小麥根際解磷細菌的篩選及其解磷能力鑒定

李 航,李亞菲,張 影,李東方,吳大付,王 菲

(河南科技學院資源與環境學院,河南省生物藥肥研發與協同應用工程研究中心,新鄉 453003)

磷是農業生產中一個十分重要的元素,但由于其在土壤中易被固定,且移動性差,導致其利用率只有10%—20%[1],而大部分磷肥則作為無效態磷在土壤中積累,一方面消耗了磷礦資源,造成了磷肥的浪費,另一方面也對環境造成了一定的風險。因此,通過高效環保的生物過程,如挖掘土壤微生物的解磷潛力[2-3]以充分活化土壤中累積態磷,使其轉化為能夠被植物直接吸收和利用的有效磷,實現農業綠色發展。

土壤中的磷素循環以微生物活動為驅動力[2],與磷周轉密切相關的一類微生物被稱為解磷微生物,主要通過酸解作用、酶解作用以及直接氧化作用來活化或礦化難溶性無機磷和有機磷,將磷酸根釋放出來供植物吸收利用[3-7]。這些解磷微生物包括細菌、真菌、放線菌等,其中細菌的解磷效果最佳[8]。目前報道的具有解磷作用的細菌多隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、微球菌屬(Micrococcus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、腸桿菌屬(Enterobacter)、根瘤菌屬(Rhizobium)、節細菌屬(Arthrobacter)等[9-11],而且這些菌株在不同環境條件下均能表現出良好的解磷和促生效果,如劉希旻等[12]從鹽堿地土壤中分離得到一株高效解磷菌Pseudomonas veronii,解無機磷量最高可達850.1 mg∕L,在鹽堿地土壤生物修復方面具有較大的應用價值;莊馥璐等[13]從蘋果根際土壤中篩選出具有礦化有機磷能力的細菌10株,其中菌株PsbM4(腸桿菌屬)綜合能力較強,且能夠刺激擬南芥植株泌氫,更好地應對低磷脅迫。

針對當前集約化農業生產過程中存在的一系列問題,通過篩選高效解磷微生物并將其應用于菌肥的研發,從而替代農業生產中化學肥料的大量使用,對于早日實現農業綠色發展具有重大意義。因此,高效解磷細菌的篩選就成為了一項非常重要的基礎性工作。本研究利用選擇性培養基,從小麥根際土壤中分離篩選解磷細菌并分析其解磷能力,以期為后續研發微生物菌肥提供菌種資源,并為增強作物對磷的吸收以及減少作物對磷肥的依賴提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 根際土壤的采集

利用五點取樣法在河南省新鄉市紅旗區洪門鎮原堤村試驗基地(113.56°E,35.15°N)采集分蘗期小麥根際土壤樣品,并用抖根法收集,5個樣點的根際土壤作為一個混合樣品,過2 mm篩后,按照四分法收集根際土壤,并于4℃冰箱保存。

1.2 培養基的配制

無機磷固體培養基采用國際植物研究所磷酸鹽生長培養基(National Botanical Research Institute’s Phosphate Growth Medium,NBRIP)[14],配方如下:葡萄糖(C6H12O6)10 g∕L,磷酸鈣[Ca3(PO4)2]5 g∕L,氯化鎂(MgCl2·6H2O)5 g∕L,硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.25 g∕L,氯化鉀(KCl)0.2 g∕L,硫酸銨[(NH4)2SO4]0.1 g∕L,瓊脂粉15 g∕L。有機磷固體培養基以NBRIP為基礎,用植酸鈣(Phytin)來代替原配方中的磷酸鈣,且用量減少為2 g∕L。相應的無機磷和有機磷液體培養基則不添加瓊脂粉,pH調至7.0。所有培養基經滅菌(121℃,30 min)后使用。

1.3 解磷細菌的分離、純化和分子鑒定

根據孫亞欽等[15]的方法,采用平板稀釋法和劃線法[16]對小麥根際土壤中的解磷細菌進行分離篩選和純化,采用AxyPrep細菌基因組DNA小量制備試劑盒(Axygen,USA)提取細菌的基因組DNA,利用細菌通用引物27F和1492R進行PCR擴增[17],PCR產物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen,USA)回收后,利用全自動DNA測序儀ABI 3730XL(Applied Biosystems,USA)對其進行雙向測序,并對所得序列進行拼接、比對和分析等。

1.4 菌株解磷能力的分析

根據純菌株在無機磷和有機磷固體培養基上產生溶磷圈的情況,測量其溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d),并計算溶磷指數(P solubilization index,PSI=D∕d)和溶磷效率[P solubilization efficiency,PSE=(Dd)∕d×100%]以初步判斷各菌株的解磷能力[18-19],詳細的操作步驟參考孫亞欽等[15]的方法。

將純菌株接種于LB液體培養基中,經振蕩培養、調節菌液OD值、離心、清洗菌體、定容后,吸取菌液分別添加到無機磷和有機磷液體培養基中,再經振蕩培養和離心后,吸取上清液測定培養液pH、速效磷含量[20]和磷酸酶活性[21],詳細的操作步驟參考孫亞欽等[15]的方法。

