固相萃取—超高效液相色譜—質(zhì)譜法測(cè)定食用香精中3種甲基咪唑類物質(zhì)

周艷華 李 濤 向 俊 徐文泱

食品中常見的美拉德反應(yīng)可產(chǎn)生賦予食品色、香、味的成分，同時(shí)也可能伴隨產(chǎn)生甲基咪唑類化合物[1-2]。甲基咪唑是一類五元雜環(huán)化合物，對(duì)動(dòng)物有強(qiáng)烈驚闕作用，可誘發(fā)癲癇。目前，甲基咪唑化合物檢測(cè)主要有紫外分光光度法[3]、氣相色譜法[4]、液相色譜法[5]、質(zhì)譜法[6-9]等。紫外分光光度法成本低，操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低，適用范圍小，且易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。氣相色譜法定量準(zhǔn)確，適用于易揮發(fā)、成分簡(jiǎn)單樣品，但對(duì)于復(fù)雜樣品，易出現(xiàn)假陽性，重復(fù)性差。液相色譜法定量準(zhǔn)確，但靈敏度不高，前處理需衍生化，操作步驟復(fù)雜。氣相質(zhì)譜法易受雜質(zhì)干擾，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，不能滿足痕量測(cè)定需求。液質(zhì)法選擇性強(qiáng)，靈敏度高，被廣泛應(yīng)用于食品中痕量有毒有害物的檢測(cè)，是檢測(cè)甲基咪唑的最優(yōu)方法。甲基咪唑分子量較小，質(zhì)譜裂解可能會(huì)出現(xiàn)假陽性和基質(zhì)效應(yīng)，內(nèi)標(biāo)法是保障結(jié)果準(zhǔn)確性的有效手段。

現(xiàn)有研究主要集中于含焦糖色素和添加焦糖色素的食品(如醬油[10]、耗油[11]、豆制品[12])中甲基咪唑的檢測(cè)，多采用GB 5009.282—2020方法，此法不適用于食用香精等食品添加劑檢測(cè)。研究擬使用三氯乙酸高效提取除雜，采用固相萃取法(SPE)和超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法(UPLC-MS/MS)進(jìn)行富集凈化和定性檢測(cè)，最后利用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，旨在建立一種快速檢測(cè)食用香精中甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的方法，為食品安全監(jiān)管部門有效監(jiān)控食用香精中3種甲基咪唑化合物的來源提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻辣香精、牛粉香精、雞肉膏等：市售;

乙腈、甲醇：色譜純，德國默克公司；

三氯乙酸、乙酸銨、氨水：優(yōu)級(jí)純，上海國藥試劑有限公司；

1-甲基咪唑：純度>99%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

2-甲基咪唑：純度>99%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；

4-甲基咪唑：純度>98.5%，北京曼哈格生物科技有限公司；

1-甲基咪唑-D6、2-甲基咪唑-D6內(nèi)標(biāo)物：純度≥98%，天津阿爾塔科技有限公司；

4-甲基咪唑-D6內(nèi)標(biāo)物：純度>98%，加拿大CDN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

質(zhì)譜儀：TSQ Quantis型，美國賽默飛公司；

分析天平：BSA224s型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)公司；

冷凍離心機(jī)：AVANTI J-15R型，貝克曼庫爾特公司；

超聲波清洗器：SCQ型，上海聲彥超聲波儀器有限公司；

數(shù)顯型多管旋渦混合器：945066型，美國Talboys公司；

高速振蕩器：CM-1000型，東京理化器械株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別精密稱取1-甲基咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪唑、1-甲基咪唑-D6、2-甲基咪唑-D6、4-甲基咪唑-D6標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用前稀釋為1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別精密移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)使用液，加入同位素內(nèi)標(biāo)溶液，配制成標(biāo)準(zhǔn)線性系列溶液，質(zhì)量濃度為5.0～400.0 ng/mL，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為50.0 ng/mL。

