特殊竹林土壤細菌群落結構及多樣性研究

蘇建如， 彭艷*， 江偉， 韋杰， 欒春光， 楊成， 鄧文楷， 鄧四情

(1. 貴州民族大學生態環境工程學院, 貴陽 550025; 2.四川省宜賓竹海酒業有限公司， 宜賓 644304; 3.中國食品發酵工業研究院國家酒類品質與安全國際聯合研究中心， 北京 100015)

土壤微生物是土壤物質循環的重要組成部分，極易受到外界環境影響，在林地生態系統中起著重要作用[1]。林地植被覆蓋和植被類型對土壤微生物群落結構和多樣性有重要影響[2]，林地植物群落多樣性關系到根際土壤提供微生物代謝的碳源種類的豐富度，決定著土壤微生物群落多樣性[3]。竹林植被單一，研究發現其林下土壤細菌主要來自變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)[4-5]，其中綠彎菌門是竹林土壤的特有優勢菌[6]。對毛竹林的研究顯示，竹林非根際土壤細菌數量低于其他林地植物[7-8]，以酸桿菌門和變形菌門為主[9]，主要包括嗜糖假單胞菌Zoogloea、Pelomonas、陶厄氏菌屬Thauera、根瘤菌屬Rhizobium等[10]；而雷竹林則以綠彎菌門、酸桿菌門和變形菌門為主[11]，即不同種類的竹林土壤細菌結構和多樣性存在較大差異。

活竹酒是將基酒注入毛竹幼竹竹腔內自然生長三到五年所得，竹子活化了基酒中的甲醇、雜醇油等雜質，竹酒發酵過程中吸收了竹體中對人體有益的黃酮等元素，決定了竹腔內酒體的二次形成過程和酒體品質的高低[12]。基酒注入竹體、發酵和取酒等過程會導致基酒滲入林下土壤，改變林下土壤尤其是根際土壤環境，進而影響土壤細菌群落結構和多樣性。利用竹林原位釀酒是一個很有商業價值的行為，目前鮮見對竹酒釀造區這種特殊環境中的竹林土壤細菌群落結構及其多樣性的報道，因此，現圍繞這種活動對竹酒釀造區這種特殊竹林環境中的土壤細菌群落的研究，既能豐富特殊環境或極端環境下土壤微生物分布數據資料，還能為竹酒企業酒體形成和發酵過程的質量控制提供環境數據支持。

1 材料和方法

1.1 采樣區概況

采樣區位于素有“天然氧吧”之稱的“中國最美十大森林”、國家AAAA級風景區——四川宜賓長寧縣蜀南竹海竹酒釀酒生態園。長寧縣位于104°44′22″E～105°03′30″E，28°15′18″N～28°47′48″N，地勢南高北低，南北長約60 km，東西寬30 km，海拔245.9～1 408.5 m，森林覆蓋率62.8%，竹林是境內植物一大特色,竹類品種中以楠竹、慈竹、硬頭黃竹、苦竹、斑竹為主產。長寧縣屬中亞熱帶濕潤性季風氣候，溫暖濕潤，雨熱同季，年均氣溫18.3 ℃，年均降雨量1 141.7 mm，日照時數987.6 h，年無霜期357 d。竹酒釀酒生態園占地150畝(1畝=667 m2)，園內有兩萬余棵竹，園區綠化率68%，其竹海酒傳統釀造技藝在2018年獲得“長寧縣非物質文化遺產”稱號，年產優質竹海酒超過6 000 t。

1.2 土壤樣本

以竹酒工業園區竹酒竹林幾何中心為核心，在竹林核心區(J1)、非竹林區(J2)和竹林邊緣區(J3)選取生境因子基本一致的樣點，以五點采樣法采集距竹根50～60 cm的0～15 cm表層土壤，去除土壤中的石頭、樹根等雜物，充分混勻后裝入無菌采樣袋中，置于-85 ℃保存用于高通量測序。

