血清細胞色素C可作為慢性阻塞性肺疾病細胞損傷凋亡的生物標志物

張佑揚 朱述陽 朱潔晨 施斌 王小雨

慢性阻塞性肺疾病(COPD)屬于一種氣道慢性炎癥性氣流受限性疾病。其患病率、發病率及死亡率逐年上升，造成了巨大的經濟及社會負擔[1]。研究發現肺組織細胞過度凋亡在COPD的發生發展中起著重要的作用[2]。細胞色素C(Cytc)是細胞凋亡事件中的關鍵物質。正常情況下，Cytc在線粒體內介導呼吸鏈的電子轉移，而當細胞發生損傷時，Cytc可大量進入細胞質，引起細胞凋亡[3]。同時，Cytc可作為一種線粒體損傷相關分子模式(mtDAMPs)引起機體炎癥反應，導致機體病變[4-6]。外周血Cytc水平可作為反映機體病理嚴重程度的臨床生物標志物。但Cytc與COPD之間的關系尚不明確，因此本研究旨在分析COPD患者血清Cytc水平的變化，探討其在COPD診療中的意義，為臨床決策提供一定的依據。

資料與方法

一、一般資料

選取2021年6月至2022年2月就診于南京鼓樓醫院集團宿遷醫院門診的穩定期COPD患者(sCOPD組)36例，同期因急性加重而住院的COPD患者(AECOPD組)39例，選擇同時期健康體檢人員(NORMAL組)28例為對照組。三組患者基本資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性(見表1)。本研究取得了所有入組研究對象的知情同意，已獲得南京鼓樓醫院集團宿遷醫院倫理委員會的批準(2021020)。

1 sCOPD組及AECOPD組納入標準：①年齡40～80歲；②既往有吸煙史，戒煙半年以上；③符合2021中華醫學會《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2021年修訂版)》[7]的診斷標準。④sCOPD組入組前4周內無病情惡化的表現。NORMAL組納入標準：①年齡40～80歲；②既往吸煙史，戒煙半年以上；③不服用任何藥物，無其他器官及系統疾病。

2 排除標準：①存在其他肺部疾病，如支氣管擴張、肺癌、肺結核、肺纖維化、肺炎、塵肺病等；②合并其他系統疾病，如類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡等結締組織病，糖尿病，炎性腸病，腫瘤，心力衰竭、冠心病、心臟瓣膜病等心臟疾病，腎功能不全；③長期服用藥物，如糖皮質激素。

二、血液指標測定

采集三組受試者清晨空腹肘靜脈血3～5 mL，經3000轉離心10 min，取上層血清保存于-80℃冰箱待檢。采用ELISA法測定血清Cytc，試劑盒購買于上海富雨生物科技有限公司，嚴格遵循試劑盒說明書的操作步驟進行檢測。CRP采用beckman coulter AU5800生化儀測定。在呼吸空氣條件下，采集受試者橈動脈血1 mL，采用動脈血氣分析儀(德國羅氏診斷公司，cobas b 123 POC系統，軟件版本4.16)檢測PaO2。采集受試者肘靜脈血2～3 mL，采用sysmex xn-2000血細胞分析儀檢測NEUT。

三、肺功能測定

由取得資質的醫務人員使用Masterscope肺功能儀(德國耶格公司)測定三組患者的FEV1/FVC以及FEV1%pred。

四、統計學方法

結 果

一、三組間一般資料的比較

三組間性別構成、年齡、BMI、吸煙指數、病程相比無顯著差異(P>0.05)(見表1)。

表1 各組患者一般臨床資料比較

二、三組間血清Cytc水平比較

AECOPD組高于sCOPD組，sCOPD組高于NORMAL組(P<0.05)(見表2)。

三、三組間NEUT、CRP、FEV1%pred、PaO2水平比較

NEUT、CRP水平比較，AECOPD組高于sCOPD組，sCOPD組高于NORMAL組(P<0.05)。FEV1%pred、PaO2水平比較，AECOPD組低于sCOPD組，sCOPD組低于NORMAL組(P<0.05)(見表2)。

