恒溫擴增熒光檢測法檢測結核分枝桿菌復合群的應用價值

李靜 吳哲淵 楊景卉 楊麗媛 王莉莉 袁鋒 沈鑫 江淵

如何在新型冠狀病毒肺炎大流行的背景下做好結核病防控工作，世界衛生組織(World Health Organization, WHO)提出了一系列的建議[1]，其中包括如何提高實驗室病原學陽性率和快速檢測能力。傳統的痰涂片鏡檢法檢測敏感度較低，培養法雖然敏感度較高但其檢測時間長且需要進一步鑒定區分結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)和非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)，兩種方法均無法滿足臨床早期發現和診斷結核病的需求。近年來，越來越多的以核酸擴增為基礎診斷結核病的檢測技術被WHO推薦[2]。恒溫擴增熒光檢測法是一種新型的核酸恒溫擴增技術，不依賴溫度循環變化，只需恒定溫度就能擴增反應。其操作簡便，耗時短，可直接檢測臨床樣本中的MTBC。本研究選擇上海市6家結核病定點醫院為研究現場，收集疑似肺結核患者痰樣本進行恒溫擴增熒光檢測法與傳統的痰涂片、BACTEC MGIT 960 液體培養(簡稱“液體培養”)及GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)檢測。以液體培養為參照標準，比較恒溫擴增熒光檢測法與痰涂片及GeneXpert的檢測效能，評價恒溫擴增熒光檢測法檢測痰樣本中MTBC的臨床應用價值。

對象和方法

一、研究對象

選擇上海市6家結核病定點醫院(上海市肺科醫院、上海市松江區中心醫院、上海市閔行區中心醫院、上海市普陀區中心醫院、上海市嘉定區中心醫院、中國人民解放軍905醫院)作為研究現場，連續納入2020年1月至2020年11月各家醫院肺科門診初診的疑似肺結核患者。共納入和收集2014例疑似肺結核患者痰樣本，對收集到的痰樣本進行痰涂片、液體培養、恒溫擴增熒光檢測法和GeneXpert四種方法檢測。去除59例重復樣本、43例無明確臨床診斷者、64例培養污染等無效結果，最終1848例患者納入研究。本研究通過上海市疾病預防控制中心倫理委員會審核批準(倫理號：2020-12 快速高通量分子診斷技術在上海示范區的驗證推廣研究)。

二、納入和排除標準

1.納入標準：(1)按照《WS 288—2017 肺結核診斷》[3]及《中國結核病防治規劃實施工作指南(2008年版)》[4]中規定的咳嗽、咳痰≥2周，或痰中帶血或咯血等的肺結核疑似癥狀者；(2)同意留取痰標本進行檢測，且留取的痰標本量不少于3.0 ml者。

2.排除標準：(1)不同意參加本研究項目者；(2)未同時進行4種方法檢測者；(3)檢測期間，任一方法未獲得有效檢測結果者。

三、儀器與試劑

BACTEC MGIT 960 全自動分枝桿菌培養檢測儀、MGIT 7 ml培養管和分枝桿菌培養添加試劑盒均購自于美國BD公司；GeneXpert MTB/RIF儀器及檢測試劑盒均購自美國Cepheid公司；抗酸染色試劑購自珠海貝索生物技術有限公司；結核分枝桿菌MPT64抗原購自韓國Standard Diagnostics公司；Deaou-308C 恒溫熒光檢測儀和MTBC核酸檢測試劑盒購自廣州迪澳生物科技有限公司。以上試劑均由上海市疾病預防控制中心統一招標采購發放至6個研究現場。

四、方法

1.標本采集：按照《結核病實驗室檢驗規程》[5]要求收集痰樣本，每例患者收集3份痰樣本(即時痰、夜間痰、晨痰)，混勻后分別進行痰涂片、液體培養、GeneXpert檢測、恒溫擴增熒光法檢測。

