固相萃取—超高效液相色譜—質譜法測定食用香精中3種甲基咪唑類物質

周艷華 李 濤 向 俊 徐文泱

食品中常見的美拉德反應可產生賦予食品色、香、味的成分，同時也可能伴隨產生甲基咪唑類化合物[1-2]。甲基咪唑是一類五元雜環化合物，對動物有強烈驚闕作用，可誘發癲癇。目前，甲基咪唑化合物檢測主要有紫外分光光度法[3]、氣相色譜法[4]、液相色譜法[5]、質譜法[6-9]等。紫外分光光度法成本低，操作簡單，但靈敏度低，適用范圍小，且易出現假陽性結果。氣相色譜法定量準確，適用于易揮發、成分簡單樣品，但對于復雜樣品，易出現假陽性，重復性差。液相色譜法定量準確，但靈敏度不高，前處理需衍生化，操作步驟復雜。氣相質譜法易受雜質干擾，出現假陽性結果，不能滿足痕量測定需求。液質法選擇性強，靈敏度高，被廣泛應用于食品中痕量有毒有害物的檢測，是檢測甲基咪唑的最優方法。甲基咪唑分子量較小，質譜裂解可能會出現假陽性和基質效應，內標法是保障結果準確性的有效手段。

現有研究主要集中于含焦糖色素和添加焦糖色素的食品(如醬油[10]、耗油[11]、豆制品[12])中甲基咪唑的檢測，多采用GB 5009.282—2020方法，此法不適用于食用香精等食品添加劑檢測。研究擬使用三氯乙酸高效提取除雜，采用固相萃取法(SPE)和超高效液相色譜與質譜聯用法(UPLC-MS/MS)進行富集凈化和定性檢測，最后利用內標法進行定量分析，旨在建立一種快速檢測食用香精中甲基咪唑、2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的方法，為食品安全監管部門有效監控食用香精中3種甲基咪唑化合物的來源提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻辣香精、牛粉香精、雞肉膏等：市售;

乙腈、甲醇：色譜純，德國默克公司；

三氯乙酸、乙酸銨、氨水：優級純，上海國藥試劑有限公司；

1-甲基咪唑：純度>99%，上海安譜實驗科技股份有限公司；

2-甲基咪唑：純度>99%，北京壇墨質檢科技有限公司；

4-甲基咪唑：純度>98.5%，北京曼哈格生物科技有限公司；

1-甲基咪唑-D6、2-甲基咪唑-D6內標物：純度≥98%，天津阿爾塔科技有限公司；

4-甲基咪唑-D6內標物：純度>98%，加拿大CDN公司。

1.2 儀器與設備

質譜儀：TSQ Quantis型，美國賽默飛公司；

分析天平：BSA224s型，賽多利斯科學儀器(北京)公司；

冷凍離心機：AVANTI J-15R型，貝克曼庫爾特公司；

超聲波清洗器：SCQ型，上海聲彥超聲波儀器有限公司；

數顯型多管旋渦混合器：945066型，美國Talboys公司；

高速振蕩器：CM-1000型，東京理化器械株式會社。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制 分別精密稱取1-甲基咪唑、2-甲基咪唑、4-甲基咪唑、1-甲基咪唑-D6、2-甲基咪唑-D6、4-甲基咪唑-D6標準品，用乙腈溶解并配制成質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液，使用前稀釋為1.0 μg/mL的標準使用液。分別精密移取一定量的標準使用液，加入同位素內標溶液，配制成標準線性系列溶液，質量濃度為5.0～400.0 ng/mL，內標質量濃度為50.0 ng/mL。

1.3.2 樣品前處理 精密稱取混勻后的食用香精2 g于離心管中，加入1.0 μg/mL的混合內標溶液0.25 mL和25 mL 5%三氯乙酸溶液，振搖20 min后，冷凍離心，精密量取5 mL上清液，過混合陽離子交換固相萃取小柱凈化，依次用5 mL水溶液、5 mL正己烷和5 mL甲醇溶液淋洗，用8 mL 5%氨水—甲醇洗脫，氮氣吹至近干，精密移取1 mL 5 mmol/L乙酸銨—乙腈(體積比10∶90)溶解，過膜，待測。

1.3.3 液相色譜條件及質譜條件優化 液相色譜條件為：A為乙酸銨溶液(5 mmol/L)，B為乙腈，流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃，進樣體積5 μL。梯度洗脫程序：0～4.5 min，10% A；4.5～4.6 min，10% A～40% A；4.6～5.9 min，40% A；5.9～6.0 min，40% A～10% A；6.0～8.0 min，10% A。在HESI離子源下，毛細管電壓3 500 V，霧化器溫度350 ℃，離子傳輸管溫度350 ℃，鞘氣4.58 L/min，輔助氣7.97 L/min，反吹氣1.5 L/min。通過標準物質母離子掃描和子離子掃描，確定質譜分析方法。

