布地奈德通過下調miR-620抑制PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞增殖和炎性因子表達

符艷 趙四林 王偉 肖雪飛

哮喘是一種以氣道反應過度、支氣管炎癥和氣道重塑為特征的炎癥綜合癥，嚴重危害人類的生命健康。氣道平滑肌細胞(ASMC)增殖，是導致氣道結構改變的病理學基礎，在氣道重塑的發生發展中起重要作用[1]。血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子等生長因子，是促進ASMC增殖的主要炎癥介質[2]，抑制或減少這些生長因子誘導的ASMC增殖，對控制氣道重塑的發生及哮喘治療尤為重要，也是當前哮喘研究的熱點。布地奈德(budesonide，Bud)是一種糖皮質激素，具有顯著局部抗炎作用，其可抑制人體抗原合成，減少炎性因子生成[3]。研究顯示，布地奈德可改善支氣管哮喘患者肺功能，縮短臨床癥狀轉歸時間，提高哮喘患者治療療效[4]。但目前，布地奈德治療哮喘的分子機制尚未明確。微小RNA(miRNA)是一類參與調控細胞增殖、凋亡、炎癥反應及氧化應激等生理或病理過程的小分子非編碼RNA，在哮喘等炎癥性疾病的發生發展中起重要調控作用[5-6]。有報道稱，下調miR-620可抑制轉化生長因子β1(TGF-β1)誘導的氣道平滑肌細胞增殖[7]，提示miR-620可能是改善氣道重塑、治療哮喘的分子靶點。因此，本研究以小鼠ASMC為研究對象，旨在觀察布地奈德對血小板衍生生長因子(PDGF)誘導的小鼠ASMC增殖和炎性因子表達的影響及其能否調控miR-620發揮作用。

材料與方法

一、 細胞和試劑

小鼠ASMC，上海澤葉生物科技有限公司；布地奈德(Bud)，遼寧玉皇藥業有限公司；PDGF，武漢優爾生公司；RPMI 1640培養基、細胞計數試劑盒-8(CCK-8)和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒，北京索萊寶公司；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技公司；LipofectamineTM 2000試劑盒和Trizol試劑，美國Invitrogen公司；miR-620模擬物(mimics)、模擬對照序列(miR-mimics-NC)、miR-620抑制劑(inhibitor)、抑制劑陰性對照序列(miR-inhibitor-NC)和PCR引物，上海生工生物工程有限公司；IL-4、IL-5和IL-13試劑盒，南京建成生物工程研究所；兔抗細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21和β-肌動蛋白(β-actin)，美國Santa Cruz公司；逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

二、 方法

1 細胞培養和轉染 復蘇ASMC，用含10 % FBS的RPMI 1640培養基(常規培養基)培養。將對數生長期的ASMC以5.0×105個/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM 2000脂質體法，分別轉染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC、miR-620 mimics、miR-mimics-NC。轉染6 h后，更換培養基。再培養24 h，收集細胞備用。

2 細胞分組處理 未轉染的ASMC分為Control組、PDGF組、PDGF+Bud-200組、PDGF+Bud-400組、PDGF+Bud-600組，Control組細胞用常規培養基培養，PDGF組細胞用含20 ng/mL[1]PDGF的培養基培養，PDGF+Bud-200組、PDGF+Bud-400組、PDGF+Bud-600組細胞分別用含200、400、600 μg/mL Bud與20 ng/mL PDGF的培養基共同培養。轉染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC的細胞用常規培養基培養，記為PDGF+miR-620 inhibitor組、PDGF+miR-inhibitor-NC組。轉染miR-620 mimics、miR-mimics-NC的細胞用含600 μg/mL Bud與20 ng/mL PDGF的培養基共同培養，記為PDGF+Bud-600+miR-620 mimics組、PDGF+Bud-600+miR-mimics-NC組。

