超聲分散技術在分枝桿菌液體培養污染再處理中的應用效果分析

田鵬 鄧云峰 王俊玲 凌曉潔 張真金 王琳

分枝桿菌培養是結核病實驗室病原學診斷的“金標準”，也是開展各項結核病基礎研究的前提，其優點為方法經典、敏感度高、特異度強，但其缺少時效性且易受外界和標本自身的影響產生雜菌污染造成培養失敗[1]。痰標本分枝桿菌培養的質量控制要求固體培養法污染率為2%～5%，液體培養法的污染率應控制在5%～10%以內[2]。與固體培養法相比，液體培養法的污染率可能會更高，而樣本污染率增高將嚴重影響分枝桿菌培養的成功率以及患者結核病診斷的時效性[3]。選擇恰當的標本前處理方法[4-12]或對污染后的培養產物進行再處理是控制液體培養污染的主要途徑[1,3]。然而，以往研究中提出的再處理方法雖然可以降低液體培養的污染率[1]，但無法提高分枝桿菌的檢出率[3]。因此，液體培養污染后的再處理技術需要進一步改進和創新。超聲分散法是將超聲分散技術應用于分枝桿菌液體培養污染樣本再處理的過程，利用超聲波在液體介質中產生的“空化”作用，使結團的物質在液體介質內充分分散，并通過與消化劑氫氧化鈉(NaOH)的一系列物理和化學反應，達到殺滅污染菌、提高分枝桿菌檢出率的目的。筆者通過與不同再處理技術進行對比，對不同再處理技術培養陽性率和污染率比較分析，優化結核病的實驗室診斷策略，以更好地為臨床醫生和患者服務。

材料和方法

一、標本采集

根據《結核病實驗室檢驗規程》[13]中痰標本收集的要求，連續收集2020年8月到2021年1月山東省公共衛生臨床中心門診和住院的疑似或確診結核病患者的痰標本。本研究共納入5285例患者，疑似肺結核患者4490例，確診肺結核患者795例；男性3251例，女性2034例;患者年齡中位數為41歲。

二、主要試劑與儀器

抗酸染色液(珠海貝索生物技術有限公司)、磷酸鹽緩沖液(pH 6.8,0.067 mmol/L，自配高壓蒸汽滅菌)、標本前處理液A[NALC-NaOH-Na citrate：6% NaOH與2.94% 枸櫞酸鈉1∶1混合，每100 ml加入0.5 g N-乙酰半胱氨酸 (NALC)，自配]、標本前處理液B(3% NaOH，自配)、MGIT 培養管(添加劑，抑菌劑，美國BD公司)、MPB64(凱必利，杭州創新生物檢控技術有限公司)。

顯微鏡(寧波舜宇光學科技有限公司)、低溫高速離心機(湖南湘智離心機儀器有限公司)、BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌快速培養儀(美國BD公司)、超聲分散儀(Scientz 08-Ⅲc，寧波新芝生物科技股份有限公司)。

三、研究方法

1.分枝桿菌培養標準化操作程序：參考《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》[2]中的前處理操作程序，取1～2 ml痰標本，加入1～2倍標本前處理液A，渦旋振蕩30 s，室溫靜置15 min，加入磷酸鹽緩沖液至45 ml，3000×g離心15 min，去上清液留取沉渣，加入0.5 ml磷酸鹽緩沖液，混勻后取0.5 ml混懸液加入MGIT 培養管，放入全自動分枝桿菌快速培養儀。

2.培養陽性與污染認定：MGIT 培養管報告陽性后，觀察培養基渾濁程度并進行涂片抗酸桿菌染色鏡檢確認:(1)培養基清澈且鏡檢結果為抗酸桿菌陽性，則報告液體培養分枝桿菌陽性。(2)培養基渾濁，取一接種環液體培養基接種于血瓊脂平板并進行傳代培養，如有污染菌生長，無論鏡檢結果為抗酸桿菌和(或)非抗酸桿菌在本研究中均視為培養污染，記錄并報告污染時間。(3)所有培養陽性標本應用MPB64進行菌種鑒定，檢測線和控制線均出現，報告結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)；控制線出現而檢測線未出，報告非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)；控制線未出現需重新檢測。

