規模豬場豬呼吸道疾病病原診斷實例分析

李東風 ，秦子昂 ，王麗霞 ，陳芳芳 ，常 紅

（1.安徽省獸藥飼料監察所，安徽 合肥 230091；2.安徽洪橋中科基因技術有限公司，安徽 合肥 231131；3.山西省檢驗檢測中心，山西 太原 030012）

豬呼吸道疾病在規模豬場多發和常見，往往是細菌性和病毒性疾病混合感染。目前，豬場對豬呼吸道病原菌的檢測步驟主要為病癥觀察，病料收集，病料培養基接種，抗體檢測，細菌的分離、純化、鑒定，核酸電泳等。現將安徽某豬場出現呼吸道癥狀的病豬病原分離鑒定案例報告如下：

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 病料來源

病料來源于安徽某發病豬場60日齡小豬，具有呼吸困難、高熱昏睡、肺部纖維素樣病變等呼吸道系統癥狀，送檢兩塊肺部組織。

1.1.2 培養基和試劑

培養基：大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）、胰胨肉湯培養基（TSB）、血平板培養基。

生化試劑：5×TBE緩沖液、1.0%瓊脂糖凝膠、磁珠法核酸提取試劑豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型實時熒光PCR檢測試劑和豬圓環病毒2型通用型實時熒光PCR檢測試劑、氧化酶試紙和觸酶試劑。

抗生素藥敏紙片：頭孢噻呋、恩諾沙星、替米考星、氟苯尼考、氨芐西林、泰妙菌素、鏈霉素、環丙沙星、阿莫西林。

1.1.3 儀器設備

超純水處理系統購買于蘇州邦澤凈化設備有限公司，超凈工作臺購買于蘇州安泰空氣技術有限公司，生物安全柜購買于蘇州蘇潔醫療器械有限公司，恒溫培養箱購買于美國SHELLAB 公司，凝膠成像分析系統購買于北京六一生物科技有限公司，穩壓穩流電泳儀和水平電泳槽購買于北京六一生物科技有限公司，微量高速離心機購買于上海凈信實業發展有限公司，熒光PCR儀購買于重慶京因生物科技有限公司，冰箱產自青島海爾特種電器有限公司，全自動核酸提取儀購買于賽默飛示爾科技有限公司，顯示器檢測顯微鏡購買于賽默飛示爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病原菌的分離和純化

取不銹鋼托盤置于生物安全柜中，平鋪上一層一次性塑料袋，點燃酒精燈，對鑷子、接種環進行灼燒滅菌。用鑷子從密封袋中夾出豬肺病料，輕放在托盤中，用鑷子夾起酒精棉球對豬肺的表面進行擦拭消毒。更換酒精棉球并用酒精燈點燃，再次對病料表面擦拭，棄棉球于裝滿水的1 000 mL燒杯中滅火。用鑷子夾起豬肺組織一角輕輕提起，用無菌剪刀剪出一個截面，再從截面向內剪下一塊約1 cm3大小的深層組織，分別蘸于TSA平板上，用接種環進行四區劃線，37℃恒溫培養 18～24 h。

取出恒溫箱中的培養基，在1號的TSA培養基上，生長有兩種形態的菌落，一種無色透明、光滑濕潤、針尖狀，記為a菌，另一種呈半透明、表面光滑濕潤、露珠狀的圓形菌落，記為b菌。在2號的TSA培養基上，生長有與b菌菌落形態相同的菌落，記為c菌。另取三塊TSA培養基，用接種環分別挑取以上三種細菌單個菌落進行四區劃線，恒溫箱中37℃培養18 h。

將分離后得到的3種菌再次挑取單菌落接種于TSA培養基上進行四區劃線，由于細菌純度已經較高，每劃線一個區域，都需要進行灼燒滅菌處理，最后才能得到單個菌落。恒溫箱中37℃培養18 h。