2.痰涂片：按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[6]中的標準操作程序執行，采用直接涂片法。5家結核病定點醫院(上海市松江區中心醫院、上海市閔行區中心醫院、上海市普陀區中心醫院、上海市嘉定區中心醫院、中國人民解放軍905醫院)采用萋-尼抗酸染色；上海市肺科醫院采用熒光抗酸染色。

3.液體培養：采用N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH法進行痰樣本前處理，按照《結核病實驗室檢驗規程》[5]進行操作。培養42 d儀器未報陽，報告液體培養陰性；對儀器報陽的培養物經涂片抗酸染色確認后，采用結核分枝桿菌抗原MPT64檢測(膠體金法)進行MTBC和NTM初步鑒定。排除初步鑒定為陰性且臨床診斷為非肺結核者；對于初步鑒定為陰性且臨床診斷為肺結核者，進一步采用16S rRNA 測序方法進行菌種鑒定。

4.GeneXpert檢測：按照操作說明書上的步驟進行，通過專用軟件判讀結果。

5.恒溫擴增熒光檢測法：采用廣州迪澳生物科技有限公司生產的MTBC核酸檢測試劑盒，按照操作說明書進行操作和結果判讀。即以出峰時間和熒光擴增曲線顯示結果。出現擴增曲線為陽性(含有 MTBC)，無擴增曲線為陰性。

五、相關指標計算

敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；一致率=(真陽性例數+真陰性例數)/患者總例數×100%。

六、質量控制

為保證多中心評估質量，項目啟動前上海市疾病預防控制中心對6家結核病定點醫院技術人員開展了項目培訓，明確病例納入及排除標準、痰標本收集及檢測要求，并對恒溫擴增熒光檢測法開展技術培訓；項目開展期間，上海市疾病預防控制中心結核病參比實驗室定期對6家結核病定點醫院實驗室開展質控與督導。痰涂片質量控制包括室內質控(內容包括采用標準操作規程、設備耗材、痰標本收集、涂片制備、染色、鏡檢、痰涂片保存等過程的內部檢查和監測)和室間質控(參加上海市疾病預防控制中心結核病參比實驗室組織的盲法復檢及上海市臨床檢驗中心組織的痰涂片抗酸染色室間比對)，成績均達標。培養的質量控制包括對使用的培養管及相關試劑盒質控、實驗物品(標本瓶、稀釋管、接種物品等)質控和污染控制等。6家結核病定點醫院參加由國家結核病參比實驗室組織的分子能力驗證室間比對，GeneXpert和恒溫擴增熒光檢測法成績均合格。

七、統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。4種不同檢測方法檢出率的比較采用配對χ2檢驗，檢驗水準α=0.05；以液體培養為參照標準，計算恒溫擴增熒光檢測法、痰涂片、GeneXpert檢測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值和95%CI值；一致性分析采用Kappa檢驗，Kappa值≥0.75說明一致性好，Kappa值<0.40說明一致性較差，0.40≤Kappa值<0.75說明一致性一般。

結 果

一、恒溫擴增熒光檢測法與痰涂片、液體培養和GeneXpert的檢出率結果比較

在1848例患者痰樣本中，恒溫擴增熒光檢測法、痰涂片、液體培養和GeneXpert檢測MTBC的檢出率分別為16.7%(309/1848)、14.4%(266/1848)、25.4%(470/1848)和28.7%(530/1848)。恒溫擴增熒光檢測法檢出率(16.7%)低于液體培養(25.4%)，差異有統計學意義(χ2=42.16，P=0.001)，也低于GeneXpert檢測結果(28.7%)，差異有統計學意義(χ2=75.31，P=0.001)。

