μL,RNase-Free Water 5.3 μL。反應程序如下:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸90 s,30個循環;72℃延伸10 min。經瓊脂糖凝膠檢測后將PCR擴增產物回收純化,連接pMD18-T載體(TaKaRa)后轉化DH5α大腸桿菌細胞(TaKaRa),挑取陽性克隆測序。將測序結果上傳至NCBI進行BLAST比對,根據分析比對結果構建系統發育樹,進一步確定Bt菌株。

1.4 Bt分離菌株cry基因類型的鑒定

1.4.1 Bt質粒的提取

Bt質粒提取方法參見文獻[14]。

1.4.2cry基因類型的PCR-RFLP鑒定

以質粒DNA為模板,利用Kuo等[15]和張杰等[16]根據cry基因序列特點設計的通用型引物(共16對),對Bt分離菌株進行cry1—3、cry5—9、cry11、cry18—22、cry30、cry32及cry40基因類型的鑒定。

財政事權與支出責任劃分，西方徹底分權的劃分模式中國目前不具備相應的先決條件，應在“中央決策、地方執行”的框架下推進，可考慮按照事權要素的劃分，中央決策、地方執行，但是中央的決策權再進一步細分，決策可分為“做什么”和“做到什么程度”，在“做什么”權力保留在中央政府的前提下，“做到什么程度”是可給地方的自主權。同時強化科學的績效考核機制，提升地方履行事權的效率和效果。

1.5 伴孢晶體蛋白的SDS-PAGE分析

挑取Bt單菌落置于10 mL LB液體培養基中,30℃培養至形成伴孢晶體,取1 mL培養液于1.5 mL離心管中超聲波破碎。取100 μL樣品,加入25 μL新配的0.5 mol∕L NaOH,25℃反應5 min,加入50 μL 2×上樣緩沖液,100℃煮沸5 min,12 000 r∕min離心1 min,去沉淀,取10 μL上樣,130 V恒壓電泳,脫色后觀察蛋白條帶。

1.6 對草地貪夜蛾室內殺蟲活性的測定

1.6.1 生測樣液的制備

挑取Bt單菌落于30℃、200 r∕min恒溫振蕩條件下培養過夜,以1∶100比例轉接于1∕2 LB培養基中,培養至大部分晶體釋放,12 000 r∕min離心收集孢晶混合物,用1 moL∕L冰冷的NaCl洗滌3次,再溶于無菌水中,并調整菌懸液濃度得到100倍液,于-70℃保存備用[17]。

1.6.2 室內殺蟲活性測定

草地貪夜蛾為室內人工飼養[18];采用表面覆蓋法對飼料進行處理,飼料中加入待測樣液后充分攪拌均勻,室內陰涼處晾干備用。

滅菌養蟲管中每管輕輕接入初孵幼蟲10頭,處理飼料2 g,3次重復,以16 000 IU∕mg蘇云金桿菌粉劑處理為陽性對照,無菌水處理為陰性對照;置于適宜條件飼養[19],每日觀察蟲體和飼料情況,保證管內清潔及透氣性。

培養72 h后調查死蟲數,計算平均死亡率和校正死亡率。

2 結果與分析

2.1 上海地區不同用地類型中Bt菌株的分離

對采集自上海市26個地區共計165份土壤樣品進行處理,共分離得到芽孢桿菌610株,經鑒定得到蘇云金芽孢桿菌50株,總檢出率為8.20%。如表1所示,不同用地類型的Bt檢出率有所差異。其中,采自吳涇工業區的土壤樣品檢出率最高,達21.62%;其次為寶山工業園區,檢出率為5.41%;居民住宅區及兩大高架路段的樣品檢出率相對較低,均在4%以下。

表1 不同用地類型土壤樣品中Bt菌株的分離結果Table 1 Isolation results of Bt strains in soil samples of different land use types

2.2 Bt分離菌株伴孢晶體結構的觀察

利用光學顯微鏡對50株芽孢桿菌進行觀察,發現所含的伴孢晶體形態多數含有菱形、球形和不規則形3類,以球形晶體為主,其中菱形晶體12株,球形晶體33株,不規則晶體3株,分別占比24.0%、66.0%和6.0%。光學顯微鏡下觀察到的各晶體形態見圖1。

圖1 100×油鏡下觀察到的Bt分離菌株伴孢晶體形態Fig.1 Parasporal crystal morphology of the associated Bt strains observed under oil microscope(100×)

2.3 Bt菌株的16S rDNA鑒定分析

在對50株Bt分離菌株進行16S rDNA序列測定中,將菌株XX2的16S rDNA基因序列提交NCBI后經BLAST比對分析,發現其與已登錄的編號為KJ676099.1的蘇云金芽孢桿菌同源性最高,達到99%。將比對后同源性最高的6個結果構建系統發育樹(圖2),可進一步判斷菌株XX2為芽孢桿菌屬的蘇云金芽孢桿菌。

圖2 依據16S rDNA序列同源性構建的Bt菌株XX2系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Bt strain XX2 based on 16S rDNA sequence homology

2.4 Bt菌株的cry基因類型鑒定

利用PCR-RFLP體系對50株Bt菌株進行cry基因類型鑒定,部分菌株PCR擴增及酶切(PstI、XbaI)結果如圖3所示。結果表明:50株Bt菌株cry基因類型豐富,大部分菌株可成功擴增出cry基因片段,且所含cry基因類別各有差異,包含cry1、cry3、cry8等共16種基因類型。其中,包含cry32類基因的菌株有31株,覆蓋度達62%;其次為包含cry8類基因的菌株有25株,覆蓋度達50%。對cry1類基因的酶切結果顯示,在第三等級水平下,鑒定出的cry1類基因主要有cry1Ab和cry1Ac,分別占含cry1類基因總菌數的58.83%和29.41%。部分分離菌株所含cry基因類型見表2。