四、AECOPD組中及sCOPD組中FEV1%pred≥50%和FEV1%pred<50%的患者血清Cytc水平比較

兩組中，FEV1%pred<50%的患者血清Cytc水平均高于FEV1%pred≥50%的患者血清Cytc水平(P<0.05)(見表3)。

表3 根據FEV1%pred分組對血清Cytc水平比較

五、sCOPD組及AECOPD組中血清Cytc分別與NEUT、CRP、FEV1pred%、PaO2相關性的分析

兩組中，血清Cytc水平與NEUT、CRP水平均呈正相關(P<0.05)，與FEV1%pred、PaO2水平均呈負相關(P<0.05)(見圖1～8)。

圖1 AECOPD組：Cytc(nmol/L)與 CRP(mg/L)水平呈正相關(r=0.849，P<0.001)

圖2 AECOPD組：Cytc(nmol/L)與 NEUT(×109/L)水平呈正相關(r=0.781，P<0.001)

圖3 AECOPD組：Cytc(nmol/L)與 FEV1%pred(%)水平呈負相關(r=-0.819，P<0.001)

圖4 AECOPD組：Cytc(nmol/L)與 PaO2(mmhg)水平呈負相關(r=-0.726，P<0.001)

圖5 sCOPD組：Cytc(nmol/L)與 CRP(mg/L)水平呈正相關(r=0.771，P<0.001)

圖6 sCOPD組：Cytc(nmol/L)與 NEUT(×109/L)水平呈正相關(r=0.806，P<0.001)

圖7 sCOPD組：Cytc(nmol/L)與 FEV1%pred(%)水平呈負相關(r=-0.748，P<0.001)

圖8 sCOPD組：Cytc(nmol/L)與 PaO2(mmhg)水平呈負相關(r=-0.559，P<0.001)

討 論

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見的、可防可治的氣道慢性炎癥疾病，表現為持續存在的呼吸道癥狀和氣流受限[1]，嚴重影響了患者的身體健康和生活質量。COPD在我國高度流行，40歲以上成人患病率在10年間增長了約67%[7]，我國的COPD防治形勢嚴峻。AECOPD是COPD的急性加重狀態，可導致穩定期COPD患者肺功能下降、病情進展，極大的增加了患者的醫療支出，是導致COPD患者死亡的重要原因[8]。因此早發現、早診斷、早治療及合理用藥顯得尤為重要。然而，目前尚無客觀有效的生物學指標診斷COPD，以及評估病情狀態。

COPD發病機制復雜，其中，細胞過度凋亡是其發生發展的重要機制[2]。COPD患者機體氧化應激增強、炎細胞活化并增多、炎癥因子和趨化因子增加以及蛋白酶和抗蛋白酶失衡[9]，這些因素相互促進、共同作用，引起肺組織細胞損傷及凋亡增加、肺結構損害，最終引起肺功能異常[10]。Cytc在細胞凋亡途徑中發揮著重要的作用。人Cytc是由104個殘基組成的單鏈大分，由三個大的和兩個小的α螺旋組成[11]。正常情況下在線粒體內外膜之間參與呼吸鏈電子轉移，但當細胞受損時，Cytc從線粒體大量釋放進入細胞質，通過激活下游的凋亡因子而引起細胞凋亡[3]。外周血Cytc水平是判斷細胞損傷凋亡情況、評估病情嚴重程度及判斷預后的重要指標。Cosentino N.等[12]研究發現，在行經皮冠狀動脈介入治療(PCI)術前，可檢測到血清Cytc的ST 段抬高型心肌梗死(STEMI)患者的心功能更嚴重，預后更差，檢測血清Cytc有助于早期識別高危患者，指導早期的治療。李寧[13]等研究提示，血清Cytc水平在膿毒血癥患者中顯著升高，可作為評價膿毒血癥患者感染程度、病情嚴重性及治療效果的重要指標。在造影劑腎病(CIN)方面，Tang C.等[14]研究發現，外周血高水平的Cytc與CIN發生風險增加顯著相關，是CIN發生的獨立危險因素，可作為STEMI患者PCI術前預測 CIN 的標志物。本研究發現，AECOPD組及sCOPD組血清Cytc水平高于NORMAL組，AECOPD組高于sCOPD組，提示COPD患者肺組織細胞損傷凋亡增加，AECOPD患者更顯著，表明血清Cytc水平可作為判斷COPD患者病情活動性的生物學指標。

