石柱單枝連“形、色、味、量”等級(jí)評(píng)價(jià)研究

冉繼春，秦偉瀚，譚春斌，陽 勇，張小梅，樵星芳，吉光見稚代

重慶市中藥研究院，重慶 400065

黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao或云連CoptisteetaWall.的干燥根莖[1]。自古以來即認(rèn)為四川為黃連主產(chǎn)地，《名醫(yī)別錄》記載：“黃連生巫陽及蜀郡大山”[2]。其中，石柱黃連最為著名，在黃連行業(yè)一直具有很高的地位[3]。有研究發(fā)現(xiàn)石柱不同栽培片區(qū)黃連不同部位主要生物堿含量均存在差異，且4種生物堿的含量高低順序均為：小檗堿>黃連堿>表小檗堿>巴馬汀[4]。目前，中藥材鑒別主要是以人工評(píng)價(jià)為主，缺乏客觀性量化指標(biāo)，重復(fù)性差，個(gè)體差異大，傳承困難[5]，電子舌、色度儀已廣泛應(yīng)用于中藥領(lǐng)域[6-9]。黃連在《中國藥典》中除長(zhǎng)度、直徑有明確的數(shù)字規(guī)定外，對(duì)顏色、味道均沒有可量化的具體標(biāo)準(zhǔn)。黃連在市場(chǎng)上流通中主要是按外觀大小來定價(jià)，且外觀等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)也日趨完善[10,11]。在經(jīng)驗(yàn)鑒別中黃連一直以“味苦、色黃”者為佳，為規(guī)范黃連市場(chǎng)流通方式，填補(bǔ)黃連在顏色、味道數(shù)字化評(píng)價(jià)方面的空白；該研究以電子舌技術(shù)表征“味苦”，電子眼表征“色黃”，挖掘黃連“色、味”的數(shù)字化信息特征，并劃分石柱黃連的“形、色、味、量”的數(shù)字化等級(jí)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

TS-5000Z電子舌(日本，INSENT公司)；傳感器詳細(xì)信息見表1。SA124S-CW分析天平(德國，artorius公司)；LC-20A 型高效液相色譜儀(日本，島津公司)；色譜柱Welch Ultimate?XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；KQ-500DB超聲波清洗機(jī)(中國，昆山市超聲儀器公司)；CM-5分光測(cè)色計(jì)(日本，KONICA MINOLTA)；TG-16K離心機(jī)(中國，四川蜀科儀器有限公司)；UPR-11-20L優(yōu)普純水機(jī)(中國，四川優(yōu)普超純科技公司)。對(duì)照品鹽酸小檗堿(批號(hào)110713-202015，中國食品藥品檢定研究院，純度：85.9%)；乙腈(色譜級(jí)，德國Merck公司)，其余試劑均為分析純；水為一級(jí)水。購買市售三個(gè)等級(jí)黃連樣品，產(chǎn)地均為重慶市石柱縣，經(jīng)本院吉光見稚代研究員鑒定均為毛茛科植物黃連的干燥根莖。樣品信息詳見表2。

表1 TS-5000Z電子舌傳感器檢測(cè)范圍

表2 石柱黃連藥材來源

1.2 方法

1.2.1 藥材前處理方法

取石柱單枝連置于烘箱55 ℃干燥8 h，至含水量<8%，打粉，過3號(hào)藥典篩，密封保存待用。

1.2.2 電子舌檢測(cè)方法

測(cè)試液制備：參比唾液：30 mmol/L氯化鉀+0.3 mmol/L酒石酸；負(fù)極清洗液：100 mmol/L鹽酸+30%乙醇；正極清洗液：10 mmol/L氫氧化鉀+100 mmol/L氯化鉀+30%乙醇。

供試品制備：取黃連粉末約0.1 g，精密稱定，加入10 mmol/L氯化鉀100 mL，攪拌溶解，超聲(40 kHz)提取10 min，過濾，所得濾液即為待測(cè)液。

1.2.3 顏色檢測(cè)方法

取黃連粉末約0.2 g，精密稱定，加一級(jí)水50 mL溶解，超聲(40 kHz)提取30 min，高速離心(8 000 r/min)10 min，取上清液1 mL加一級(jí)水稀釋至10 mL。采用分光測(cè)色計(jì)，液體測(cè)量，測(cè)定提取液的L*、a*、b*值；運(yùn)用程序軟件Spectra Magic Ver 2.50，測(cè)定前用一級(jí)水對(duì)儀器進(jìn)行空白校準(zhǔn)，觀察光源為D65透過光，觀察視角10°，起止波長(zhǎng)：360～740 nm，每個(gè)樣品測(cè)定5次后取平均值。

1.2.4 生物堿測(cè)定方法

色譜條件：流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g,再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0)，流速為0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量加甲醇溶解，配制為90.5 μg/mL的溶液。

