毛細胞白血病和毛細胞白血病變異型患者免疫球蛋白重鏈可變區基因分子特征分析*

王軼 王婷玉 王君 閻禹廷 呂瑞 熊文婕 邱錄貴 易樹華

毛細胞白血病（hairy cell leukemia，HCL）和毛細胞白血病變異型（hairy cell leukemia-variant，HCL-v）是兩種罕見的慢性B 細胞增殖性疾病（B-cell lymphoproliferative diseases，BLPD），約占整個成人白血病的2%[1]。HCL-v 在過去的很多年中被認為是HCL的一個變種，2016 版世界衛生組織造血與淋巴組織腫瘤分型標準（2016WHO 分型）將其歸類于“脾B 細胞淋巴瘤，不能分類”[2]，成為區別于HCL 的一個疾病亞類。由于十分罕見，HCL 和HCL-v 的臨床、生物學特征和預后之間的關系尚無明確定論。

這是從入錯的角度對責任原因進行排序，還需要從出錯的角度對責任原因進行排除，即并非屬于責任產生的原因進行排除的緣由。這個方面需要進行充分地論證，而非僅僅只是簡單帶過，減少并避免說情打招呼的現象導致漏網之魚的出現。

B 細胞受體（B cell receptors，BCR）及其信號通路激活是B 細胞腫瘤發生和演變過程中關鍵的分子靶標，其中免疫球蛋白重鏈可變區（immunoglobulin heavy chain variable region,IGHV）基因的分子特征與B 細胞淋巴瘤的特定臨床特征及預后相關。數項基于歐美人群的研究顯示，HCL 和HCL-v 對VH3和VH4 基因家族有偏向性使用，而IGHV 未突變狀態（IGHV-unmutated，IGHV-UM）和使用VH4-34 片段（VH4-34 rearrangement，VH4-34+）是兩種疾病的不良預后因素[3-6]。本研究回顧性分析中國醫學科學院血液病醫院29 例HCL 和15 例HCL-v 患者IGHV 分子特征及其與臨床表現、預后的相關性，旨在探索國內HCL 和HCL-v 患者IGHV 的特征和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

研究對象為2004 年12月至2020 年1月在中國醫學科學院血液病醫院診療并完善IGHV 檢測的44例患者，其中HCL 為29 例，HCL-v 為15 例。所有患者均完善骨髓/外周血多色流式免疫分型、病理細胞形態及免疫組織化學、靶向測序等多種檢測，并由高年資醫師根據2016WHO 分型[2]及《B 細胞慢性淋巴增殖性疾病診斷與鑒別診斷中國專家共識（2018 年版）》[7]進行診斷復核。

1.2 方法

1.2.1 IGHV 突變狀態及重排片段檢測 抽取患者骨髓或外周血標本并提取基因組DNA，按照試劑盒（購于美國InVivoScribe 公司，IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0）說明書對IGHV 基因片段進行多重PCR 技術擴增，隨后回收純化擴增片段并進行雙向測序。所得序列與IMGT（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest）和IgBLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast）數據庫進行對比以獲取突變狀態及重排片段信息。IGVH 序列同源性≥98%定義為未發生體細胞突變，同源性＜98%則定義為發生體細胞突變。

44 例患者的中位年齡為54.5（33～86）歲，男女比為3.4∶1。與既往報道相一致，HCL 患者發病年齡更輕且男性患者更為多見、血細胞減少表現更為明顯，而HCL-v 患者更易出現乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和β2 微球蛋白（β2microglobulin，β2-MG）水平升高、脾大及核型異常（表1）。治療方面，28 例HCL 患者和14 例HCL-v 患者具備治療指征。超過70%患者一線接受核苷類似物聯合或不聯合利妥昔單抗治療，5 例HCL 患者和2 例HCL-v 患者接受干擾素治療，1 例HCL 患者和2 例HCL-v 患者采用瘤可燃或中藥治療，2 例HCL 患者于藥物治療前接受切脾治療。

