鹽黃柏指紋圖譜研究及質量標志物預測分析

劉曉琳，吳文平，潘禮業，邢菊玲，官永河，楊曉東，龐 偉，李國衛

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，佛山 528244

黃柏為蕓香科植物黃皮樹PhelllodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮，習稱“川黃柏”。剝取樹皮后，除去粗皮，曬干。黃柏味苦性寒，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡之功用；鹽黃柏為黃柏照鹽水炙法炒干的炮制品，可滋陰降火，用于陰虛火旺，盜汗骨蒸[1]。黃柏的主要化學成分包括生物堿類、檸檬苦素類、酚酸類及黃酮類[2]。研究發現，黃柏不同炮制品中化學成分及其含量、藥理作用有變化及差異，鹽黃柏對金黃色葡萄球菌及白喉桿菌的抑制作用均優于黃柏絲[3-5]，此外，鹽黃柏代謝抑制功能優于黃柏，該活性被認為是黃柏滋陰作用的物質基礎，故經鹽炮制后黃柏的滋陰作用加強[6]。2020版《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)采用HPLC法測定鹽黃柏中小檗堿及黃柏堿的含量，并規定其含量分別不少于3.0%及0.34%，本研究以鹽黃柏為研究對象，建立了22批鹽黃柏HPLC指紋圖譜，在主成分分析(principal component analysis，PCA)的基礎上運用正交偏最小二乘分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)初步篩選出不同批次鹽黃柏的差異性成分，結合指紋圖譜數據分析及網絡藥理學分析方法，從化學、生物信息及數理統計相結合的角度篩選鹽黃柏的活性成分，進而確認鹽黃柏質量標志物，為鹽黃柏質量控制提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(沃特世公司，Waters e2695，2489 UV/Vis Detector);Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色譜柱;萬分之一天平(梅特勒-托利多公司，ME204E);百萬分之一天平(梅特勒-托利多公司，XP26);數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，KQ-500DE)；超純水系統(默克股份有限公司，Milli-Q Direct)。

1.2 試劑和試藥

3-O-阿魏酰奎寧酸(四川省維克奇生物科技有限公司，純度：98.4%，批號：wkq20022003)；5-O-阿魏酰奎寧酸(四川省維克奇生物科技有限公司，純度：HPLC≥ 98%，批號：wkq19100907)；鹽酸小檗堿(中國食品藥品檢定研究院，含量：86.8%，批號：110713-201613)；鹽酸黃柏堿(中國食品藥品檢定研究院，含量：94.9%，批號：111895-201504)；甲醇(西隴科技股份有限公司)；乙腈(默克公司，色譜級)；研究所用鹽黃柏飲片Salt-fried Phellodendri Chinensis Cortex(SPCC)來源信息見表1，經廣東一方制藥有限公司技術中心/質量中心主任中藥師魏梅鑒定為蕓香科植物黃皮樹PhelllodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮的炮制加工品。

表1 鹽黃柏飲片來源信息

2 方法與結果

2.1 鹽黃柏指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)色譜柱；流動相為乙腈(A)-0.4mol/L NH4Cl(B)，梯度洗脫：0～5 min，95% B；5～40 min，95%→75% B；40～45 min，75%→65% B；45～50 min，65%→45% B；50～60 min，45%→10% B；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10μL；檢測波長為210 nm。

2.1.2 對照品溶液制備

取3-O-阿魏酰奎寧酸對照品、5-O-阿魏酰奎寧酸對照品、鹽酸黃柏堿對照品、鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含3-O-阿魏酰奎寧酸對照品35 μg、5-O-阿魏酰奎寧酸對照品75 μg、鹽酸黃柏堿150 μg、鹽酸小檗堿100 μg的混合溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備

取鹽黃柏飲片粉末(過四號篩)0.1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

方法學考察

2.1.4.1 專屬性考察

精密吸取50%甲醇(陰性對照)各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見圖1。實驗結果表明該分析方法能準確檢測所指認的特征峰，不受提取溶劑的干擾。

圖1 陰性對照色譜圖

2.1.4.2 精密度考察

取同一供試品溶液，精密吸取10 μL，按照“2.1.1”項下色譜條件，重復進樣6次，記錄色譜圖，以與小檗堿參照物相應的峰為S峰，計算特征峰相對保留時間和相對峰面積。結果顯示各共有峰的相對保留時間與相對峰面積RSD < 3%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 穩定性考察