供試品溶液的制備：取黃連粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)的混合溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻、過濾，即得。鹽酸小檗堿和黃連藥材的HPLC圖見圖1。

圖1 鹽酸小檗堿(A)和黃連藥材(B)的HPLC圖

1.2.5 外觀測(cè)定

稱取石柱單枝連藥材約50 g，計(jì)算單個(gè)重量值；每批藥材隨機(jī)抽取30個(gè)單枝連，用游標(biāo)卡尺測(cè)定其長(zhǎng)度、直徑，即得外觀性狀值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件進(jìn)行Pearson雙變量相關(guān)性分析和k平均值聚類分析；采用SIMCA軟件進(jìn)行PLS-DA偏最小二乘法判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石柱單枝連味道、顏色、生物堿與外觀檢測(cè)結(jié)果分析

黃連水提取液在AN0、BT0兩個(gè)傳感器的響應(yīng)值大，且均在無味點(diǎn)以上，從檢測(cè)結(jié)果可知藥材味覺中的苦味值很大，其中藥物苦味最大，鹽酸鹽類苦味次之。AE1、C00傳感器響應(yīng)值均在無味點(diǎn)以下，說明黃連的酸性苦味和澀味傳感器響應(yīng)值比基準(zhǔn)液更小，但是黃連溶液對(duì)C00、AE1感應(yīng)器刺激有響應(yīng)值，可以一定程度反映黃連在這兩個(gè)感應(yīng)器的味覺值，其響應(yīng)值為負(fù)數(shù)，感應(yīng)器刺激越大，響應(yīng)值的絕對(duì)值越大(見表3)。采用國際照明委員會(huì)(CIE)顏色系統(tǒng)[12]，黃連顏色檢測(cè)結(jié)果顯示(見表3)，L*、b*兩個(gè)色度方向均為正值；而a*值為負(fù)值，表示黃連水提取液顏色為黃綠色，且顏色鮮明。石柱黃連內(nèi)生物堿中鹽酸小檗堿含量最高(見表4)，三個(gè)等級(jí)石柱黃連的味道、顏色、生物堿含量和外觀性狀有所差異，其中，外觀性狀中的長(zhǎng)度值差異最大，三個(gè)等級(jí)藥材在外觀值上呈遞減分布，而味道、顏色、生物堿含量呈均勻分布。藥材僅僅按照外觀大小來劃分等級(jí)來定價(jià)、流通并不能滿足現(xiàn)實(shí)藥材的實(shí)際需求，將藥材按味道、顏色、生物堿含量、外觀值重新劃分等級(jí)，給黃連市場(chǎng)流通提供新的參考。

表3 石柱單枝連味道與顏色檢測(cè)結(jié)果

表4 石柱單枝連外觀性狀及生物堿檢測(cè)結(jié)果

2.2 石柱單枝連味道、顏色、生物堿、外觀的相關(guān)性分析

采用SPSS 22.0對(duì)石柱單枝連味道、顏色、生物堿含量、外觀性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，由表5的相關(guān)性結(jié)果可知，石柱單枝連的外觀值與味道值呈顯著相關(guān)性。其中重量、直徑與酸性苦味、酸性苦味回味呈顯著正相關(guān)，而直徑與這兩個(gè)味覺值相關(guān)性更為顯著；重量、長(zhǎng)度、直徑與澀味回味值均呈顯著負(fù)相關(guān)，說明石柱單枝連外觀性狀值越大澀味回味值越??；重量、直徑值越大，酸性苦味、酸性苦味回味味覺感應(yīng)越強(qiáng)。石柱單枝連生物堿含量與味道、顏色之間存在顯著相關(guān)性。巴馬汀、表小檗堿含量與藥物苦味呈顯著負(fù)相關(guān)；鹽酸小檗堿含量與澀味、澀味回味呈顯著正相關(guān)。說明巴馬汀、表小檗堿含量越高藥物苦味越淡；鹽酸小檗堿含量越高，澀味、澀味回味越濃。a*與巴馬汀含量呈顯著負(fù)相關(guān)；b*與鹽酸小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿含量均呈顯著正相關(guān)。說明黃連水提取液顏色越黃，生物堿含量越高，顏色越綠，巴馬汀含量越少。各味覺值之間也具有顯著相關(guān)性，酸性苦味回味與澀味回味呈顯著負(fù)相關(guān)；與酸性苦味顯著正相關(guān)，澀味回味與酸性苦味顯著負(fù)相關(guān)，與澀味顯著正相關(guān)，鹽酸鹽類苦味與澀味顯著正相關(guān)。石柱單枝連亮度值L*與長(zhǎng)度值呈顯著負(fù)相關(guān)，而顏色與味道并無顯著相關(guān)性。各相關(guān)系數(shù)及顯著水平詳見表5。