圖3 cry1類基因的引物K5un2∕K3un2 PCR擴增及酶切Fig.3 PCR amplification with primers K5un2∕K3un2 and digestion of cry1 gene

2.5 伴孢晶體蛋白的SDS-PAGE分析

如圖4所示,Bt分離菌株伴孢晶體蛋白的分子量大小從45 ku到130 ku不等,菌株大都表達130 ku蛋白。其中,菌株PD1表達約65 ku的蛋白;XX2與DX4表達50 ku、45 ku的蛋白;BS3與DX4菌株均表達80 ku蛋白;XX2、WJ3、PD1、DX4和WJ29菌株表達情況相似,均表達90 ku的蛋白。Bt菌株電泳帶型圖譜的不同,印證了Bt菌株的多樣性。

圖4 部分Bt分離菌株伴孢晶體蛋白的SDS-PAGE電泳分析Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis analysis of parasporal crystal protein of some Bt strains

2.6 對草地貪夜蛾室內殺蟲活性的測定

利用50株Bt分離菌株對草地貪夜蛾一齡孵出幼蟲進行室內殺蟲活性測定,部分菌株測定結果見表2。菌株BS3與PD1對草地貪夜蛾的殺蟲活性最高,72 h處理其校正死亡率達到100%,菌株WJ3與DX4對草地貪夜蛾的校正死亡率達到90%以上,分別為93.13%與96.56%,屬于高毒力菌株,菌株XX2、WJ29對草地貪夜蛾的致死率在75%—90%,其余Bt菌株對草地貪夜蛾的殺蟲活性較低或沒有殺蟲活性。

表2 部分Bt分離菌株的cry基因類型及對草地貪夜蛾幼蟲的殺蟲活性Table 2 Cry genotypes of some Bt isolates and their insecticidal activity against S.frugiperda larvae

3 討論

土壤是蘇云金芽孢桿菌主要的分布場所,本研究從上海市165份土壤樣品中共分離得到Bt菌株50株,不同用地類型的Bt分離率各有差異,依次是工業園區＞生態濕地＞交通主干道＞居民住宅區,這可能與蘇云金芽孢桿菌所在的生態環境包括土壤pH、植被覆蓋度、空氣環境污染物等條件有關[20]。由于工業園區常進駐制造加工業、石油化工業等產業,長期以來可能對當地土壤中的重金屬含量、氣體成分等造成一定影響[21]。蘇云金芽孢桿菌的分布與該類土壤環境之間的具體關系尚不明確[22-24],或許在環境治理、重金屬污染等方面具有潛在應用價值。

蘇云金芽孢桿菌內生質粒豐富[14],不同的cry基因類型所編碼的殺蟲晶體蛋白具有不同的殺蟲活性,蛋白大小與形態通常也與cry基因類型存在關聯。對鱗翅目害蟲有毒殺活性的有cry1、cry2和cry9類基因所編碼的殺蟲晶體蛋白,多為130 ku、60—65 ku的菱形蛋白;cry3、cry8類基因的晶體蛋白對鞘翅目害蟲表現出高毒殺活性,多為130 ku、70 ku的球形蛋白;cry30、cry32類基因的晶體蛋白則對雙翅目害蟲表現出殺蟲活性,多表達130 ku的球形蛋白[4]。本研究通過PCR-RFLP體系對分離的50株Bt菌株進行cry基因類型鑒定,結果顯示分離菌株涵蓋有cry1—3、cry5—9、cry11、cry18—22、cry30、cry32和cry40共16種基因類型,其中cry8、cry32兩類基因類型檢出比例較高,分別達到50%及62%,與光學顯微鏡下觀察到的以球形晶體蛋白為主的形態結果相吻合。

草地貪夜蛾已在多個國家經歷化學農藥及生物制劑的防治階段[25],對多種藥劑產生了不同程度抗性,且對表達cry1F蛋白的商業化Bt玉米‘TC1507’產生田間抗性[7-8],此外,對于連年種植的cry1Ab、cry1Ac等Bt玉米也存在產生抗性的風險[26]。為篩選出高毒力Bt菌株,進而開發穩定的Bt產品,國外學者通過室內篩選得到高毒力Bt菌株S1905與BR45,經鑒定兩者含有cry1Aa、cry1Ab,cry1Ac、cry1B和cry2Aa等殺蟲基因[27-28]。李國平等[29]測定了幾種Bt蛋白對草地貪夜蛾初孵幼蟲的致死作用,以Vip3A和cry1Ab基因編碼的蛋白毒力較高。本研究通過室內飼喂法篩選出對草地貪夜蛾殺蟲活性較高的6株Bt菌株,殺蟲活性均在75%以上,其中菌株XX2、WJ25、PD1和DX4均含有對鱗翅目具有殺蟲活性的cry類基因,如cry1Ab、cry1Ac等。其他菌株沒有檢測出相關基因,卻表現出對草地貪夜蛾的高殺蟲活性,尤其是菌株BS3,72 h處理的校正死亡率達到100%。由于蘇云金芽孢桿菌產生的生物活性物質種類多樣[30],上述菌株是否存在對草地貪夜蛾敏感的殺蟲活性物質如Vip3A蛋白、雙效菌素等,仍需要后期進一步鑒定。另外,本研究在理論上驗證了Bt分離菌株對草地貪夜蛾具有室內殺蟲活性的可行性,與田間草地貪夜蛾幼蟲的生存環境還存在一定差異,故田間使用上述菌株時是否會產生同樣效果,尚需進一步驗證。本試驗所篩選的Bt菌株可為蘇云金芽孢桿菌資源的進一步研究與利用提供參考。