1.3.4 方法學驗證 在空白香精樣品中添加低濃度混合標準物質，再在確定的最優前處理條件和儀器條件下測定，S/N≥3的濃度為檢出限，S/N≥10的濃度為定量限。在空白基質樣品中加入3種甲基咪唑及內標，甲基咪唑含量為5.0，10.0，50.0 μg/kg(n=6)，按確定的前處理工藝和儀器方法測定，計算回收率和相對標準偏差值。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

通過CAS號查詢3種甲基咪唑及內標物的分子量，通過母離子全掃描結果可知3種甲基咪唑及內標響應度最高的是正離子模式。通過子離子掃描，獲得目標化合物的最優質譜參數，甲基咪唑化合物依據響應強度確定定量離子和定性離子，3種甲基咪唑化合物的質譜檢測方法見表1。3種甲基咪唑分子量較小，經質譜電離后產生的碎裂離子數較少，碎片離子質量小。選擇穩定性較好、響應度較強和碎片離子質量較高的離子作為定量離子，可以提高檢測的穩定性。

2.2 色譜條件優化

3種甲基咪唑化合物是同分異構體，分子量相同，裂解定量離子也相同，因此需優化色譜條件來分離3種甲基咪唑化合物。首先采用C18系列色譜柱，研究發現增加色譜柱長度對3種甲基咪唑出峰時間影響較小，出峰時間均在1 min左右，且3種甲基咪唑保留時間一致，再選用C8色譜柱，分離效果無改善。目標化合物出峰時間較早，易與樣品基質同時出峰，影響分析結果的準確性。甲基咪唑化合物是含氮極性小分子化合物，C18或C8色譜柱對此類化合物保留能力弱，因此出峰時間早，不能有效分離3種化合物。因此選擇保留能力與C18相反的親水性色譜柱(HILIC)來分離3種甲基咪唑。研究選擇了Dikma Inspire HILIC(2.1 mm×100 mm，3 μm)、Ultimate UHPLC HILIC(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)和Waters ACQUITY UPLC BEH Amide HILIC(3.0 mm×150 mm，1.7 μm)在其最優的色譜條件下分離3種甲基咪唑，結果表明Waters ACQUITY UPLC BEH Amide HILIC 色譜柱能有效分離3種甲基咪唑化合物，其他兩種色譜柱可將3種甲基咪唑化合物的保留時間延后，但不能將3種同分異構體化合物有效分離，因此選擇Waters ACQUITY UPLC BEH Amide HILIC進行檢測分析。此色譜柱填料為1.7 μm的BEH HILIC顆粒，具有高分離度、高柱效、高分析速度等特點，因此可以將3種同分異構體化合物進行分離，通過單一標準物質進樣分析，出峰的順序分別為1-甲基咪唑、4-甲基咪唑、2-甲基咪唑，3種甲基咪唑及其內標化合物定量離子色譜圖見圖1。

表1 甲基咪唑化合物的質譜參數表?Table 1 Mass spectrum parameters of methylimidazole compounds

圖1 3種甲基咪唑化合物及其內標混合標準溶液定量離子色譜圖Figure 1 Quantitative ion chromatogram of three methylimidazole compounds and their internal standard mixed standard solutions

2.3 提取試劑的優化

甲基咪唑化合物易溶于水，因此選用水系溶劑進行提取。研究選擇水、2%甲酸水溶液、2%三氯乙酸水溶液進行提取效果對比，結果見圖2。由圖2可知，3種提取試劑均能提取3種甲基咪唑化合物，當用水提取時，甲基咪唑化合物回收率最低，2%三氯乙酸的提取回收率最高。在凈化過程中，水提取溶液過柱凈化速度最慢，2%三氯乙酸提取溶液最快。結合提取回收率和凈化效率，選擇三氯乙酸溶液作為提取試劑。復合食用香精中含有肽、氨基酸、蛋白質、脂肪等，在提取甲基咪唑的前處理過程中，三氯乙酸可以有效沉淀蛋白質，提高提取效率。研究進一步比較了1%三氯乙酸溶液、2%三氯乙酸溶液、5%三氯乙酸溶液、10%三氯乙酸溶液的提取效果，見圖2。由圖2可知，隨三氯乙酸提取液體積分數的升高，甲基咪唑化合物的回收率逐步升高，但當三氯乙酸體積分數≥5%時，甲基咪唑化合物的回收率變化較小。這是因為隨三氯乙酸提取液體積分數的升高，提取劑中三氯乙酸沉淀雜質的能力越強，當三氯乙酸體積分數為5%時，樣品已被處理澄清，達到最佳的凈化效果，過量的三氯乙酸溶液會增加后續淋洗次數。因此，選擇5%的三氯乙酸提取作為香精中甲基咪唑的提取液。