3.培養污染樣本分組情況：對5285例疑似或確診結核病患者的痰標本進行液體培養，觀察陽性率、污染率以及報告污染時間。將報告污染的MGIT培養管內容物充分混勻，并將其均分為2份標本，一份納入直接組(259例)，另一份納入超聲組(259例)，兩組分別應用直接處理法和超聲分散法進行再處理。觀察兩組再處理后培養陽性率和污染率，并比較MTBC與NTM的檢出率。同時觀察兩組中同一份標本經不同方法再處理后，培養結果的一致性。

4.培養污染樣本再處理方法：(1)直接處理法：參考分枝桿菌培養標準化操作程序，應用的前處理方法與初次培養一致。(2)超聲分散法：首先設定超聲分散儀參數，超聲頻率20 kHz、輸入功率19 W、超聲時間2 min；然后取超聲組標本2 ml與標本前處理液B按1∶1混合，立即放入超聲分散儀不間斷超聲2 min，隨后室溫靜置10 min，加入磷酸鹽緩沖液至45 ml，3000×g離心15 min，去上清液留取沉渣，加入0.5 ml磷酸鹽緩沖液，混勻后取0.5 ml混懸液加入MGIT 培養管，放入全自動分枝桿菌快速培養儀。

5.質量控制：按照《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》[2]中有關質量控制的步驟進行嚴格質控。本研究中對檢出NTM的患者進行重復NTM培養，排除實驗室污染的可能。

6.統計學處理：采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。計數資料以“構成比或百分率(%)”描述，組間差異的比較采用χ2檢驗；兩組再處理方法的一致性用Kappa檢驗；Kappa值<0.4認為一致性較差，0.4≤Kappa值<0.75認為一致性一般，Kappa值≥0.75 認為一致性較好。均以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、初次培養與標本污染再處理后培養結果

5285份痰標本初次培養陽性率為17.7%(935/5285)，污染率為4.9%(259/5285)。259例污染結果中157例(60.6%)患者報告污染時間為1～3 d、100例(38.6%)為4～10 d、2例(0.8%)為11～20 d。直接組與超聲組陽性率分別為7.3%(19/259)和13.9%(36/259)；污染率分別為26.6%(69/259)和21.2%(55/259)；MTBC 檢出率分別為4.2%(11/259)和5.0%(13/259)；NTM 檢出率分別為3.1%(8/259)和 8.9%(23/259)。超聲組培養陽性率高于直接組，兩組比較差異有統計學意義(χ2=5.879，P=0.015)；超聲組NTM檢出率明顯高于直接組，兩組比較差異有統計學意義(χ2=7.720，P=0.005)；超聲組MTBC檢出率雖然高于直接組，但兩組比較差異無統計學意義(χ2=0.175，P=0.676)。超聲組污染率低于直接組，但兩組比較差異無統計學意義(χ2=2.078，P=0.149)。

二、兩組中同一份標本經不同方法再處理后培養結果一致性比較

兩組中同一份標本，直接組和超聲組均報告MTBC 10例、NTM 8例、陰性163例、污染53例；直接組報告污染的標本中，超聲組報告MTBC 2例、NTM 10例和陰性4例；直接組報告陰性的標本中，超聲組報告MTBC 1例、NTM 5例、污染2例。兩種方法的Kappa值為0.81(P<0.001)，說明兩組培養結果的一致性較好(表1)。

表1 同一份標本再處理后培養結果一致性比較

討 論

痰標本液體培養法與固體培養法相比，優點為培養陽性率高且陽性報告周期短，但其污染率偏高，影響了結核病的實驗室診斷和患者的臨床治療[3]。

國內外研究顯示，痰標本液體培養法的平均污染率為6.7%[14-21]。本研究中5285例痰標本初次液體培養法污染率為4.9%，與國內大多研究相符[14-17,19,21]。造成痰標本液體培養法污染的原因有很多，例如：口腔雜菌的污染[5]，痰標本儲存時間與溫度不當[1]，肺部感染患者痰中存在不易被前處理液殺死的細菌[3]，等等。本研究結果顯示，當培養污染后對污染標本進行去污染再處理，不僅能夠增加陽性檢出率而且能顯著降低污染率，但不同的方法對污染標本再處理后的效果不同。