1.3.2 樣品前處理 精密稱取混勻后的食用香精2 g于離心管中，加入1.0 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液0.25 mL和25 mL 5%三氯乙酸溶液，振搖20 min后，冷凍離心，精密量取5 mL上清液，過混合陽離子交換固相萃取小柱凈化，依次用5 mL水溶液、5 mL正己烷和5 mL甲醇溶液淋洗，用8 mL 5%氨水—甲醇洗脫，氮?dú)獯抵两桑芤迫? mL 5 mmol/L乙酸銨—乙腈(體積比10∶90)溶解，過膜，待測(cè)。

1.3.3 液相色譜條件及質(zhì)譜條件優(yōu)化 液相色譜條件為：A為乙酸銨溶液(5 mmol/L)，B為乙腈，流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積5 μL。梯度洗脫程序：0～4.5 min，10% A；4.5～4.6 min，10% A～40% A；4.6～5.9 min，40% A；5.9～6.0 min，40% A～10% A；6.0～8.0 min，10% A。在HESI離子源下，毛細(xì)管電壓3 500 V，霧化器溫度350 ℃，離子傳輸管溫度350 ℃，鞘氣4.58 L/min，輔助氣7.97 L/min，反吹氣1.5 L/min。通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)母離子掃描和子離子掃描，確定質(zhì)譜分析方法。

1.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證 在空白香精樣品中添加低濃度混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，再在確定的最優(yōu)前處理?xiàng)l件和儀器條件下測(cè)定，S/N≥3的濃度為檢出限，S/N≥10的濃度為定量限。在空白基質(zhì)樣品中加入3種甲基咪唑及內(nèi)標(biāo)，甲基咪唑含量為5.0，10.0，50.0 μg/kg(n=6)，按確定的前處理工藝和儀器方法測(cè)定，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

通過CAS號(hào)查詢3種甲基咪唑及內(nèi)標(biāo)物的分子量，通過母離子全掃描結(jié)果可知3種甲基咪唑及內(nèi)標(biāo)響應(yīng)度最高的是正離子模式。通過子離子掃描，獲得目標(biāo)化合物的最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)，甲基咪唑化合物依據(jù)響應(yīng)強(qiáng)度確定定量離子和定性離子，3種甲基咪唑化合物的質(zhì)譜檢測(cè)方法見表1。3種甲基咪唑分子量較小，經(jīng)質(zhì)譜電離后產(chǎn)生的碎裂離子數(shù)較少，碎片離子質(zhì)量小。選擇穩(wěn)定性較好、響應(yīng)度較強(qiáng)和碎片離子質(zhì)量較高的離子作為定量離子，可以提高檢測(cè)的穩(wěn)定性。

2.2 色譜條件優(yōu)化

3種甲基咪唑化合物是同分異構(gòu)體，分子量相同，裂解定量離子也相同，因此需優(yōu)化色譜條件來分離3種甲基咪唑化合物。首先采用C18系列色譜柱，研究發(fā)現(xiàn)增加色譜柱長(zhǎng)度對(duì)3種甲基咪唑出峰時(shí)間影響較小，出峰時(shí)間均在1 min左右，且3種甲基咪唑保留時(shí)間一致，再選用C8色譜柱，分離效果無改善。目標(biāo)化合物出峰時(shí)間較早，易與樣品基質(zhì)同時(shí)出峰，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。甲基咪唑化合物是含氮極性小分子化合物，C18或C8色譜柱對(duì)此類化合物保留能力弱，因此出峰時(shí)間早，不能有效分離3種化合物。因此選擇保留能力與C18相反的親水性色譜柱(HILIC)來分離3種甲基咪唑。研究選擇了Dikma Inspire HILIC(2.1 mm×100 mm，3 μm)、Ultimate UHPLC HILIC(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)和Waters ACQUITY UPLC BEH Amide HILIC(3.0 mm×150 mm，1.7 μm)在其最優(yōu)的色譜條件下分離3種甲基咪唑，結(jié)果表明Waters ACQUITY UPLC BEH Amide HILIC 色譜柱能有效分離3種甲基咪唑化合物，其他兩種色譜柱可將3種甲基咪唑化合物的保留時(shí)間延后，但不能將3種同分異構(gòu)體化合物有效分離，因此選擇Waters ACQUITY UPLC BEH Amide HILIC進(jìn)行檢測(cè)分析。此色譜柱填料為1.7 μm的BEH HILIC顆粒，具有高分離度、高柱效、高分析速度等特點(diǎn)，因此可以將3種同分異構(gòu)體化合物進(jìn)行分離，通過單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)樣分析，出峰的順序分別為1-甲基咪唑、4-甲基咪唑、2-甲基咪唑，3種甲基咪唑及其內(nèi)標(biāo)化合物定量離子色譜圖見圖1。