取同一供試品溶液，精密吸取10 μL，按照“2.1.1”項下色譜條件，分別在0、4、8、16、20、24 h進樣，記錄色譜圖，以小檗堿峰為S峰，計算特征峰相對保留時間和相對峰面積。結果顯示各特征峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD < 3%，表明供試溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.4.4 重復性考察

取同一批鹽黃柏飲片粉末0.1 g，共6份，精密稱定，按照“2.1.3”項下的方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件，進樣，記錄色譜圖，以小檗堿峰為S峰，計算特征峰相對保留時間和相對峰面積。結果顯示各特征峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD < 3%，該方法的重復性良好。

2.1.5 特征峰指認及共有峰確認

采用國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012.0版)對22批鹽黃柏飲片指紋圖譜(見圖2)進行分析，按平均數法生成對照圖譜(見圖3)，建立各自指紋圖譜并生成指紋圖譜共有模式，共確定9個共有峰。

圖2 鹽黃柏指紋圖譜疊加圖

圖3 鹽黃柏對照圖譜

按“2.1.1”項下的色譜條件分別對供試品溶液和對照品溶液進行測定，通過與對照品保留時間進行比對，確定4個化學成分，分別為3-O-阿魏酰奎寧酸(峰2)、5-O-阿魏酰奎寧酸(峰3)、黃柏堿(峰6)、小檗堿(峰9)(見圖4)。《中國藥典》2020年版[1]將黃柏堿、小檗堿作為評價黃柏質量的指標性成分，其中小檗堿含量較高且出峰位置適宜，色譜峰較穩定，故最終選擇小檗堿作為參照峰S。

圖4 鹽黃柏及對照品HPLC圖

2.1.6 相似度評價

采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012.0版)對22批鹽黃柏飲片指紋圖譜進行疊加，進行相似度評價(見表2)。結果顯示，不同批次鹽黃柏飲片樣品的相似度均大于0.95，表明樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度較高，因此，該圖譜可作為鹽黃柏飲片的指紋圖譜。

表2 鹽黃柏指紋圖譜相似度

2.1.7 不同批次鹽黃柏差異性成分研究

2.1.7.1 主成分分析

將共有峰各色譜峰峰面積(見表3)相對于稱樣量量化，通過SPSS 20.0軟件對22批鹽黃柏飲片特征圖譜峰面積結果進行主成分分析。由表4、表5可知，前3個成分累積方差貢獻率為93.699%，基本可以反映鹽黃柏飲片樣品信息。特征圖譜主成分1貢獻率為61.811%，其中峰6(黃柏堿)、峰3(5-O-阿魏酰奎寧酸)在主成分1中貢獻率較大，峰2(3-O-阿魏酰奎寧酸)、峰4在主成分2中貢獻率較大，峰8在主成分3中貢獻率最大，因此可以認為峰2(3-O-阿魏酰奎寧酸)、峰3、峰4、峰6(黃柏堿)、和峰8是影響鹽黃柏飲片質量的重要因素。根據各主成分得分進行綜合評價(見圖5)，對22批鹽黃柏飲片質量進行排序，四川省得分均高于其他省份，說明四川省作為黃柏的道地產區具有獨特優勢。

圖5 綜合得分圖

表3 22批鹽黃柏指紋圖譜共有峰峰面積

表4 各主成分的特征值及方差貢獻率

表5 主成分分析結果

2.1.7.2 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

為尋找鹽黃柏飲片產生差異性的主要標記物，在主成分分析的基礎上，進一步采用SIMCA 14.1 軟件OPLS-DA分析上述兩組的差異性成分，歸一化方法選擇Par，默認自動建模(Autofit)，所得結果顯示R2X= 0.732，R2Y= 0.727，預測能力參數Q2為0.597，均大于0.5，說明預測結果良好。采用正交偏最小二乘法分析得到各特征峰的VIP值(見圖6)。結果顯示，峰6(黃柏堿)、峰9(小檗堿)VIP值均≥ 1.25，表明影響顯著，說明共有峰峰6(黃柏堿)、峰9(小檗堿)是A、B兩組的差異性成分，由于四川省為黃柏的道地產區，質量最佳，且四川省各批次的峰6(黃柏堿)和峰9(小檗堿)峰面積相對于稱樣量量化后均較其他省份高，因此可以認為峰6(黃柏堿)、峰9(小檗堿)可作為鹽黃柏飲片的質量控制的標志物。

