“碧護”對蘋果葉片衰老過程和相關抗氧化酶系統的影響

譚延肖,韓梅梅,鄭現和,石 瑩,徐文勝,李騰飛,杜夢揚

(德州市農業科學研究院,德州 253000)

植物生長調節劑是調節植物生長發育的化學合成物質,能在較低濃度下發揮作用,促進或抑制植物生長發育。通過刺激或抑制植物內源激素產生,調節植物生長或改變局部組織的微觀結構;通過調節植物中核酸、蛋白質和酶的合成,調控植物生長的不同階段或改變植株形態[1]。研究表明,植物生長調節劑還可以影響酚類、萜類以及含氮化合物等生物活性成分在植物體內的合成,對植物次生代謝進行調控[2]。Anastasia等[3]研究表明,扁豆植物的生長、產量、抗氧化活性和酚類物質含量都會受植物生長調節劑的影響。傅華龍等[4]指出,一些植物生長調節劑能提高植物蛋白、糖等含量,增強植物的抗寒性、抗旱性、抗鹽堿性和抗蟲性。其中,植物生長調節劑對果樹的影響主要表現在調控營養生長和花芽分化,促進插條生根,提高果樹抗逆性,影響果實的生長、成熟、品質和耐貯性等方面[5]。

“碧護”是德國科學家研制的一種植物源生長調節劑,內含赤霉素、蕓苔素內酯、吲哚乙酸、脫落酸、茉莉酮酸等8種植物內源激素,10余種黃酮類催化平衡成分,20余種氨基酸和抗逆誘導劑等[6]。具有打破休眠、促進生根、強壯樹體、促進坐果、改善品質、促進早熟、提高植株抗逆性等功能[7]。近年來,“碧護”在國內外被廣泛應用于糧食[8]、蔬菜[9]、水果[10-12]、茶葉[13-14]、棉油[15]等作物生產中,大幅度提升了農產品的產量和品質。本研究以富士蘋果葉片為試材,采用黑暗誘導方式,探究施加“碧護”對蘋果葉片衰老的影響,以期為“碧護”在生產中用于調控植株衰老提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藥劑“碧護”(0.136%蕓苔素·吲哚乙酸·赤霉酸)為德國阿格福萊農林環境生物技術股份有限公司生產。植物材料為栽植于試驗基地內(北緯36°24′、東經115°45′)的樹齡5年的紅富士蘋果植株。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

田間采集葉位相同、生長一致的富士蘋果當年生枝條成熟葉片,自來水沖洗后,無菌水沖洗3遍,葉柄末端用脫脂棉包裹,置于溫度21—23℃,空氣相對濕度70%的培養箱中。試驗設置對照組(CK,噴施蒸餾水)、處理組1(CL1,噴施“碧護”,原液稀釋15 000倍)和處理組2(CL2,噴施“碧護”,原液稀釋8 000倍),分別于光下[光照強度120 μmol∕(m2·s)]和黑暗下處理16 d,分別于0 d、4 d、8 d、12 d、16 d收集樣品,-80℃保存,備用。各處理重復3次。

1.2.2 葉綠素及可溶性蛋白含量測定

葉綠素用80%丙酮萃取,測定方法參考Li等[16]。取0.5 g葉片,投入10 mL 80%丙酮中,避光浸提24 h,用UV-2550分光光度計,分別測定波長663 nm、645 nm和470 nm下的吸光值,計算葉綠素含量。

可溶性蛋白的提取和測定方法參考Bradford[17]。取0.5 g葉片,加入2%(m∕V)聚乙烯吡咯烷酮和1.0 mL 50 mmol∕L的磷酸二氫鉀緩沖液(pH 7.8,含1 mmol∕L EDTA-Na2和11% Triton X-100)研磨成勻漿。12 000 r∕min、4℃離心20 min,取上清,測定可溶性蛋白含量。

1.2.3 基因表達分析

PAO和SAG12基因表達水平通過實時熒光定量PCR進行檢測[18]。以MpActin為內參基因,每5個處理葉片混合為1個樣本,提取RNA,進行3次生物學重復。

1.2.4 H2O2和MDA含量測定

H2O2的提取和測定方法參考王平[19]。在410 nm處測量吸光值,并根據由UV-2550分光光度計獲得的標準曲線計算H2O2濃度。

MDA含量測定方法參考Heath等[20]。取0.5 g葉片,加入1.5 mL預冷的0.1%(w∕v)TCA溶液充分研磨,12 000 r∕min、4℃離心20 min;取0.5 mL上清,加入1 mL 0.65%硫代巴比妥酸(TBA),沸水浴30 min;冰中終止反應,5 000 r∕min、4℃離心10 min。用UV-2550分光光度計分別測定532 nm和600 nm下的吸光值,計算MDA含量。

1.2.5 抗氧化系統相關酶活性測定

取0.5 g葉片,加入2%(m∕V)聚乙烯吡咯烷酮和1.5 mL 50 mmol∕L的磷酸二氫鉀緩沖液(pH 7.8,含1 mmol∕L EDTA-Na2和11% Triton X-100)研磨成勻漿。12 000 r∕min、4℃離心20 min,取上清,測定過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性,測定方法參考殷麗華[21]。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 13.0軟件進行數據處理,使用Sigma Plot軟件作圖,并應用獨立樣本的t檢驗對變量進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 “碧護”對黑暗誘導的蘋果葉片衰老過程的影響