1.2.2 隨訪 通過門診、住院病歷資料及電話進行隨訪。對隨訪期間死亡的病例，根據病歷記錄或與患者家屬電話聯系確認。隨訪時間截至2021 年5月，中位隨訪時間36（5～188）個月。總生存時間（overall survival，OS）為治療開始至因任何原因所致的死亡時間或末次隨訪時間。無進展生存時間（progressionfree survival，PFS）定義為治療開始至疾病復發/進展、任何原因導致的死亡或末次隨訪時間。

將HCL 患者按照VH 基因分為VH1、VH3 和VH4 3 組，發現使用VH4 基因的患者出現中性粒細胞減少的比例偏低（ VH1vs.VH3vs.VH4 為100.0%vs.88.9%vs.50.0%，χ2=5.370，P=0.070），而使用VH1基因的患者則更少發生脾腫大（VH1vs.VH3vs.VH4為50.0%vs.100.0%vs.90.0%，χ2=5.560，P=0.041）。以重排片段是否為VH4-34 對HCL 患者進行分組，VH4-34+的HCL 患者LDH（VH4-34+vs.VH4-34-為205.2 U/Lvs.160.5 U/L，t=2.063，P=0.049）及β2-MG（VH4-34+vs.VH4-34-為4.45 mg/Lvs.2.20 mg/L，U=3.000，P=0.039）水平更高。進一步以IGHV 突變狀態對患者進行分組，未突變的HCL 患者也表現為更高腫瘤負荷特征，具有更高的LDH（IGHV-UMvs.IGHV-M 為197.2 U/Lvs,.155.3 U/L，t=2.440，P=0.022）及β2-MG（IGHV-UMvs,.IGHV-M 為3.71 mg/Lvs,.2.11 mg/L，U=5.000，P=0.036）水平。25 例HCL患者通過Sanger 測序或二代測序對BRAF V600E 基因突變進行檢測，其突變陽性率為72.0%（18/25）。VH4-34+患者BRAF V600E 突變率明顯低于VH4-34-患者［20.0%（1/5）vs.85.0%（17/20），P=0.012］。

1.3 統計學分析

HCL-v 患者的年齡分布、血細胞計數、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）水平、生化指標（LDH、β2-MG 等）、脾腫大、B 癥狀等在以常見VH 家族基因、是否使用VH4-34 片段或IGHV 突變狀態為分組依據的亞組中無明顯差異。

2 結果

2.1 患者基線及治療資料

據自然正家的數據統計，在服務過程中換用公司自發研制的清潔套組后，員工的工作效率提升了17%，客戶滿意率達到98%以上。好品質的清潔套組和高口碑的服務在客戶群中口口相傳，公司的訂單也就越來越多。

表1 基線特征及治療情況

2.2 VH 基因使用情況和突變狀態

44 例患者均檢測出重排，共涉及23 種重排片段。HCL 和HCL-v 的VH 基因使用存在明顯的偏向性和相似性（圖1A）。7 個VH 基因家族中，VH4、VH3、VH1 基因依次為兩種疾病最常使用的3 種基因，86.2%（25/29）的HCL 患者和93.3%（14/15）的 HCL-v患者均集中于這3 種基因。具體到VH 基因片段（圖1B），HCL 最常見的兩種重排片段為VH4-34（17.2%）和VH3-23（10.3%）；HCL-v 最常見的兩種重排類型則為VH4-34（20.0%）和VH4-39（13.3%）。

IGHV 基因為突變狀態（IGHV-mutated，IGHV-M）的患者在HCL 和HCL-v 中分別占72.4%（21/29）和66.7%（10/15），中位突變值分別為3.8（0～13.2）%和4.1（0～12.0）%。不同VH 基因家族的突變率呈不均一分布（圖1A），使用VH4 基因的患者中，50%的HCL 患者和60% 的患者為IGHV-UM，突變率顯著低于其他基因家族（P=0.032）。對常見VH 基因片段的分析顯示，VH4-34 在HCL 和HCL-v 中的突變率分別為20%（1/5）和0（0/3），明顯低于其他基因片段（P＜0.001）。