采用置換檢驗(Permutation test)驗證OPLS-DA模型的可靠性，并設置置換次數為200。結果見圖7，A、B兩組回歸線在Y軸截距均< 0，表明模型未出現過擬合，OPLS-DA模型可靠。

2.2 網絡藥理學研究

2.2.1 候選化合物靶點預測

通過中藥系統藥理數據庫(TCMSP，https://tcmsp-e.com/)、PubChem Compound數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Therapeutic Target Database數據庫(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)、Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)、Pharm mapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)檢索3-O-阿魏酰奎寧酸、5-O-阿魏酰奎寧酸、小檗堿及黃柏堿等化合物，篩選化合物作用的靶點；并通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)將預測出的靶點蛋白轉換為對應的基因名。將各數據庫篩選出的靶點蛋白合并，除去重復靶點，最終得到與4個化合物相關的198個靶點蛋白。

2.2.2 靶點蛋白與蛋白互作(PPI)網絡分析

將獲得的198個靶點導入在線STRING軟件(https://cn.string-db.org/)，物種為人(homo sapiens)，設置最高置信度蛋白交互參數評分值> 0.9，隱藏網絡中斷開的節點，獲得PPI網絡圖(見圖8，degree值越大，節點越大)。利用Cytoscape軟件采用MCC計算方法對PPI進行拓撲分析，按得分值排名篩選出前15個關鍵靶點，分析結果見表6，這些靶點主要與小檗堿、黃柏堿、3-O-阿魏酰奎寧酸及5-O-阿魏酰奎寧酸有關。

圖8 PPI網絡圖

表6 關鍵靶點匯總

2.2.3 功能富集分析與通路分析

GO功能富集分析：利用Metascape數據庫(https://metascape.org/)對上述198個作用靶點進行GO功能富集分析，選擇P值< 0.01。結果得到生物過程(biological process，BP)條目419個，主要涉及的生物過程有：細胞對氮化合物的反應、循環系統、蛋白質磷酸化、對外來刺激的反應、MAPK級聯的正向調節等。細胞組成(cellular components，CC)條目有67個，主要富集在突觸前膜、受體、膜筏、磷脂酰肌醇3-激酶復合物、神經元、胞質核周區等區域。分子功能(molecular function，MF)條目有125個，主要富集在神經遞質受體的活動、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、兒茶酚胺結合、配體門控離子通道活性等功能。P值排名前20條目的BP、CC、MF見圖9。

圖9 GO功能富集分析柱狀圖

KEGG富集分析設置P值< 0.01，富集得到的主要涉及5-羥色胺能突觸途徑、鈣信號通路、刺激神經組織中的交互、癌癥通路、炎癥介質對TRP通道的調節等，由此可知，鹽黃柏是通過多靶點、多通路發揮協同作用的。按照P值從小到大的順序篩選前20條，繪制氣泡圖(見圖10)。

圖10 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.2.4 “成分-靶點-通路”網絡構建

將4種化學成分和分析得到的15個靶點以及KEGG通路富集分析得到的前20條通路導入Cytoscape軟件中構建“活性成分-靶點-通路”網絡，并進行可視化分析，如圖11。根據分析結果，以化合物-靶點-信號通路的連接度(degree)為參考，發現小檗堿及黃柏堿有較高的連接度，提示小檗堿(degree = 10)及黃柏堿(degree = 3)化合物可能是鹽黃柏的高活性成分；PRKCA(degree = 10)、MAPK14(degree = 6)、ADRB(degree = 5)、AR(degree = 4)、ROCK1(degree = 4)、ROCK2(degree = 4)、RAC1(degree = 4)、JUN(degree = 4)的連接度高于其他7個靶點，表明活性成分可能是通過PRKCA、MAPK14等多個靶點發揮作用。癌癥通路(pathways in cancer，degree = 12)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway，degree = 5)、cGMP-PKG信號通路(cGMP-PKG signaling pathway，degree = 3)、TRP通道對炎癥介質的調控(Inflammatory mediator regulation of TRP channels，degree = 3)4條通路的連接度高于其他通路，說明該4條通路可能是鹽黃柏潛在Q-maker的重要信號通路。