表5 石柱單枝連各指標(biāo)相關(guān)性分析

2.3 石柱單枝連聚類分析

采用SPSS 22.0分析軟件，將23批單枝連的外觀值、顏色值、味道值、生物堿含量值作為聚類指標(biāo)，進(jìn)行k-中心聚類分析，在參考其他標(biāo)準(zhǔn)[10,11]，以及市場(chǎng)需求和該批藥材外觀等級(jí)的基礎(chǔ)上，將本批樣品分為三類，其中26%為一類(6個(gè))，39%為二類(9個(gè))，35%為三類(8個(gè))，最終聚類結(jié)果見(見表6)。三個(gè)類別聚類組成員信息詳見表7，距離表示每個(gè)樣品與各自聚類中心的距離。

表6 石柱單枝連最終聚類分析

表7 石柱單枝連聚類成員信息

2.4 石柱單枝連“形、色、味、量”等級(jí)劃分

將聚類結(jié)果采用SIMCA 14.1統(tǒng)計(jì)軟件中PLS-DA模型分析，結(jié)果顯示，該模型能對(duì)聚類結(jié)果進(jìn)行區(qū)分，實(shí)現(xiàn)藥材分類鑒別，且解釋度較好。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得到分散點(diǎn)圖和變量重要性因子分布圖(見圖2、圖3)，以及12個(gè)投影重要性(VIP值)大于0.5的變量，其中長(zhǎng)度、b*值和藥物苦味這3個(gè)變量的VIP值大于1，長(zhǎng)度的VIP值高達(dá)2.759，b*值的VIP值為1.374 3，藥物苦味VIP值為1.22。VIP值大于0.5的變量取決于樣品的數(shù)量集，所以在樣品數(shù)量增加時(shí)這些變量影響程度也隨之增大。本次樣本中VIP值大于0.5的9個(gè)變量投影重要性的變量，按從小到大順序依次為：0.5

圖2 石柱單枝連PLS-DA分析

圖3 石柱單枝連PLS-DA的VIP變量投影

根據(jù)SPSS 22.0中k均值聚類分析法得到最終聚類中心值(見表6)。黃連的主要顏色表達(dá)值為黃色方向的b*值，主要味道值為藥物苦味和鹽酸鹽類苦味，主要外觀值為長(zhǎng)度和直徑，主要生物堿含量為鹽酸小檗堿，考慮到標(biāo)準(zhǔn)的可執(zhí)行性，所以去掉顏色值L*和a*；味道值酸性苦味回味和酸性苦味；外觀值的重量值；生物堿中巴馬汀的含量，這6個(gè)指標(biāo)的等級(jí)劃分。將石柱單枝連在PLS-DA模型分析中余下6個(gè)VIP值大于0.5指標(biāo)值劃分為三個(gè)等級(jí)，各指標(biāo)等級(jí)劃分詳見(見表8)。

表8 石柱單枝連等級(jí)劃分

一等級(jí)：?jiǎn)沃?，質(zhì)堅(jiān)，表面無毛須，無雜質(zhì)。按外觀或味道或顏色或含量計(jì)，允許12%石柱單枝連不符合一等級(jí)要求，但應(yīng)符合二等級(jí)要求，或在二等級(jí)容許度范圍之內(nèi)。

二等級(jí)：?jiǎn)沃?，質(zhì)堅(jiān)，表面無毛須，少量雜質(zhì)。按外觀或味道或顏色或含量計(jì)，允許12%石柱單枝連不符合二等級(jí)要求，但應(yīng)符合三等級(jí)要求，或在三等級(jí)容許度范圍之內(nèi)。

三等級(jí)：?jiǎn)沃?，質(zhì)堅(jiān)，表面無毛須，少量雜質(zhì)。按外觀或味道或顏色或含量計(jì)，允許12%石柱單枝連不符合三等級(jí)要求。

3 結(jié)論

目前中藥材品質(zhì)仍以化學(xué)成分作為主要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，中藥成分復(fù)雜，導(dǎo)致藥效作用也是內(nèi)在物質(zhì)相互作用下的整體過程，因此，中藥材整體性品質(zhì)評(píng)價(jià)尤為重要，“色、味”代表了藥材內(nèi)有共同屬性的物質(zhì)，對(duì)藥材具有是整體性評(píng)價(jià)意義。為了完善黃連藥材的鑒別與規(guī)格等級(jí)評(píng)價(jià)體系，以達(dá)到藥材品質(zhì)整體性評(píng)價(jià)，本研究利用現(xiàn)代化仿生技術(shù)，將黃連在傳統(tǒng)鑒別中標(biāo)志性特征“色黃、味極苦”用數(shù)字化方式表達(dá)，同時(shí)劃分顏色、味道數(shù)字化等級(jí)，實(shí)現(xiàn)中藥材感官描述數(shù)字化，傳承優(yōu)良?xì)v史經(jīng)驗(yàn)，為中藥材數(shù)字化等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)現(xiàn)整體性感官鑒別數(shù)字化奠定基礎(chǔ)。