1.2.2 革蘭氏染色鏡檢

取兩塊載玻片，向中心滴1滴生理鹽水，用接種環分別挑取純化后的a和b菌單菌落，先點到中心，再陸續向外均勻涂抹于載玻片上，等待自然干燥后進行短時間火焰固定。用革蘭氏染液進行快速染色，置于顯微鏡下，于載玻片上滴上香柏油1滴，用1000×油鏡鏡檢。

1.2.3 氧化酶和觸酶試驗

取3個載玻片，在中心各滴上1滴生理鹽水，用接種環依次挑取純化后的TSA平板中的3種菌的單個菌落，均勻涂布在載玻片上，再分別滴入過氧化氫試劑1-2滴，若有氣泡產生則為陽性，若沒有氣泡產生則為陰性。

取氧化酶試紙3張，用生理鹽水浸濕，用接種環分別挑取3種細菌單個菌落，在試紙上從左到右來回涂抹，若觀察到試紙在1 min之內變為藍紫色，記為氧化酶陽性；若試紙1 min內沒有變色，記為氧化酶陰性。

將純化后的3種菌，用接種針分別挑取單個菌落，接種于TSB液體培養基中，加入等體積的甘油封裝保存備用。

1.2.4 藥敏試驗

進行藥敏試驗的藥品有：頭 孢 噻 呋（Ceftiofur）、 恩諾 沙 星（Enrofl oxacin）、 替 米考 星（Tilmicosin）、 氟 苯 尼考（Florfenicol）、 氨 芐 西 林（Ampicillin）、泰妙菌素（Tiamulin）、鏈 霉 素（Streptomycin）、 環 丙 沙星（Ciprofl oxacin）、 阿 莫 西 林（Amoxicillin）共9種。

取出保存細菌的TSA液體培養基，另取兩個TSA培養基和兩個西林瓶，瓶中加入生理鹽水至中位線，分別用接種環挑取a菌和b菌于西林瓶中，配制比濁度為4的菌懸液。將無菌棉簽浸潤在菌懸液中，擠出多余的液體，在TSA培養基上密集、來回劃線，順時針方向旋轉培養基，繼續連續劃線，確保接種液涂抹均勻，直到培養基旋轉至初始位置，最后緊貼平板的內壁涂抹兩圈。用記號筆在培養基底蓋上劃分出9個大小相等的區域便于放置藥敏片。

用鑷子依次夾起各藥品的藥敏片，先輕輕垂直放置于培養基的表面，隨后按住藥敏片一側緩緩將其平放，這樣可使鑷子不觸及培養基避免要反復灼燒滅菌，造成實驗過程過長，影響實驗結果，涂菌后應在15 min之內貼上藥敏片。將貼好藥敏片的TSA培養基放入37±1℃恒溫培養箱中培養18 h，次日用游標卡尺讀取抑菌圈大小判定耐藥性。

1.2.5 分子生物學鑒定

在超凈工作臺上，取1枚八聯管，將存放于TSB液體培養基中的a、b、c3種菌液，分別用移液器取200μL的樣品加入八聯管中，再吸取20μL的裂解液，放入離心機中離心半分鐘混合均勻后放入核酸提取儀中，啟動程序。2 h后將提取好的核酸樣品進行熒光PCR的體系配置。

使用磁珠法核酸提取試劑，加入反應液 20μL，酶 1μL，4μL的核酸提取液，離心混合均勻，放入熒光PCR儀中，設定參數：95℃預熱 5 min 變性，95℃ 5 s，57℃ 15 s，72℃40 s反應40個循環，72℃延伸15 min。

分別進行豬藍耳病病毒、豬圓環病毒2型、副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌的熒光PCR檢測。判定標準為：有擴增曲線且Ct值≤35為陽性；35＜Ct值≤38為可疑；Ct值＞38為陰性。