一、直接處理法與超聲分散法的結果分析

直接處理法是指當培養發生污染后，直接對MGIT培養管內的培養產物進行去污染再處理，應用的前處理方法與初次培養一致。超聲分散法是超聲分散技術與分枝桿菌培養前處理方法的有效結合，筆者在前期的研究中報道過，超聲分散技術是利用超聲波在液體介質中產生的“空化”作用，使結團的物質在液體介質內分散[4,7]。將超聲分散技術應用于痰標本分枝桿菌培養的前處理中，可以明顯增加去污染效果，在有效殺滅痰標本中污染菌的同時可以保持分枝桿菌的活力，使分枝桿菌培養陽性檢出率增高，污染率降低。而Li等[22]研究發現，超聲波可以使病原微生物失活，但失活的效率與微生物的初始濃度無關，只與微生物的種類有關。Gao 等[23]在研究中也得出了相同結論，即超聲波致使不同微生物失活是具有選擇特異性的。這些研究的發現，均對超聲分散技術在分枝桿菌液體培養污染標本再處理中的應用提供了理論基礎。

在本研究中，與直接處理法相比，超聲分散法培養陽性率更高。同一患者的污染樣本，經超聲分散法再處理后比直接法多檢測出了3例MTBC和15例 NTM。因此，超聲分散法在控制污染的同時可以更好地保護分枝桿菌的活性。另外，值得注意的一點是，在培養污染的標本中，超聲分散法更有利于NTM的檢出。因此，面對全球NTM肺病發病率的不斷增加[24]，超聲分散法在NTM肺病病原學診斷方面，與直接處理法相比可能具有巨大的優勢。

二、超聲分散法的優勢

1.方便快捷，可執行性強。在直接處理法中，每份標本與前處理液混合后，需要在振蕩器上渦旋振蕩30 s，大量連續工作會使操作人員手部感到不適。而超聲分散法不僅代替了人工振蕩，且可同時處理數個標本，減少了每個標本間消化時間的誤差。

2.避免浪費。直接處理法的標本前處理液A中存在NALC與枸櫞酸鈉，有研究指出這兩種試劑在痰標本前處理中可以使痰標本快速均質化，但NALC需要現用現配[15]。而超聲分散法中放棄了NALC與枸櫞酸鈉的使用，節約了成本且避免了因為NALC需現用現配不能過夜保存等因素所造成的浪費。

3.降低了分枝桿菌活性損傷的風險。《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》[2]指出，可以適當提高NaOH終濃度和增加消化時間控制標本中的高污染，但大量的研究表明，隨著NaOH終濃度和消化時間的增加，在殺滅污染菌的同時分枝桿菌的活性也隨之降低[8-12]，而本研究中的超聲分散法，在不增加NaOH終濃度的同時減少了消化時間，從而大大降低了分枝桿菌活性損傷的風險。

三、本研究的不足

目前對于超聲分散法再處理技術的研究，可能還存在以下幾點問題：(1)未排除NALC與枸櫞酸鈉對分枝桿菌活性的影響；(2)并未對分離出的NTM進行菌種鑒定；(3)本研究中的超聲分散法和超聲分散的主要技術參數為預實驗中獲得并非最優，需要在今后的工作中進一步加大樣本量探索優化。

綜上所述，超聲分散法具有方便快捷、避免浪費等優勢，在控制污染的同時，能更好地檢出MTBC 和NTM，表明超聲分散技術在分枝桿菌液體培養污染標本再處理中具有巨大的應用潛能。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻田鵬：直接參與(包括：采集數據、分析/解釋數據)、文章撰寫(包括：起草文章、對文章的知識性內容作批評性審閱)；鄧云峰：文章撰寫(對文章的知識性內容作批評性審閱)、工作支持(指導)；王琳：文章撰寫(對文章的知識性內容作批評性審閱)、工作支持(統計分析)；王俊玲：直接參與(采集數據)、工作支持(統計分析)；凌曉潔和張真金：直接參與(采集數據)