表1 甲基咪唑化合物的質(zhì)譜參數(shù)表?Table 1 Mass spectrum parameters of methylimidazole compounds

圖1 3種甲基咪唑化合物及其內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子色譜圖Figure 1 Quantitative ion chromatogram of three methylimidazole compounds and their internal standard mixed standard solutions

2.3 提取試劑的優(yōu)化

甲基咪唑化合物易溶于水，因此選用水系溶劑進(jìn)行提取。研究選擇水、2%甲酸水溶液、2%三氯乙酸水溶液進(jìn)行提取效果對(duì)比，結(jié)果見圖2。由圖2可知，3種提取試劑均能提取3種甲基咪唑化合物，當(dāng)用水提取時(shí)，甲基咪唑化合物回收率最低，2%三氯乙酸的提取回收率最高。在凈化過程中，水提取溶液過柱凈化速度最慢，2%三氯乙酸提取溶液最快。結(jié)合提取回收率和凈化效率，選擇三氯乙酸溶液作為提取試劑。復(fù)合食用香精中含有肽、氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪等，在提取甲基咪唑的前處理過程中，三氯乙酸可以有效沉淀蛋白質(zhì)，提高提取效率。研究進(jìn)一步比較了1%三氯乙酸溶液、2%三氯乙酸溶液、5%三氯乙酸溶液、10%三氯乙酸溶液的提取效果，見圖2。由圖2可知，隨三氯乙酸提取液體積分?jǐn)?shù)的升高，甲基咪唑化合物的回收率逐步升高，但當(dāng)三氯乙酸體積分?jǐn)?shù)≥5%時(shí)，甲基咪唑化合物的回收率變化較小。這是因?yàn)殡S三氯乙酸提取液體積分?jǐn)?shù)的升高，提取劑中三氯乙酸沉淀雜質(zhì)的能力越強(qiáng)，當(dāng)三氯乙酸體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，樣品已被處理澄清，達(dá)到最佳的凈化效果，過量的三氯乙酸溶液會(huì)增加后續(xù)淋洗次數(shù)。因此，選擇5%的三氯乙酸提取作為香精中甲基咪唑的提取液。

2.4 凈化固相萃取柱的優(yōu)化

在最優(yōu)提取工藝條件下，比較了強(qiáng)陽離子固相萃取柱(SCX)、混合陽離子固相萃取柱(PCX)、弱陽離子固相萃取柱(WCX)對(duì)3種甲基咪唑的凈化效果。不同固相萃取柱凈化回收率見圖3。結(jié)果表明，經(jīng)PCX柱凈化后，3種甲基咪唑化合物回收率最高，WCX固相萃取柱凈化回收率最低。PCX柱利用陽離子交換機(jī)理提供了離子交換與反相保留雙重保留模式，對(duì)堿性化合物具有高的選擇性，而WCX柱填充了混合型弱陽離子交換反相吸附劑，對(duì)強(qiáng)堿性的化合物具有高選擇性，適用的pH值范圍比較窄，SCX柱填料鍵合基團(tuán)通常為(苯)磺酸基，一般用于有機(jī)堿類化合物凈化。3種甲基咪唑?yàn)楹逶枷汶s環(huán)化合物，呈弱堿性，PCX柱對(duì)3種甲基咪唑進(jìn)行選擇性吸附，選擇不同極性淋洗液淋洗凈化，氨化甲醇洗脫回收目標(biāo)物，達(dá)到富集目標(biāo)化合物并消除雜質(zhì)，降低雜質(zhì)引起的基質(zhì)效應(yīng)。

圖2 不同提取劑對(duì)甲基咪唑回收率的影響Figure 2 Effects of different extractants on the recovery of methylimidazole