之后進行體系配置，取微型離心管1只，加入12.5 μLMix，DD水5 μL，副豬嗜血桿菌的上下游引物各1 μL，最后加入4.5 μL細菌a的核酸樣品，離心混合均勻后放入PCR儀中進行擴增。

稱取0.75 g瓊脂糖粉末加入250 mL錐形瓶中，再向錐形瓶中加入20 mL的5×TBE緩沖液，搖勻后放入微波爐中加熱2～3 min使其完全溶解，隨后滴入溴化乙錠5 μL，搖晃均勻倒入泳道模板上自然冷卻20 min。

將配置好的瓊脂糖凝膠溶液倒入泳道模板中，定型后取出插孔，抹掉模板下方溢出的瓊脂并放入點泳池中，將擴增好的a菌核酸用移液器吸取5 μL加入到第5個孔中，在第2個孔中加入5 μL陰性對照，在第3個孔中加入5 μL陽性對照，在第1個 孔 中 加 入 2000 BPMark5 μL，接通電泳儀的電源以100～120 v電壓進行核酸電泳45 min。電泳完成后，倒出模板上的瓊脂，放入凝膠成像分析系統進行紫外照射得到電泳圖。

2 結果與分析

2.1 病料接種

肺組織接種的TSA平板區域生長有3種形態的菌落。一種無色透明、光滑濕潤、邊緣整齊、針尖狀菌落，另外兩種菌落形態特征相似，其一呈半透明、表面光滑濕潤、露珠狀的圓形菌落；其二呈半透明、表面光滑濕潤、露珠狀的圓形菌落。結果如圖1。

圖1 病料TSA培養基接種圖

2.2 革蘭氏染色鏡檢

經過革蘭氏染色后，置于油鏡下觀察：a菌呈革蘭氏陰性短小絲狀桿菌，兩頭鈍圓；b菌呈革蘭氏陽性球菌，單個或多個鏈狀排列；c菌呈呈革蘭氏陽性球菌，單個或多個鏈狀排列。故a疑似副豬嗜血桿菌，b和c疑似為豬鏈球菌。染色結果如圖2和圖3。

圖2 a菌革蘭氏染色鏡檢圖（1000×）

圖3 b菌和c菌革蘭氏染色鏡檢圖（1000×）

2.3 溶血試驗和衛星試驗

取兩塊血平板接種環分別挑取b菌和c菌單菌落進行四區劃線接種，恒溫箱中37±1℃培養18～24 h得到純化后的細菌。其中在TSA上的3種菌菌落形態與初步分離時相同，在血平板上的細菌呈細小圓形、邊緣整齊并有溶血環現象，試驗結果如圖4，符合鏈球菌的菌落特征。

圖4 b菌和c菌血平板劃線培養圖

另取血平板1塊，挑取純化后的a菌單個菌落，在血平板上橫向平行劃線，灼燒接種環，再從金黃色葡萄球菌標準菌株平板上挑取金黃色葡萄球菌，在血平板左右各三分之一處垂直于a菌的線劃線，恒溫箱中37℃培養18 h，進行衛星實驗。實驗結果如圖5，a菌大多數集中于金黃色葡萄球菌的周圍生長，分布密集，遠離金黃色球菌的地方菌落稀疏。

圖5 衛星試驗結果圖

2.4 氧化酶和觸酶試驗結果

觸酶試驗觀察到a有產生大量氣泡的現象，記為觸酶陽性。b和c沒有氣泡產生記為觸酶陰性。氧化酶試驗觀察到a菌的試紙在1 min之內變為藍紫色，記為氧化酶陽性。b和c菌的試紙沒有變色，記為氧化酶陰性。