二、恒溫擴增熒光檢測法與痰涂片、GeneXpert檢測效能分析

以液體培養為參照標準，恒溫擴增熒光檢測法、痰涂片和GeneXpert檢測的敏感度分別為58.94%(95%CI:54.33%～63.40%)、52.77%(95%CI: 48.14%～57.34%)、80.43%(95%CI: 76.49%～83.86%)；特異度分別為97.68%(95%CI:96.70%～98.38%)、98.69%(95%CI:97.90%～99.20%)、88.97%(95%CI:87.17%～90.55%)。見表1。以液體培養為參照標準，恒溫擴增熒光檢測法、痰涂片和GeneXpert檢測的一致率分別為87.82%(1623/1848)、87.01%(1608/1848)、86.80%(1604/1848)，Kappa值分別為0.638、0.600、0.666，說明3種檢測方法與液體培養檢測結果一致性均一般。

表1 以液體培養為參照標準恒溫擴增熒光檢測法、痰涂片和GeneXpert MTB/RIF檢測效能分析

三、恒溫擴增熒光檢測法與痰涂片、液體培養和GeneXpert檢測不同性狀痰樣本的結果分析

本研究對收集到的817例臨床診斷肺結核患者的不同性狀痰樣本(黏液樣痰、唾液樣痰、干酪樣痰和血樣痰)進行4種方法檢測結果比較。結果顯示，采用同一種檢測方法檢測4種不同性狀痰樣本，干酪樣痰的檢出率均明顯高于唾液樣痰，除液體培養(χ2=1.700，P=0.193)差異無統計學意義，其他3種檢測方法(恒溫擴增熒光檢測法、痰涂片和GeneXpert)差異均有統計學意義(χ2=8.140，P=0.004；χ2=5.840，P=0.016；χ2=14.950，P=0.001)。在4種不同性狀痰樣本中，除在唾液樣痰中液體培養檢出率最高[38.8%(59/152)]外，其余3種性狀痰樣本(黏液樣痰、干酪樣痰和血樣痰)均為GeneXpert檢出率最高，分別為51.5%(308/598)、66.7%(28/42)和64.0%(16/25)。見表2。

表2 對817例臨床診斷肺結核患者的不同性狀痰樣本進行4種方法檢測的結果

四、恒溫擴增熒光檢測法和GeneXpert檢測結果與痰涂片分級的比較

根據痰涂片級別，可分為6個級別(陰性～4+)。817例臨床診斷肺結核患者中，有583例(71.4%)涂陰患者。在涂陰樣本中，恒溫擴增熒光檢測法的檢出率為10.3%(60/583)，低于GeneXpert檢測的31.9%(186/583)，差異有統計學意義(χ2=81.790，P=0.001)。各檢測方法的檢出率隨著涂片陽性級別增高而升高；低級別陽性(條數～1+)的樣本中，恒溫擴增熒光檢測法檢出率為75.5%(105/139)，GeneXpert檢出率為92.1%(128/139)，差異有統計學意義(χ2=14.030，P=0.001)；中高級別(2+～4+)樣本中的二種檢測方法檢出率均較高，分別為94.7%(90/95)和93.7%(89/95)，差異無統計學意義(χ2=0.100，P=0.756)。在420例臨床診斷肺結核患者的涂陰培陰患者中，恒溫擴增熒光檢測法檢出率為4.5%(19/420),低于GeneXpert檢出率[19.8%(83/420)]，差異有統計學意義(χ2=45.710，P=0.001)。見表3。

表3 817例臨床診斷肺結核患者的痰涂片分級與恒溫擴增熒光檢測法、GeneXpert檢測結果的比較

討 論

近年來，結核病新診斷技術的研發取得了顯著的進展[7]。WHO推薦了包括多色半巢式熒光定量 PCR、微流體芯片技術、環介導等溫擴增法等若干新型結核病診斷新技術[8]。恒溫擴增熒光檢測法是一種將恒溫擴增與實時熒光技術相結合的新型核酸恒溫擴增技術，是“十二五”期間我國自主研發的結核病分子生物學快速診斷技術，前期已有應用該技術對結核病患者的臨床樣本進行快速診斷和評估的報道[9]。本研究是“十三五”期間我中心承擔的該技術多中心評估項目，研究結果顯示，以液體培養為參照標準，恒溫擴增熒光檢測法的敏感度(58.94%)高于痰涂片(52.77%)，但低于GeneXpert檢測(80.43%)，恒溫擴增熒光檢測法的特異度(97.68%)與痰涂片(98.69%)相當，高于GeneXpert檢測(88.97%)；一致性檢驗結果顯示，恒溫擴增熒光檢測法、痰涂片和GeneXpert與液體培養檢測結果一致性均一般。