1.5 數據統計

利用Microsoft Excel軟件對數據進行初步整理,用SPSS 26.0統計軟件進行單因素方差分析和Pearson相關性分析,處理間差異的顯著性通過新復極差法(Duncan's)比較(P＜0.05),利用Microsoft Excel軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 解磷菌株的分子鑒定

通過16S rRNA基因測序和序列同源比對,從小麥根際土壤共篩選得到10株不同的解磷菌株,其中溶解植酸鈣和磷酸鈣的菌株各有5株,分別將其編號為LP2、LP5、LP16、LP17、LP23及LE、LF、LH、LI、LM。將這些菌株的16S rRNA基因序列提交至GenBank中,獲得對應的序列號,為MW085018—MW085027。由表1可知,具有溶解植酸鈣能力的菌株LP16和LP17同屬于芽孢桿菌屬,LP2、LP5和LP23分別屬于假單胞菌屬、谷氨酸桿菌屬和泛菌屬;而具有溶解磷酸鈣能力的菌株LF和LM同屬于腸桿菌屬,LE、LH和LI分別屬于沙雷氏菌屬、拉恩氏菌屬和假單胞菌屬。從不同磷源來看,溶解磷酸鈣的菌株LI和溶解植酸鈣的菌株LP2都屬于假單胞菌屬(表1)。

表1 不同菌株的鑒定結果Table 1 Identification results of different strains

由圖1可知,這10株解磷菌株隸屬于7個不同的菌屬(Pseudomonas、Glutamicibacter、Bacillus、Pantoea、Serratia、Enterobacter、Rahnella)。其中菌株LF和LM、LP16和LP17、LI和LP2分別與Enterobacter、Bacillus、Pseudomonas聚為一支,表明它們分別與腸桿菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的親緣關系更近;菌株LP23、LE、LH、LP5分別與Pantoea agglomerans、Serratia quinivorans、Rahnella aquatilis、Glutamicibacter arilaitensis聚為一支,表明它們之間有較近的親緣關系。

圖1 基于16S rRNA基因序列構建的解磷菌株系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of phosphate-solubilizing strains based on 16S rRNA gene sequences

2.2 菌株解磷能力的定性分析

溶磷指數(PSI)和溶磷效率(PSE)可作為表征解磷細菌相對解磷能力的指標。通過計算發現,在以植酸鈣為磷源的菌株中,菌株LP17的PSI和PSE最大,顯著高于菌株LP5和LP23,但與其他菌株無顯著差異;菌株LP5的PSI和PSE最小,顯著低于菌株LP16和LP17,而與其他菌株無顯著差異。

以磷酸鈣為磷源的解磷菌株中LM的PSI和PSE最大,顯著高于菌株LE、LH和LI,而與菌株LF無顯著差異;菌株LE的PSI和PSE最小,顯著低于菌株LF、LI和LM,但與菌株LH之間無顯著性差異(表2)。各菌株的溶磷能力強弱與溶磷圈所示結果一致(圖2)。

圖2 不同解磷菌株產生的溶磷圈Fig.2 Phosphate-solubilization halo produced by different phosphate-solubilizing strains

表2 解磷菌株的溶磷指數(PSI)和溶磷效率(PSE)Table 2 P solubilization index and P solubilization efficiency of different phosphate-solubilizing strains

2.3 菌株解磷能力的定量分析

5株解磷菌株從植酸鈣中活化出來的速效磷濃度為3.5—5.3 mg∕L(圖3A),其中菌株LP17對應的培養液中速效磷濃度最高,顯著高于菌株LP2、LP5和LP23,分別高出24.53%、33.96%和22.64%,而與菌株LP16無顯著性差異,同時菌株LP2、LP5和LP23對應培養液中速效磷濃度無顯著差異(圖3A)。菌株LP17對植酸鈣的活化能力也最高,顯著高于菌株LP2、LP5和LP23,但與LP16之間無顯著差異;菌株LP5對植酸鈣的活化率最小,顯著低于其他菌株(圖3C)。

對于活化磷酸鈣的解磷菌株來說,其活化出的速效磷濃度范圍是34.1—69.7 mg∕L,其中菌株LM對應的培養液中速效磷濃度最高,顯著高于其他菌株;菌株LE對應的培養液中速效磷濃度最低,且與其他菌株間的差異均達到顯著水平(圖3B)。另外,菌株LM對磷酸鈣的活化能力依然最高,顯著高于菌株LE、LH和LI,而與菌株LF無顯著差異;菌株LE的活化能力最低,與其他菌株均有顯著性差異(圖3D)。

圖3 解磷菌株活化植酸鈣和磷酸鈣的能力比較Fig.3 The capactity of phosphate-solubilizing strains to mobilize phytin(A,C)or tricalciurn phosphote(B,D)