以上細菌鑒定結果如表1所示。

表1 細菌鑒定實驗結果記錄表

2.5 病原菌生物學鑒定結果

根據初步實驗結果來看，a菌疑似副豬嗜血桿菌；b菌和c菌疑似豬鏈球菌，依此為進一步試驗的基礎結論。

2.6 熒光PCR鑒定

2.6.1 豬鏈球菌PCR擴增

豬鏈球菌PCR擴增結果如圖6所示，陽性對照Ct值處于正常范圍內，且b菌和c菌Ct值均小于陽性對照，故判定病料存在豬鏈球菌感染。

圖6 豬鏈球菌PCR擴增曲線

2.6.2 副豬嗜血桿菌PCR擴增

副豬嗜血桿菌PCR擴增結果如圖7所示，陽性對照Ct值處于正常范圍內，且a菌Ct值＜35，故判定病料存在副豬嗜血桿菌感染。

圖7 副豬嗜血桿菌PCR擴增曲線

2.6.3 豬圓環病毒2型PCR擴增

豬圓環病毒2型PCR擴增結果如圖8所示，陽性對照Ct值處于正常范圍內，35＜樣品Ct值≤ 38，故結果判定為可疑，該豬可能存在豬圓環病毒2型感染。

圖8 豬圓環病毒2型PCR擴增曲線

2.6.4 豬繁殖與呼吸綜合征病毒PCR擴增

豬繁殖與呼吸綜合征病毒PCR擴增結果如圖9所示，樣品無Ct值，判定為該豬沒有豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染。

圖9 豬繁殖與呼吸綜合征病毒PCR擴增曲線

2.7 瓊脂糖凝膠電泳結果

由圖10電泳圖譜可知，樣品的bp值位于750 bp和1 000 bp之間，位置與陽性對照相同，bp值為822 bp，故a菌為副豬嗜血桿菌。

圖10 副豬嗜血桿菌瓊脂糖凝膠電泳圖

2.8 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果如表2所示。副豬嗜血桿菌對頭孢噻呋、恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林敏感性極高，對替米考星、泰妙菌素中度敏感，對氨芐西林、鏈霉素、環丙沙星耐藥。豬鏈球菌對頭孢噻呋、恩諾沙星敏感性極高，對氨芐西林、泰妙菌素、阿莫西林中度敏感，對替米考星、氟苯尼考、鏈霉素、環丙沙星耐藥。

表2 副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌的藥敏試驗結果判斷表

3 討論

本實驗成功從樣品肺組織中分離出副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌，并檢測出病料組織存在豬圓環病毒2型感染，不存在豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染。對于豬呼吸道病原的鑒定，首先應當根據臨床癥狀以及發病前的管理程序結合當地流行病學史初步確定可能的病原體，再取病豬臨床癥狀明顯的組織或器官如肺、喉頭接種于營養成分豐富的培養基如TSA，確保苛養菌能夠正常生長。對培養出來的菌落觀察其形態特征，通過革蘭氏染色鏡檢進一步篩選出符合條件的細菌并做出假設。隨后進行氧化酶試驗和觸酶試驗，初步驗證假設后進行熒光PCR鑒定和瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

該鑒定過程中時刻需要注意無菌操作，所有器材使用前必須經高壓滅菌，實驗過程中必須全程在超凈工作臺和生物安全柜中進行。細菌的初步分離純化是鑒定過程中最關鍵的步驟，必須純化出單個菌落才能進行之后的實驗操作，因此操作者應熟練四區劃線手法，一區劃線后需要對接種環進行灼燒后才能繼續劃線，否則很難生長出單個菌落。

此方法能夠在48 h內迅速確定病原體，操作簡潔，步驟嚴謹、符合邏輯，且鑒定所需儀器試劑和設備中小型豬場實驗室內均可設立。普通PCR需要人工進行核酸提取，需要多次添加試劑進行離心，操作復雜且樣品易受污染。而本實驗采取的熒光PCR只需使用商業化的PCR檢測試劑盒，加入模板和引物后放入熒光PCR儀中，選擇設定好的程序即可進行PCR反應，且通常反應在1～3 h內，通過反應的Ct值即可判斷感染情況。