西瓜枯萎病生防菌研究進展

（1.德州市農業科學研究院，山東，253015；2.德州市農業綜合執法支隊；3.河北農業大學園藝學院）

目前針對西瓜枯萎病的防治方法主要有農業防治、化學防治和生物防治等。 農業防治是利用農業生產過程中的各種管理或栽培措施來防治病蟲害。 西瓜枯萎病農業防治主要是采取嫁接和輪作，但嫁接技術難度大，全部依賴于人工，勞動力成本高， 且砧木的類型和嫁接方式會影響果實品質；另外，輪作需要的耕地面積較大，在土地資源有限的情況下難以實現；而培育西瓜抗枯萎病品種，需要的時間長，經濟投入大，且選育出的品種一般不能抗所有的生理小種，適用性較窄。 化學防治是利用化學殺菌劑來防治病原菌， 長期使用易產生抗藥性，造成農藥殘留，易對環境產生污染。生物防治主要是利用對病原菌有拮抗作用的生防菌來降低病菌數量達到防控目的，因其安全有效，目前已成為新的研究熱點[5]。 近年來利用生防菌防治西瓜枯萎病的研究取得了較大進展，本文將從西瓜枯萎病生防菌的獲得、鑒定、生物防效，存在的問題及展望作簡要綜述，旨在為西瓜枯萎病生防菌的開發利用提供一定的參考。

1 生防菌的獲得

1.1 生防菌的來源

1.2 生防菌的分離與篩選

從土壤中獲得的微生物數量多， 種類復雜，需要對其進行分離和篩選。微生物的分離主要有稀釋涂布法和平板劃線法。稀釋涂布法的目的是將單一菌株從混雜的微生物群體中分離出來，首先將土壤進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的土壤溶液分別涂布在培養基的表面進行培養。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而能在培養基表面形成單個菌落。 平板劃線法的目的是純化菌種，挑取單一菌落劃線接種在培養基上，保證同一個菌落是由同一個細胞分裂、繁殖產生的后代。 分離純化后的菌株還需經過進一步的篩選才能利用。生防菌的篩選主要使用平板對峙法。 初篩是在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基中央放置5～7 mm 的FON 菌餅，在其外周等距接種供試菌株， 培養一段時間后觀察菌絲拮抗情況；復篩則是將初篩得到的拮抗菌經過培養過濾得到無菌發酵液，進行平板對峙試驗，也可以使用拮抗菌濾液制成培養基計算抑菌率。平板對峙法產生拮抗作用，可能與生防菌所分泌的蛋白酶、纖維素酶和幾丁質酶等酶相關[16]。 王亞嬌等[17]采取平板對峙法共選取抑菌帶大于4 mm 的60 個拮抗菌， 結合盆栽防效測試，得到綜合性好的菌株SFJ11。 岳菊等[18]通過平板對峙法得到7 株對4 種病原菌有較強拮抗作用的菌株。 也有研究人員利用肉湯瓊脂培養基進行平板對峙試驗， 從海洋海綿共生菌和土壤樣品中初步篩選到具有明顯拮抗活性的菌株共6 株[19]。

2 生防菌的鑒定

經過篩選的生防菌，需要進行進一步的鑒定分類，確定其在進化中的地位，以便加以利用。微生物傳統的鑒定方法有形態學分類法和生理生化鑒定法。形態學分類法是通過顯微鏡觀察，參考《常見細菌系統鑒定手冊》[20]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[21]等專業手冊，基于菌種細胞的形態、大小、排列、運動性、特殊構造和染色反應及菌落形態、在培養基中的生長狀態等形態指標進行鑒定分類的一種方法；生理生化鑒定法是利用化學反應來測定微生物的代謝產物，生理生化反應常用來鑒別一些在形態和其他方面不易區別的微生物。這2 種方法是最基礎的鑒定方法，適用于所有微生物。

曹云娥等[15]參考《常見細菌系統鑒定手冊》，以菌株WQ-6 單菌落在培養初期邊緣整齊，表面有光澤，培養后期邊緣呈鋸齒狀，四周隆起等形態學特征和菌株在淀粉水解、甲基紅試驗中呈陽性等生理生化試驗結果， 初步鑒定WQ-6 菌株屬芽孢桿菌屬。 王卿[13]參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，根據拮抗菌株菌落形態、革蘭氏染色、芽孢染色菌株以及11項生化檢測，初步判定所篩拮抗菌Jaas ed2 為多黏類芽孢桿菌，Jaas ed3 為枯草芽孢桿菌。馮翠娥[22]將從砂瓜種植大田土壤中分離篩選得到的拮抗菌進行形態特征觀察和生理生化試驗， 初步判斷篩選的菌株XS-4、XS-20-15 均屬芽孢桿菌屬。傳統的鑒定方法是目前最基礎、最廣泛使用的方法，但是存在一些問題：對人員素質要求較高，需要由專業知識豐富和有長期鑒別經驗的人來操作， 且傳統方法指標多，工作量大，耗時長，鑒定準確性差，一般只能鑒定到屬， 對于相似菌株容易產生鑒定偏差， 因此菌株鑒定需要結合現代分子生物學技術進行。