2.5 線性關(guān)系、檢出限和定量限

由表2可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0～400.0 ng/mL時(shí)，3種甲基咪唑化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.997，檢出限(LOD)為0.030～0.45 μg/kg，定量限(LOQ)為0.10～1.5 μg/kg，此方法對(duì)3種甲基咪唑的檢出限和定量限靈敏度高于GB 5009. 282—2020。3種甲基咪唑分子量相同，但分子結(jié)構(gòu)不同，在同一質(zhì)譜條件下響應(yīng)度有差異，因此檢出限和定量限也不同。

圖3 不同固相萃取柱對(duì)甲基咪唑回收率的影響Figure 3 Effects of different solid phase extraction columns on the recovery of methylimidazole

2.6 準(zhǔn)確度和精密度

由表3可知，當(dāng)甲基咪唑化合物加標(biāo)量為5.0 μg/kg時(shí)，回收率在82.8%～111.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.2%～6.6%；當(dāng)甲基咪唑化合物加標(biāo)量為10.0 μg/kg時(shí)，回收率在85.5%～105.2%，RSD為1.3%～9.3%；當(dāng)甲基咪唑化合物加標(biāo)量為50.0 μg/kg時(shí)，回收率在88.0%～107.4%，RSD為1.7%～9.1%。不同內(nèi)標(biāo)物加標(biāo)量條件下加標(biāo)回收率和精密度良好，符合GB/T 27404—2008中檢測(cè)方法確認(rèn)技術(shù)要求。結(jié)果表明檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠，滿足甲基咪唑檢測(cè)要求。

表2 甲基咪唑化合物的線性、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Standard linearity, correlation coefficient, LOD and LOQ of methylimidazole compounds

表3 甲基咪唑化合物的回收率和精密度Table 3 Recovery and precision of methylimidazole compounds %

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用所建立的方法對(duì)市售20種食用香精進(jìn)行檢測(cè)，由表4可知，樣品中有10份檢出上述3種甲基咪唑，檢出率為50%。樣品中1-甲基咪唑的含量在5.6～32.2 μg/kg，2-甲基咪唑的含量在5.2～160.2 μg/kg，雞肉粉、牛肉粉和豬骨粉的中2-甲基咪唑含量超過100 μg/kg。4-甲基咪唑的含量在5.1～178.9 μg/kg，牛肉粉和羊肉粉的4-甲基咪唑含量超過了150 μg/kg，其中羊肉粉中4-甲基咪唑含量最高，為178.9 μg/kg，但遠(yuǎn)低于焦糖中4-甲基咪唑的限量值200 mg/kg。食品中甲基咪唑大多來源于焦糖色素，但市售樣品中檢出甲基咪唑化合物的香精配料均屬肉類香精且均不含焦糖色素，說明肉類香精產(chǎn)品中甲基咪唑化合物來源不是焦糖色素而是肉類酶解物、還原糖和氨基酸發(fā)生復(fù)雜的美拉德反應(yīng)而產(chǎn)生的。因此通過控制美拉德反應(yīng)條件可以控制部分香精產(chǎn)品中甲基咪唑化合物的含量，使產(chǎn)品安全性可控。

表4 市售香精中3種甲基咪唑類化合物的含量?Table 4 Contents of 3 methymidazole compounds in food flavors sold in market μg/kg

3 結(jié)論

3種甲基咪唑?yàn)橥之悩?gòu)體，分子量小，此類化合物易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，因此采用水性柱分離，固相萃取柱吸附凈化。采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行定性分析，使用內(nèi)標(biāo)法定量，降低了基質(zhì)效應(yīng)影響，保證了檢驗(yàn)方法的可靠性和穩(wěn)定性。利用建立的方法驗(yàn)證了食用香精中甲基咪唑化合物檢測(cè)的適用性，結(jié)果顯示該方法定量限優(yōu)于國家標(biāo)準(zhǔn)。而且該方法快速、高效、靈敏度高，可應(yīng)用于食用香精中3種甲基咪唑的定量檢測(cè)。后續(xù)將對(duì)其他類型食品中甲基咪唑含量測(cè)定進(jìn)行方法適用性研究。