圖1 IGHV 基因家族和常見重排片段的分布情況

2.3 IGHV 分子特征與臨床特征相關性

目前，奶牛場常用消毒液有碘伏、次氯酸鈉和新潔爾滅等[15]，均需用水稀釋后使用，藥浴后蒸發較快，作用持續時間短，易造成乳房的重復感染，且對奶牛皮膚有一定的刺激和影響[16]。其中聚維酮碘是由聚乙烯毗咯烷酮與碘結合形成的一種無定形復合物，對皮膚有比較好的濕潤和保護作用，因此廣泛應用于奶牛場的乳頭消毒。但碘制劑消毒液有一定的殘留作用，Bogdan等人發現，碘消毒和乳房乳頭藥浴將增加平均牛奶碘含量從（44±1.6）～（59.3±2.3）μg/1000 mL[3]。

VH4-34+克隆性B 細胞可見于多種淋巴瘤及自身免疫病。據文獻報道，約 5%的正常B 細胞為VH4-34+，而其在多發性骨髓瘤、CLL、濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）、套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）和彌漫性大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）的使用率分別為0、4%～22%、9%～23%、11%～16% 和15%～65%，即整體上侵襲性淋巴瘤中VH4-34 的使用率更高[10,13-16]。而針對多種淋巴瘤亞型的分子病理學研究顯示，特定的IGHV 分子特征對應特定的遺傳學異常及信號通路活性改變，如VH4-34+眼附屬器黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤TNFAIP3 突變率更高[17]，而VH4-34+FL 則與低IGH/BCL2 易位率相關[13]。BRAF V600E 突變是HCL 發生發展早期出現的重要驅動性遺傳學事件[1]。同前期研究相一致[18]，本研究證實VH4-34+HCL 患者BRAF V600E 突變陰性率更高。基于中國HCL 患者更高的VH4-34 使用率，另一項國內HCL患者特征研究[19]所顯示的較低BRAF V600E 突變率也一定程度上支持中國與歐美HCL 患者間存在病理生理學差異。

采用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析。分類變量組間比較采用χ2檢驗或Fisher 精確概率法，計量資料的組間比較采用t檢驗或Mann-Whitney 非參數檢驗。采用Kaplan-Meier 法計算PFS 和OS 并繪制生存曲線，單因素分析采用Log-rank 檢驗。雙側檢驗以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2.4 IGHV 分子特征的預后意義

38 例患者于本院接受系統治療并具備隨訪信息（HCL 25 例，HCL-v 13 例）。中位隨訪時間36（5～188）個月，HCL 患者的PFS 明顯長于HCL-v 患者[3年PFS 率HCLvs.HCL-v 為（90.2±6.6）%vs.（60.0±16.7）%，P=0.042]，OS 無顯著性差異［3 年OS 率HCLvs.HCL-v 為（100.0±0）%vs.（90.0±9.5）%，P=0.224；圖2A～B］。對可能影響預后的因素進行單因素分析，LDH 水平升高（PFSP＜0.001，OSP=0.025）和VH4-34+（PFSP=0.001，OSP=0.004；圖2C ～D）的HCL 患者PFS 和OS 更短；Hb＜100 g/L（P=0.023）、脾 大（P=0.025）和IGHV-UM（P=0.038，圖2E）為HCL-v 患者PFS 的不良預后因素，IGHV-UM 的HCLv 患者OS 也有縮短趨勢（P=0.060，圖2F）。白細胞增多、淋巴細胞增多、血小板減少、β2-MG 水平升高、復雜核型、確診時外周血/骨髓流式細胞比例在本研究中未顯示出明顯預后意義。

圖2 患者生存曲線

3 討論

本研究對近15 年來本院收治的HCL 和HCL-v患者的IGHV 分子特征進行回顧性分析。與國外報道相一致，國內HCL 和HCL-v 患者最常見的VH 基因家族集中于VH4、VH3 和VH1，這也與正常B 細胞和多種BLPD 的VH 基因家族分布大致相似。但相較于兩項美國研究[3，5]中HCL 對VH3（57%）和VH3-23（21%）的偏向性使用，本隊列中HCL 患者VH4（34.5%）及VH4-34（17.2%）的使用比例明顯增高。事實上，在既往本課題組和其他團隊的研究中，VH4基因家族（尤其是VH4-34）在國內BLPD 患者中的使用比例較歐美國家更高，其在慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）、淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏蛋白血癥、脾邊緣區淋巴瘤等多種BLPD中的使用率均居首位或前3 位[10-12]。該現象或可反映種族及環境中特定的抗原選擇過程，提示中西方疾病差異的潛在機制。