圖11 活性成分-靶點-通路網絡

3 討論與結論

黃柏的化學成分主要包括生物堿類、黃酮類、甾醇類化合物及揮發油等，其中生物堿類化合物是黃柏的主要有效化學成分。經研究發現，黃柏經鹽制后，其主要有效成分小檗堿及黃柏堿的含量都有所上升，經鹽炮制后有利于其生物堿成分的溶出[7]。本研究通過建立指紋圖譜指認了小檗堿、黃柏堿、3-O-阿魏酰奎寧酸及5-O-阿魏酰奎寧酸4個化學成分。經網絡藥理學分析，發現小檗堿及黃柏堿化合物可能是鹽黃柏的有效活性成分，并篩出潛在的8個核心靶點(PRKCA(degree = 10)、MAPK14(degree = 6)、ADRB(degree = 5)、AR(degree = 4)、ROCK1(degree = 4)、ROCK2(degree = 4)、RAC1(degree = 4)、JUN(degree = 4))，這些靶點可能作用于癌癥通路(Pathways in cancer)、及cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)、cGMP-PKG信號通路(cGMP-PKG signaling pathway)及TRP通道在炎性介質的調控(Inflammatory mediator regulation of TRP channels)中發揮重要作用，這與鹽黃柏的藥效滋陰降火可能具有一定相關性。因此，初步預測小檗堿、黃柏堿為鹽黃柏潛在的質量標志物成分。現代研究結果表明小檗堿具有抑菌、抗炎等藥理活性，可通過降低磷化ERK/JNK蛋白表達水平而產生抗炎作用，可通過抑制非小細胞肺癌中COP9信號轉導體5(CSN5)的脫泛素活性，減少細胞程序性死亡配體1(PD-L1)的表達，促進抗腫瘤免疫[8,9]，此外，小檗堿還具有降糖、降壓、增強腸管張力和振幅以及對前列腺的滲透作用[10,11]。黃柏堿可抑制ROS引起的炎癥通路上相關蛋白的表達，抑制IKK/NF-κB通路，還可顯著降低NF-κB的下游蛋白COX-2的表達，在體內外均有著較好的抗氧化及減輕炎癥損傷的作用[12,13]。奎寧酸衍生物在抗感染、抗心血管疾病及降糖等方面具顯著的活性[14]。阿魏酰奎寧酸類化合物是一種有效的酚類抗氧劑，其抗氧化能力要強于咖啡酸、對羥苯甲酸、阿魏酸、丁香酸等，且具有消除體內自由基、抑制突變和抗腫瘤作用等[15]。

中藥化學成分復雜多樣，中藥質量是中藥臨床安全有效的基礎，通過高效液相色譜檢測出中藥含有的所有化學成分，然后采用網絡藥理學的方法，能快速得到其含有的活性化合物，高效研究其中的活性成分，排除與主治無關或毒性成分，研究各組分對多靶點的活性，從而有效的節省時間和成本，提高中藥活性成分篩選的效率[16]。為明確鹽黃柏的質量標志物，本研究采用HPLC法對22批不同產地的鹽黃柏進行研究，建立了鹽黃柏的指紋圖譜，確認了9個共有峰，不同批次鹽黃柏指紋圖譜的相似度評價結果發現，相似度在0.958～0.999，表明22批鹽黃柏飲片化學成分相似度高，質量較為穩定均一。通過主成分分析結果可知，四川省飲片主成分綜合排名較其他省份高，說明四川省作為黃柏傳統道地產區的科學性；OPLS-DA分析發現小檗堿和黃柏堿是不同鹽黃柏飲片的重要差異性成分，再結合網絡藥理學可知小檗堿、黃柏堿是鹽黃柏發揮功效的主要活性成分。由此，可以確認小檗堿、黃柏堿是鹽黃柏潛在的質量標志物。

本研究采用HPLC結合化學計量法與網絡藥理學研究從有效性角度預測出小檗堿、黃柏堿為鹽黃柏的活性成分和質量標志物，為鹽黃柏的質量控制提供參考。