FEV1是反映小氣道氣流受限的一個重要參數，而FEV1%pred是COPD氣流受限嚴重程度的分級依據[1]，FEV1%pred越低，病情越重，預后越差。高云等[15]研究發現，隨著FEV1%pred逐漸降低，AECOPD患者體內炎癥及氧化應激水平逐漸增高，且呈正相關。錢建德等[16]研究顯示肺功能越差的COPD患者機體免疫力越低。何國慶等[17]發現，存活組的AECOPD患者入院時FEV1%pred水平明顯高于死亡組，且與患者預后呈正相關。PaO2隨著COPD患者病情加重而降低，與病情的嚴重程度相關[18]。王述紅等[19]研究表明，FEV1%pred越低的COPD患者，PaO2亦越低，CAT評分越高，AECOPD組中PaO2低于穩定期COPD組，而CAT評分高于穩定組，PaO2與CAT評分呈負相關。與上述研究一致，本研究中AECOPD組及sCOPD組FEV1%pred、PaO2水平低于NORMAL組，AECOPD組低于sCOPD組。并且在AECOPD組中及sCOPD組中，FEV1%pred<50%組的血清Cytc水平均高于FEV1%pred≥50%組。進一步分析發現，AECOPD組及sCOPD組血清Cytc水平與FEV1%pred、PaO2成負相關。說明肺功能越差、缺氧越嚴重的COPD患者，其外周血Cytc水平越高，肺組織細胞損害凋亡越嚴重，血清Cytc水平可作為反映COPD患者病情嚴重程度的標志物。

CRP是由肝臟合成的一種急性期蛋白，在大多數感染、炎癥、腫瘤或組織損傷等情況下都會升高，當CRP與細菌或損傷的細胞結合時可引起機體的炎癥防御反應[20]。Fermont J.M.等[21]進行一項薈萃分析表明，在至少 6 個月的隨訪期間，高基線水平的CRP與穩定期 COPD 患者過早死亡、病情惡化的發生風險及相關住院風險增高有關。而李小龍[22]研究發現，CRP在AECOPD患者中顯著升高，且呼吸衰竭組高于非呼吸衰竭組，可作為反映AECOPD患者病情嚴重程度的指標。中性粒細胞炎癥是COPD的重要特征，持續存在的中性粒細胞性炎癥可引起肺組織損傷從而促進COPD的發展，而在急性加重期中性粒細胞炎癥反應增強，進一步加劇了肺組織的損害[23]。本研究結果顯示，AECOPD組及sCOPD組CRP、NEUT水平高于NORMAL組，AECOPD組高于sCOPD組，并且血清Cytc水平與CRP、NEUT水平成正相關。表明COPD患者體內炎癥水平高，在急性加重期時更明顯，Cytc可作為反映COPD患者機體炎癥水平的指標，可能參與了COPD的進程。推測可能的機制為：在COPD發病機制的作用下，肺組織細胞發生線粒體損傷、過度凋亡，因吞噬細胞吞噬功能缺陷[24]，導致大量損傷凋亡的細胞不能被及時清除，過多的Cytc釋放到細胞外，作為一種mtDAMPs激活中性粒細胞[4]，引起肺組織炎癥反應，從而導致肺組織損傷、肺功能障礙。

本研究的不足之處在于樣本量偏少，可能存在一定的偏倚。并且未對住院期間AECOPD患者血清Cytc水平進行動態監測，來進一步分析血清Cytc水平與病情變化之間的關系。未對AECOPD的預測價值進行分析。納入的對象無危重癥患者，其對COPD患者的預后價值有待進一步研究。

總之，細胞過度凋亡在COPD的發生發展中起著重要的作用。血清Cytc水平不僅可反映COPD患者肺組織細胞損傷及凋亡狀況，也反映了COPD患者機體的炎癥水平，有助于對COPD患者疾病活動狀態、病情嚴重程度的判斷，從而為臨床的決策提供一定的參考價值。并且未來通過對COPD患者肺組織細胞凋亡機制的進一步研究，為COPD患者的治療開辟一條新路徑。