2.4 解磷菌株培養液pH和磷酸酶活性

在以植酸鈣或磷酸鈣為磷源的液體培養基中接種解磷細菌并培養一段時間后,其培養液pH顯著低于初始pH,其中含有植酸鈣的培養液pH為5.05—6.09,菌株LP5對應培養液pH最高,與其他菌株存在顯著差異。根據培養液的實際pH來測定其磷酸酶活性,更能真實地反映培養液的磷酸酶活性。培養液中磷酸酶活性為5.93—7.14 μg∕(mL·min),其中菌株LP17對應的培養液中磷酸酶活性最高,顯著高于其他菌株(表3)。

以磷酸鈣為磷源的液體培養基的pH在4.92—5.98,其中菌株LE對應培養液pH最高,顯著高于菌株LF、LI和LM,而培養液pH最低的是菌株LM,與其他菌株差異顯著。5株解磷菌株對應培養液中的磷酸酶活性為6.37—8.71 μg∕(mL·min),菌株LM對應的培養液中磷酸酶活性顯著高于其他菌株,菌株LE對應的磷酸酶活性最小,顯著低于其他菌株(表3)。

表3 解磷菌株對應培養液的pH和磷酸酶活性Table 3 pH and phosphatase activity in fluid medium corresponding to different phosphate-solubilizing strains

2.5 培養液中磷酸酶活性與pH以及速效磷濃度的關系

以植酸鈣或磷酸鈣為磷源的培養液中pH與磷酸酶活性之間均存在極顯著的負相關關系,即培養液pH越高,其磷酸酶活性越低;且不同菌株的實際磷酸酶活性與速效磷濃度之間也存在極顯著的正相關關系,即磷酸酶活性越高,從植酸鈣或磷酸鈣中活化出的速效磷濃度越大(圖4)。

A、B以植酸鈣為磷源;C、D以磷酸鈣為磷源。

3 結論與討論

利用解磷微生物來活化土壤難溶性磷是提高作物磷素利用效率的一種有效且環保的重要措施,也是關乎糧食安全、生態文明建設、農業綠色發展等戰略的重大問題。目前,解磷微生物的分離篩選均是利用平板稀釋法進行的,這是一種簡單且有效的方法[16],如果將篩選獲得的高效菌株研制成微生物菌肥并應用到農業生產中,不僅能夠提高作物產量,也可以增加土壤肥力以及增強作物抗逆性[22-29]。

本研究通過平板培養法從小麥根際土壤中獲得10株能夠產生明顯溶磷圈的菌株,其中,5株解磷菌株能夠溶解磷酸鈣,另外5株可以降解植酸鈣,使其對應的培養基都產生了溶磷圈,通過對溶磷圈和菌落大小進行測量,并計算溶磷指數PSI與溶磷效率PSE,發現菌株LP17和LM的PSI與PSE均最高;同樣,這兩株解磷菌株從植酸鈣和磷酸鈣活化出的速效磷濃度也最大,這表明其具有較強的溶解植酸鈣和磷酸鈣的能力。分子鑒定表明,菌株LP17和LM分別隸屬于腸桿菌屬和芽孢桿菌屬,這兩個屬的細菌已被許多研究證明具有較強的解磷能力[30-34]。

酸解作用和酶解作用通常被認為是解磷細菌溶解無機磷和有機磷的機制[3-7]。在本研究中,與培養液的初始pH相比,培養過程中培養液的pH大幅下降,可能是解磷菌株分泌有機酸所致,而且培養液pH與磷酸酶活性之間存在極顯著的負相關關系。磷酸酶活性除了與介質pH密切相關外,還與其自身活性和底物有效性有關[35-36]。本研究發現以兩種不同磷源為底物的解磷細菌培養液中磷酸酶活性與可溶性磷含量之間存在極顯著的正相關關系,表明較低的培養液pH有利于磷酸酶活性和底物有效性的增加,進而增強了難溶性磷的活化,提高了可溶性磷含量。

近年來,隨著集約化農業發展的加快,大量化肥和農藥的投入對有益微生物的繁殖產生了負面影響[37],也使糧食生產面臨著嚴重的威脅。作為環保型修復劑的微生物菌肥,在替代化學肥料和農藥中起著重要作用[38-41],而且在實際生產中的效果也比較顯著[42-44],在綠色農業的背景下,擁有廣闊的應用前景。而微生物菌肥的有效成分是微生物,因此,通過篩選高效解磷微生物并對其進行馴化,使其能夠在不同環境和土壤條件下維持穩定的活性,這將為微生物肥料的研發提供高效的菌株資源,提高磷素在農業生產中的利用率,進而減少化學肥料的施用。本研究從小麥根際土壤中篩選出的菌株LP17和LM具有較強的溶解植酸鈣和磷酸鈣的能力,且分別隸屬于腸桿菌屬和芽孢桿菌屬,這只是分離具有解磷能力的細菌的第一步,后續還有大量的相關工作需要進行,如生理生化特征的分析、培養條件的優化、促生效果的驗證等[45-47]。