3 CCK-8法檢測細胞增殖 將未轉染的ASMC、轉染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC、miR-620 mimics、miR-mimics-NC的ASMC均以1.0×104個/孔接種于96孔板中，按照1.2.2分組處理，培養24 h后，加10 μL CCK-8試劑。孵育2 h后，酶標儀450 nm檢測各孔光密度(OD)值。

4 Western Blot法檢測細胞中CyclinD1、P21蛋白表達 將未轉染的ASMC、轉染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC、miR-620 mimics、miR-mimics-NC的ASMC均以5.0×104個/孔接種于6孔板中，按照1.2.2分組處理，培養24 h后，RIPA試劑提取細胞中總蛋白。BCA法檢測蛋白含量后，以20 μg/孔蛋白行SDS-PAGE電泳。電泳后，將分離蛋白轉至PVDF膜，并于5 %脫脂奶粉溶液中封閉1 h。然后分別于CyclinD1、(1 ∶500)、P21(1 ∶500)和β-actin(1 ∶1000)一抗孵育液中4℃過夜。再于山羊抗兔二抗(1 ∶3000)孵育液中37℃孵育1 h。最后加顯影液避光顯影，曝光拍照。

5 試劑盒法檢測細胞中IL-4、IL-5和IL-13表達 將未轉染的ASMC、轉染miR-620 inhibitor、miR-inhibitor-NC、miR-620 mimics、miR-mimics-NC的ASMC均以5.0×104個/孔接種于6孔板中，按照1.2.2分組處理，培養24 h后，收集各組細胞培養上清液，3500 r/min離心5 min，保留上清。分別參照IL-4、IL-5和IL-13試劑盒說明書，檢測上清中其含量。

6 RT-qPCR檢測細胞中miR-620表達 細胞接種及處理情況同1.2.4。Trizol試劑提取各組細胞中總RNA，逆轉錄為cDNA后，行PCR擴增。引物序列：miR-620上游5′-GCCGAGATGGAGATAGATAT-3′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGG-3′；內參U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。2-△△Ct法計算miR-620相對于內參U6的表達水平。

三、 統計學分析

結 果

一、 布地奈德對PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞增殖的影響

與Control組比較，PDGF組細胞OD值升高(P<0.05)，細胞中CyclinD1蛋白表達升高(P<0.05)，而P21蛋白表達降低(P<0.05)。與PDGF組比較，PDGF+Bud-200組、PDGF+Bud-400組、PDGF+Bud-600組細胞OD值降低(P<0.05)，細胞中CyclinD1蛋白表達降低(P<0.05)，而P21蛋白表達升高(P<0.05)(見表1，圖1)。

表1 布地奈德對PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞增殖的影響

圖1 布地奈德對PDGF誘導的氣道平滑肌細胞CyclinD1和P21蛋白表達的影響

二、 布地奈德對PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞炎癥因子的影響

與Control組比較，PDGF組IL-4、IL-5和IL-13水平升高(P<0.05)。與PDGF組比較，PDGF+Bud-200組、PDGF+Bud-400組、PDGF+Bud-600組IL-4、IL-5和IL-13水平降低(P<0.05)(見表2)。

表2 布地奈德對PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞炎癥因子的影響

三、 布地奈德對PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞中miR-620表達的影響

與Control組比較，PDGF組miR-620水平升高(P<0.05)。與PDGF組比較，PDGF+Bud-200組、PDGF+Bud-400組、PDGF+Bud-600組miR-620水平降低(P<0.05)(見表3)。

表3 布地奈德對PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞中miR-620的影響

四、 沉默miR-620對布地奈德對PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞增殖和炎癥因子的影響

與PDGF+miR-inhibitor-NC組比較，PDGF+miR-620 inhibitor組miR-620水平降低(P<0.05)，細胞OD值降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白水平降低(P<0.05)，而P21蛋白水平升高(P<0.05)，IL-4、IL-5和IL-13水平降低(P<0.05)(見表4，圖2)。

圖2 沉默miR-620對PDGF誘導的氣道平滑肌細胞CyclinD1和P21蛋白表達的影響

五、 過表達miR-620逆轉布地奈德對PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞增殖和炎癥因子的影響