葉片衰老是植物發育過程中重要的生命現象,通常利用黑暗誘導離體葉片衰老[22]。由圖1可知,黑暗下16 d后未噴施“碧護”的葉片已經明顯失綠黃化,而噴施“碧護”的處理組葉片變化不明顯。通過測定它們的葉綠素含量和可溶性蛋白含量也驗證了這一現象。黑暗下處理16 d后,對照組葉片中的葉綠素和可溶性蛋白含量明顯下降,而在處理組葉片中仍保持較高的水平(圖2)。

圖1 “碧護”對黑暗誘導蘋果葉片衰老的影響Fig.1 Effects of “Bihu” on dark-induced senescence of apple leaves

圖2 “碧護”對黑暗誘導蘋果葉片衰老過程中葉綠素和可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effects of “Bihu” on the contents of chlorophyll and soluble protein during dark-induced senescence of apple leaves

2.2 蘋果葉片衰老相關基因PAO和SAG12表達情況

PAO基因與葉綠素降解相關;SAG12是一個衰老過程特異表達的半胱氨酸蛋白酶基因。PAO和SAG12基因的表達水平在處理16 d的對照組中明顯上調,而在處理組葉片中仍保持較低的水平(圖3)。

圖3 “碧護”對黑暗誘導蘋果葉片衰老過程中PAO和SAG12基因表達的影響Fig.3 Effects of “Bihu” on the expression of PAO and SAG12 genes during dark-induced senescence of apple leaves

2.3 蘋果葉片H2O2和MDA水平的變化

H2O2的積累是葉片衰老的一個表現,同時H2O2的積累也會加速葉片的衰老進程。由圖4-A所示,光照條件下,對照組和處理組葉片內H2O2的積累量都保持在較低的水平,而黑暗處理誘導H2O2大量積累,但處理組葉片中積累的H2O2相對較少(圖4-A)。

植物體積累的活性氧(ROS)可以直接與氨基酸、蛋白質和核酸發生反應,導致脂質過氧化產物丙二醛(MDA)的增加。黑暗下,對照組和處理組葉片中MDA的含量均有明顯升高,但處理組中MDA的積累量比對照組明顯要低(圖4-B)。這表明,噴施“碧護”可以有效緩解黑暗誘導的葉片衰老過程中膜脂過氧化損傷。

圖4 “碧護”對黑暗誘導蘋果葉片衰老過程中H2O2和MDA含量的影響Fig.4 Effects of “Bihu” on the contents of H2O2 and MDA in apple leaves during dark-induced senescence

2.4 蘋果葉片抗氧化系統酶活性的變化

CAT、POD和APX可以促進H2O2的降解[23-24]。黑暗下,CAT、POD和APX的酶活性都出現了顯著變化,然而在處理組葉片中這些抗氧化酶的活性明顯比對照組高(圖5)。這表明,噴施“碧護”可以影響黑暗誘導的蘋果葉片衰老過程中抗氧化酶的活性。

圖5 “碧護”對黑暗誘導蘋果葉片衰老過程中抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of “Bihu” on the antioxidant enzyme activity in the process of dark-induced apple leaf senescence

3 討論

“碧護”作為植物生長調節劑,可有效增加土壤有益微生物菌群數量,平衡植物營養,增強根系功能,促進根系發育,進而激發植物生長潛力,解決因微量元素缺乏引起的爛根、黃葉、裂果等問題,提高其抗蟲性、抗病性,進而提升作物產量和品質。“碧護”在果樹上的作用主要體現在以下幾方面:可以提高果樹抗逆性,減輕病蟲害,預防花期凍害;促進扦插生根,提高育苗成活率;促進光合作用,促發枝,增強樹勢;促進花芽分化,?；ū９?促進果實成熟,提高商品率,延長貨架期[25-26]。

本研究結果表明,施加“碧護”可以明顯推遲黑暗誘導的蘋果葉片衰老進程。葉綠素降解導致的葉片黃化是葉片衰老的一個重要標志。在黑暗處理16 d后噴施“碧護”,葉片仍保持較高的葉綠素和可溶性蛋白水平。前人報道了一些葉綠素降解途徑的相關基因[27],PAO是其中一個關鍵基因,在未噴施“碧護”的對照組葉片衰老過程中該基因被強烈誘導表達,而在噴施“碧護”的葉片中該基因的上調表達明顯被抑制。另外,在葉片衰老過程中有些基因的表達被特異性誘導,這一類基因被稱作衰老相關基因,其中SAG12通常被視作衰老的標志性基因[28]。在本試驗中,黑暗誘導下噴施“碧護”的葉片中該基因的表達明顯被抑制,這也表明“碧護”的施用使得蘋果葉片衰老過程被推遲。

自由基假說認為,葉片衰老的發生主要是因為大量活性氧類物質的生成所致[29]。H2O2作為穩定的自由基在很多植物葉片衰老過程中產生。在本試驗中,黑暗誘導下未噴施“碧護”葉片中H2O2的積累量與噴施“碧護”的葉片相比明顯較多,而H2O2清除的關鍵酶CAT、POD和APX的活性在噴施“碧護”的葉片中明顯較高。因此,“碧護”的噴施可能參與調控植株體內抗氧化酶活性和H2O2的平衡,進而緩解黑暗誘導的葉片衰老過程中造成的氧化損傷,最終延緩了葉片衰老進程。

4 結論

植物生長調節劑“碧護”的施加有效延緩了黑暗誘導的蘋果葉片衰老過程,緩解了衰老過程中葉綠素和葉片蛋白質的降解。而且,“碧護”可能通過影響抗氧化酶CAT、POD和APX的活性,提高ROS的清除能力,緩解衰老過程中的氧化損傷,保護植物細胞免受自由基的傷害。因此,“碧護”的施加對蘋果葉片衰老過程具有重要作用,但是關于該植物生長調節劑參與葉片衰老過程中的具體調控機制仍需要進一步去探究。