3 生防菌的生物防效

雖然經篩選鑒定出的菌株具有拮抗效果，但不能確保為最優的實用菌株，在植株根部的定殖能力決定其在實際應用中的生防效果，需要進行進一步的生物防效測定。測定拮抗菌的生物防效分為室內盆栽試驗和大田試驗，室內盆栽試驗一般以西瓜幼苗作為試驗材料，在盆栽基質中注入拮抗菌和FON液測試防治效果，一般試驗時間較短，在注入后15 d左右進行觀察。 大田試驗一般是室內試驗結束后，將較為成熟的拮抗菌制成相應的生物制劑，在連作瓜田中進行測試，一般時間較長，要進行幾茬西瓜的比較。陸楚月等[27]在大棚盆栽試驗條件下，以2～3片真葉西瓜苗為試驗材料，測試綠色木霉對西瓜枯萎病的防控效果，防效為60%；紀明山等[28]將拮抗木霉和拮抗細菌制成不用濃度的生物制劑，分別在室內和田間進行生物防效測定，防效最高可達76.78%和76.79%；王麗麗等[29]用灌根法測試了不同濃度菌株15 發酵液對出苗10 d 的西瓜苗的影響，防效為42.3%。 測定生物防效時，除了直接接種拮抗菌外，還可將生防菌與有機肥混合發酵，或制成生物菌劑施用。

生防菌主要是通過降低致病菌的數量來抑制枯萎病的發生，也有些生防菌是通過促進西瓜對營養元素的吸收來提高植株自身抗性，從而達到抑制枯萎病的效果。 經試驗驗證，瓜田接種一定量的叢枝菌根菌能有效改善西瓜植株對氮、磷、硼、鋅等礦質營養的吸收，特別是能促進西瓜對土壤中礦質態磷素的吸收[30]。 研究還表明，有些生防菌是通過次生代謝物或者提高酶活性來增強植物抵抗力，西瓜植株根部分泌酚酸和有機酸的量會影響枯萎病的發生率[31]，解淀粉芽孢桿菌通過次生代謝產物表面活性素誘導植物產生早期免疫反應，并增強對病原菌的抵抗能力[32]。 研究表明，先施加解淀粉芽孢桿菌B6， 能誘導西瓜幼苗SOD 和POD 酶活升高，再施加尖孢鐮刀菌，幼苗中SOD 和POD 酶活會更早、更強烈地表達，激發幼苗抵抗病原菌的潛力[33]。

4 存在的問題及展望

生物防治被認為是對環境最友好的防治措施之一，目前國內外已經有很多研究報道，其中有些生防菌已成功應用于生產，例如由水谷欣生物科技有限公司生產的含有枯草芽孢桿菌的西瓜專用菌劑在苗期對西瓜枯萎病的防效高達94.9%，由青島地恩地生物科技有限公司生產的放線菌菌劑對西瓜枯萎病的防效達到90.9%[1]。 利用拮抗微生物防治西瓜枯萎病，不僅可以降低環境污染，還能緩解病原菌的抗性，促進植物生長，增加西瓜產量。雖然生防菌因對環境安全無污染而成為目前研究的熱點，但還是面臨著很多問題。例如，同一種生防菌在室內抑制效果比大田更穩定可靠，原因主要是相對于室內環境，大田環境較復雜，易受土壤條件、環境變化、微生物種群數量和種類的影響，使得很多生防菌在大田防治中效果較差或者表現不穩定。 此外， 生防菌對西瓜枯萎病的拮抗機制并不明確，而且對其本身的風險性評價較少，獲得的拮抗菌不能很好地應用。 針對這些問題，研究者可以在今后的工作中著手篩選穩定、 高效并具有廣譜性的菌株，篩選適合生防菌存活的基質， 提高生防菌在土壤環境中的定殖能力和存活時間。 此外，因拮抗菌無法直接接種到大田中，可以在不降低拮抗菌生物活性的前提下將其制成可濕性粉劑、顆粒劑、水分散粒劑和種衣劑[34～36]，也可接種到生物有機肥中[37，38]，提高應用效果。 研究者還可以結合現代生物技術，加強對西瓜枯萎病的生防菌研究，注重生防菌的田間防效，發掘生防菌的防治潛力，提高生產應用價值，逐漸取代部分化學農藥的使用，實現低成本、安全、無污染、增產增質的目標，促進西瓜枯萎病的生物防治取得突破性進展。