與PDGF+Bud-600+miR-mimics-NC組比較，PDGF+Bud-600+miR-620 mimics組miR-620水平升高(P<0.05)，細胞OD值升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白水平升高(P<0.05)，而P21蛋白水平降低(P<0.05)，IL-4、IL-5和IL-13水平升高(P<0.05)(見表5，圖3)。

圖3 過表達miR-620逆轉布地奈德對PDGF誘導的氣道平滑肌細胞CyclinD1和P21蛋白表達的影響

討 論

氣道重塑是指哮喘時氣道壁結構發生一系列改變，包括氣道壁增厚、氣道纖維化、平滑肌細胞增生和肥大等，與哮喘患者預后密切相關[8]。氣道平滑肌細胞是氣道壁結構的主要組成細胞，也是參與氣道重塑的關鍵效應細胞，其過度增殖除了加重氣道高反應性之外，還可導致氣道壁變性，引起不可逆的氣道損傷[9]。因此，抑制氣道平滑肌細胞增殖對防治哮喘具有積極意義。PDGF是重要的促有絲分裂原，可促進氣道平滑肌細胞增殖，引起氣道平滑肌細胞表型改變，促進氣道重塑的發生[10]。本研究顯示，PDGF促進了小鼠氣道平滑肌細胞的增殖及炎性因子IL-4、IL-5和IL-13的表達，與相關報道結果一致[11]。

布地奈德具有治療哮喘的功效。研究顯示，布地奈德可協同骨化三醇抑制哮喘小鼠氣道重塑[12]；細辛腦聯合布地奈德可顯著減少炎癥因子骨橋蛋白和血管內皮生長因子的產生，減弱哮喘小鼠氣道炎癥損傷和氣道重塑程度[13]。本研究將一定劑量的布地奈德作用于PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞，結果顯示，細胞增殖能力降低，說明布地奈德抑制了PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞增殖。細胞增殖受多種基因分子的調控，其中CyclinD1是細胞周期調控分子，其可激活細胞周期蛋白依賴性激酶CDK4，誘導細胞周期由G1期進入S期，加速細胞增殖[14]，而P21則減弱細胞周期蛋白依賴性激酶的活性，抑制細胞的增殖能力[15]。本研究顯示，一定劑量的布地奈德可降低PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞中CyclinD1蛋白表達，而促進P21蛋白表達，進一步說明布地奈德抑制了PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞增殖，其作用可治療哮喘氣道重塑。IL-4、IL-5和IL-13是重要的炎性介質，在支氣管哮喘的發病中起重要作用。本研究顯示，布地奈德可抑制PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞表達IL-4、IL-5和IL-13炎性因子，提示布地奈德可降低哮喘氣道炎癥反應。

研究已表明，多種miRNA參與調控哮喘氣道平滑肌細胞增殖和炎癥反應，可作為哮喘氣道重塑的分子治療靶點。miR-326可通過抑制TNFSF14降低TGF-β1誘導的ASMC的基質蛋白沉積和細胞增殖[16]；上調miR-204-5p通過負調節Six1抑制TGF-β1誘導的氣道平滑肌細胞增殖和細胞外基質生成，是哮喘氣道重塑的潛在治療靶點[17]。本研究顯示，沉默miR-620抑制了PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞增殖及炎性因子IL-4、IL-5和IL-13的表達，與Chen等[7]報道的下調miR-620抑制了轉化生長因子β1(TGF-β1)誘導的氣道平滑肌細胞增殖的結果一致，提示miR-620是可能用作哮喘氣道重塑的分子靶點。本研究還顯示，布地奈德可抑制PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞表達miR-620，而過表達miR-620逆轉了布地奈德對PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞增殖及IL-4、IL-5和IL-13的表達，提示布地奈德可能通過下調miR-620來抑制PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞增殖及炎性因子表達。

綜上，布地奈德可抑制PDGF誘導的小鼠氣道平滑肌細胞增殖及炎性細胞因子表達，其作用機制可能與下調miR-620表達有關。