B 細胞在發育成熟過程中會先后經歷IGHV 重排、體細胞高頻突變和類別轉換等過程，最終獲得具有多樣性和高抗體親和性的BCR。BCR 可識別抗原參與免疫反應，其信號通路活化也是B 細胞腫瘤發生發展和克隆演變的驅動因素。每個B 細胞均具備特定的BCR 特征。因此，IGHV 使用片段和突變狀態能夠反映B 細胞的來源和生物特征，目前已用于闡釋多種自身免疫病、B 細胞腫瘤的病理機制或應用于診斷、預后評估或微小殘留病監測等[8-9]。既往較少研究關注HCL 和HCL-v 的IGHV 分子特征。作為兩種非常罕見的BLPD，國內患者的IGHV 基因分布、突變狀態及其與臨床特征、預后的關系有待進一步探索。

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基于歐美人群的研究[3,5]顯示，VH4-34+HCL 患者具備獨特的臨床特征，如初診時高白細胞數、低IGHV 突變率等。在本隊列中，VH4-34+HCL 也表現出高LDH 和β2-MG 水平等高腫瘤負荷特征，并與IGHV-UM 相關。事實上，VH4-34+腫瘤細胞在不同淋巴瘤中的IGHV 突變率也不盡相同。一項中國多中心CLL 患者IGHV 特征的研究[10]顯示，VH4-34+與高IGHV 突變率相關（P=0.001）。而本研究所顯示的VH4-34+在HCL 和HCL-v 患者中有更高未突變率（P＜0.001）與既往研究一致[3,5]。即綜合IGHV 片段使用和突變信息能夠提供更豐富的腫瘤細胞起源和演進信息，有助于加深對特定組群患者疾病特征的理解。

IGHV 特征也是淋巴瘤的重要預后因素。目前，IGHV-UM 已在CLL、MCL 和DLBCL 等淋巴瘤中均被證實是不良預后因素[8,16,20]。而特定片段使用也與預后相關，如使用VH3-21 的突變型CLL 患者預后并未優于未突變型CLL 患者等[21]。本研究中，VH4-34+和IGHV-UM 分別是HCL 和HCL-v 的不良預后因素。受限于病例數，本研究未進一步行多因素預后分析確定這兩種疾病的獨立預后因素。考慮到VH4-34+HCL 對克拉屈濱單藥不敏感及免疫化療在這兩種疾病中的有效性[3,22]，臨床上對VH4-34+HCL 患者宜首選核苷類似物聯合利妥昔單抗治療，未來也應繼續探索更優治療策略。

由于疾病的罕見性，前期和本研究的部分發現仍有待更深入的探究。如VH4-34+HCL 所顯現的高腫瘤負荷、特定基因突變譜以及更差預后與VH4-34+HCL-v 存在明顯一致性，共同反映了VH4-34+腫瘤細胞的特殊起源及腫瘤演進過程。對于這類臨床表現、病理形態和免疫表型相似的淋巴瘤亞型，依據分子分型的診療模式或許優于疾病分型，而該觀點的合理性還有賴于更多多組學研究的證據支持。此外，VH4-34+和IGHV-UM 均被認為是HCL 和HCL-v的不良預后因素，而考慮到兩者的高度共現性，特定基因片段和IGHV 突變狀態的獨立預后意義有待被證實。

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綜上所述，本研究顯示中國HCL 和HCL-v 患者對VH4 基因家族，尤其是VH4-34 存在使用偏向性，而這類患者更易為IGHV-UM。VH4-34+HCL 患者具有更高腫瘤負荷、更低BRAF V600E 突變的特征。同時，IGHV 的分子特征與HCL 和HCL-v 患者不同預后相關。