馬曉光等[9]研究結果顯示，恒溫擴增熒光法檢出率為17.14%，高于痰涂片(8.12%)和培養法(13.47%)；楊健等[10]報道環介導等溫核酸擴增技術陽性檢出率(51.55%)明顯高于痰涂片鏡檢法(31.40%)和固體培養法(39.92%)。本研究中應用恒溫擴增熒光檢測法檢測MTBC的檢出率為16.7%，相比痰涂片(14.4%)檢出率略有提高，但低于液體培養檢出率(25.4%)，此結果與國內報道有所不同[9-11]，原因可能為國內多采用固體培養法或與各實驗室檢測差異有關，液體培養法檢測敏感度高于固體培養，尤其是在含菌量較低的涂陰患者中[12]。檢測時間方面，液體培養報陽時間雖短于固體培養，但還需平均11 d左右[12]，而恒溫擴增熒光檢測法檢測時間僅需要1.5 h左右，大大縮短了臨床診斷肺結核的時間；且相比傳統檢測方法還需進一步做菌種鑒定試驗。恒溫擴增熒光檢測法是以MTBC種特異基因IS6110特異性區域作為檢測靶標，結果陽性即為檢出MTBC。李金莉等[13]報道采用該方法對NTM標準株和其他臨床常見標準株檢測無交叉反應，且其檢測特異度高達100%。本研究中恒溫擴增熒光檢測法檢測MTBC 的特異度(97.68%)略低，但與國內其他研究結果(93.64%～98.02%)一致[9-11]，顯示了其良好的檢測特異度。恒溫擴增熒光檢測法與液體培養結果比較，一致率為87.82%，與痰涂片(87.01%)和GeneXpert(86.80%)檢測一致率相當。

本研究中對817例臨床診斷肺結核患者的不同性狀痰樣本的檢出率進行比較，結果發現唾液樣痰的檢出率明顯低于其他3種性狀痰。近些年，隨著肺結核知識公眾知曉率的提高，以及居民健康體檢的普及，新診斷肺結核患者中因典型的結核病臨床表現就診的患者比例較前減少，多數就診的疑似肺結核患者尚處于病程早期，患者痰量少或送檢唾液樣痰。唾液樣痰不是從肺深部咳出，含病原菌量較少而直接影響檢測MTBC效能，這提示醫務人員應積極向患者進行留痰宣教，講解留痰的重要性，指導患者如何留取肺部深處咳痰，也可采用霧化誘導留痰[14]等人工干預方式獲得質量較好的痰樣，從而提高痰標本中MTBC檢出率。有研究表明，血液中含有血紅蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白等成分會抑制PCR反應而可能造成分子診斷方法檢測MTBC檢出率降低[15]。本研究中，恒溫擴增熒光檢測法檢測血樣痰的檢出率(36.0%)明顯低于液體培養(60.0%)和GeneXpert(64.0%)，血樣痰對恒溫擴增熒光檢測法的檢出率影響大于GeneXpert。本研究中血樣痰樣本量較少，無法證明是否是因兩種分子檢測方法采用的前處理方式或擴增方法不同所導致，可在今后工作中做進一步探討。對恒溫擴增熒光檢測法和GeneXpert檢測MTBC結果與痰涂片分級比較，發現2種檢測方法在中高級別涂陽患者中均具有良好的敏感度，但在涂陰培陰患者中，恒溫擴增熒光檢測法的檢出率僅4.5%，低于國內報道恒溫擴增熒光檢測法對涂陰培陰患者10%～20%的檢出率的結果[10,13]，這可能與采用液體培養提高了培養陽性率，從而減少了涂陰培陰患者比例有關，同時也表明恒溫擴增熒光檢測法還需進一步優化反應體系，以提高對涂陰患者及低級別涂陽患者的檢出率。