2.4 凈化固相萃取柱的優化

在最優提取工藝條件下，比較了強陽離子固相萃取柱(SCX)、混合陽離子固相萃取柱(PCX)、弱陽離子固相萃取柱(WCX)對3種甲基咪唑的凈化效果。不同固相萃取柱凈化回收率見圖3。結果表明，經PCX柱凈化后，3種甲基咪唑化合物回收率最高，WCX固相萃取柱凈化回收率最低。PCX柱利用陽離子交換機理提供了離子交換與反相保留雙重保留模式，對堿性化合物具有高的選擇性，而WCX柱填充了混合型弱陽離子交換反相吸附劑，對強堿性的化合物具有高選擇性，適用的pH值范圍比較窄，SCX柱填料鍵合基團通常為(苯)磺酸基，一般用于有機堿類化合物凈化。3種甲基咪唑為含氮五元芳香雜環化合物，呈弱堿性，PCX柱對3種甲基咪唑進行選擇性吸附，選擇不同極性淋洗液淋洗凈化，氨化甲醇洗脫回收目標物，達到富集目標化合物并消除雜質，降低雜質引起的基質效應。

圖2 不同提取劑對甲基咪唑回收率的影響Figure 2 Effects of different extractants on the recovery of methylimidazole

2.5 線性關系、檢出限和定量限

由表2可知，當質量濃度為5.0～400.0 ng/mL時，3種甲基咪唑化合物的線性關系良好，相關系數R2≥0.997，檢出限(LOD)為0.030～0.45 μg/kg，定量限(LOQ)為0.10～1.5 μg/kg，此方法對3種甲基咪唑的檢出限和定量限靈敏度高于GB 5009. 282—2020。3種甲基咪唑分子量相同，但分子結構不同，在同一質譜條件下響應度有差異，因此檢出限和定量限也不同。

圖3 不同固相萃取柱對甲基咪唑回收率的影響Figure 3 Effects of different solid phase extraction columns on the recovery of methylimidazole

2.6 準確度和精密度

由表3可知，當甲基咪唑化合物加標量為5.0 μg/kg時，回收率在82.8%～111.7%，相對標準偏差RSD為1.2%～6.6%；當甲基咪唑化合物加標量為10.0 μg/kg時，回收率在85.5%～105.2%，RSD為1.3%～9.3%；當甲基咪唑化合物加標量為50.0 μg/kg時，回收率在88.0%～107.4%，RSD為1.7%～9.1%。不同內標物加標量條件下加標回收率和精密度良好，符合GB/T 27404—2008中檢測方法確認技術要求。結果表明檢驗方法準確可靠，滿足甲基咪唑檢測要求。

表2 甲基咪唑化合物的線性、相關系數、檢出限和定量限Table 2 Standard linearity, correlation coefficient, LOD and LOQ of methylimidazole compounds

表3 甲基咪唑化合物的回收率和精密度Table 3 Recovery and precision of methylimidazole compounds %

2.7 實際樣品檢測

采用所建立的方法對市售20種食用香精進行檢測，由表4可知，樣品中有10份檢出上述3種甲基咪唑，檢出率為50%。樣品中1-甲基咪唑的含量在5.6～32.2 μg/kg，2-甲基咪唑的含量在5.2～160.2 μg/kg，雞肉粉、牛肉粉和豬骨粉的中2-甲基咪唑含量超過100 μg/kg。4-甲基咪唑的含量在5.1～178.9 μg/kg，牛肉粉和羊肉粉的4-甲基咪唑含量超過了150 μg/kg，其中羊肉粉中4-甲基咪唑含量最高，為178.9 μg/kg，但遠低于焦糖中4-甲基咪唑的限量值200 mg/kg。食品中甲基咪唑大多來源于焦糖色素，但市售樣品中檢出甲基咪唑化合物的香精配料均屬肉類香精且均不含焦糖色素，說明肉類香精產品中甲基咪唑化合物來源不是焦糖色素而是肉類酶解物、還原糖和氨基酸發生復雜的美拉德反應而產生的。因此通過控制美拉德反應條件可以控制部分香精產品中甲基咪唑化合物的含量，使產品安全性可控。

表4 市售香精中3種甲基咪唑類化合物的含量?Table 4 Contents of 3 methymidazole compounds in food flavors sold in market μg/kg

3 結論

3種甲基咪唑為同分異構體，分子量小，此類化合物易產生基質效應，因此采用水性柱分離，固相萃取柱吸附凈化。采用液相色譜與質譜聯用法進行定性分析，使用內標法定量，降低了基質效應影響，保證了檢驗方法的可靠性和穩定性。利用建立的方法驗證了食用香精中甲基咪唑化合物檢測的適用性，結果顯示該方法定量限優于國家標準。而且該方法快速、高效、靈敏度高，可應用于食用香精中3種甲基咪唑的定量檢測。后續將對其他類型食品中甲基咪唑含量測定進行方法適用性研究。