恒溫擴增熒光檢測法是2012年前完成了試劑盒研發、成果臨床轉化和臨床驗證評估[16]，該方法最初是由人工肉眼觀察進行結果判讀，經技術革新，現在恒溫擴增熒光檢測法應用熒光檢測儀自動判讀，實現了MTBC的快速核酸擴增和自動化結果報告，顯示了該方法自動化程度的提高。本研究分別在6個研究現場開展工作，采用熒光檢測儀自動判讀，避免了在不同實驗室環境、操作人員的技術水平和熟練度等差異而導致人工主觀判讀的誤差，提高了檢測結果的準確性和穩定性。本研究結果顯示，恒溫擴增熒光檢測法檢測MTBC效能相比痰涂片有所提高，但該方法的檢測敏感度低于GeneXpert。有研究顯示，采用這兩種分子診斷技術檢測MTBC均能提高病原學陽性率[17]。雖然恒溫擴增熒光法的檢測敏感度低于GeneXpert，但是，首先該方法使用的是我國自主研發的國產試劑盒，價格相較美國生產的GeneXpert試劑盒低很多，近兩年GeneXpert試劑價格呈現逐年上漲趨勢，也增加了政府公共衛生預算；其次，國產試劑亦不會出現因運輸或者試劑報關等造成到貨時間延遲而導致試劑有效期短或可能出現試劑失效等情況；第三，恒溫擴增熒光檢測法所使用的儀器設備均整合在一個拉桿箱中，如發生突發公共衛生事件可攜帶至現場開展應急檢測。

恒溫擴增熒光檢測法操作簡單、快速，相比傳統PCR方法沒有較復雜和嚴格的技術要求，但該方法仍屬于分子生物學檢測技術。有研究表明，該方法的實驗室交叉污染較低，但仍須在四分區的標準PCR實驗室進行操作[18]。隨著《結核病分級診療和綜合防治服務模式試點工作》及《遏制結核病行動計劃(2019—2022年)》任務推進，我國正在大力加強對各地基層實驗室能力的建設，期望結核病分子快速診斷技術能得到更廣泛的應用。

綜上所述，恒溫擴增熒光檢測法檢測痰樣本中MTBC具有良好的檢測特異度，該方法和痰涂片及GeneXpert與液體培養檢測結果一致性均一般，臨床可以根據實驗室硬件條件及患者情況選擇開展多種方法聯合檢測，以提高肺結核的病原學診斷率。

本研究的不足之處：(1)本研究以液體培養為參照標準進行多種檢測方法的效能分析，而其他研究大都以臨床診斷為標準，因此，可能低估了恒溫擴增熒光法檢測MTBC的效能。(2)本研究未將免疫學檢查納入評價。近年來γ-干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay，IGRA)已逐漸成為診斷結核病的重要輔助手段，尤其對菌陰肺結核的診斷[18]。《WS 288—2017肺結核診斷》[3]也將IGRA增加到免疫學檢查中，作為鑒別診斷肺結核的輔助檢查之一。如進一步對病原學診斷方法聯合免疫學檢查進行研究，可更科學精準地評價多種檢測技術聯合診斷對于結核病從感染到發病的不同階段，特別是病原學陰性肺結核、亞臨床感染及結核分枝桿菌潛伏感染的檢測效能。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻李靜：實驗設計、實施研究、采集數據、分析/解釋數據、統計分析、起草文章及審閱；吳哲淵：實驗設計、實施研究、獲取研究經費和行政支持；楊景卉和楊麗媛：實施研究、采集數據、分析/解釋數據；王莉莉：實驗設計、實施研究；袁鋒：實施研究、采集數據；沈鑫：獲取研究經費、行政支持和審閱；江淵：實驗設計、實施研究、行政支持和技術指導及審閱