1.3 高通量測序及生物學信息統計分析

1.3.1 土壤微生物宏基因組提取及檢測

利用安倍 (MP)的土壤基因組DNA提取試劑盒(FastDNA?Spin Kit for Soil)提取土壤微生物元基因組，瓊脂糖凝膠電泳檢測元基因組完整性后，用微量核酸測量儀NanoDrop和Qbit對其DNA進行濃度測定，OD260/280=1.8，最后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的完整性。

1.3.2 構建元基因組文庫

以細菌16S V4區(引物為515F和806R)正向、反向引物的聚合酶鏈式反應(forward 、reverse primer PCR)擴增得到的元基因組為模板，使用Thermofisher 公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒構建高通量測序文庫，不同樣本通過反向引物的barcode加以區別。反應體系為50 μL，包括正反向引物各0.4 μmol/L，200 μmol/L的4種dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，1U的Taq DNA聚合酶(Kapa biosystems，Boston，US)。反應條件為預變性95 ℃ 6 min，共22個循環：95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物大小，并用QIAGEN MinElute?gel extraction kit (Cat.no. 28604, USA)回收試劑盒回收目的條帶。對每個文庫都進行了質量檢測，包括NanoDrop ND1000 的濃度檢測(Thermo Scientific, USA)和Real-time PCR(ABI 7300)的連接效率檢測，在中國食品發酵工業研究院釀酒中心Thermofisher IonS5TMXL測序平臺完成高通量測序。

2 結果與分析

2.1 稀疏曲線與OTUs數分析

由圖1可知，本研究中的樣本讀長(reads)均達到6萬條以上，測序樣本物種數目(OTUs)達到平臺期，測序數據能滿足檢測微生物多樣性的要求。

圖1 樣品OTUs數與種群相對豐度的稀疏曲線Fig.1 Sparse curve of sample OTUs and the relative population abundance

2.2 基于OTUs數的韋恩圖分析

由圖2可知，各樣本的OTUs總數表現為竹林邊緣區J3(1 514)>非竹林區J2(1 282)>竹林核心區J1(1 233)，且J3獨有OTUs數量(245)高于J2(162)、J1(153)，說明不同生境的交匯地帶土壤細菌基因總數和獨有基因數最高；竹林邊緣區J3與竹林核心區J1的共有OTUs數為64，但與非竹林區J2的共有OTUs數為253，這可能與竹林單一的生態環境有關，單一植物種類或會降低土壤細菌群落的群落多樣性。

圖2 基于OTUs的韋恩圖Fig.2 Venn diagram based on OTUs

2.3 物種分布情況和進化樹分析

2.3.1 門水平上的物種分布分析

門水平上的研究顯示，采樣區域土壤細菌OTUs豐度排行前10的微生物菌門主要來自酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatinonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)以及擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、厚壁菌門(Firmicuates)和己科河菌門(Rokubacteria)。在前6種優勢菌門中，放線菌門在全部樣品中總占比53.08%最高，其次是酸桿菌門18.57%和變形菌門10.39%，芽單胞菌門、綠彎菌門、疣微菌門總占比依次為7.38%、6.46%、4.12%。

為分析門水平上樣本間優勢物種的差異，選取平均豐度排名前10的物種生成了Ternaryplot三元相圖。由圖3可以看出，樣本的優勢種群主要是酸桿菌門、變形菌門、放線菌門次之、綠彎菌門的細菌等；放線菌門距竹林核心區J1更近，在J1中豐度較高；非竹林區J2中變形菌門、酸桿菌、綠彎菌門豐度較高；與J1、J2相比，竹林邊緣區J3中綠彎菌門豐度較低，變形菌門豐度高于J1低于J2。

圖3 門水平上排行前10的優勢物種三元相圖Fig.3 The ternary plot of the Top 10 dominant species at the phylum level

為了進一步研究樣本間的相似性，在考慮物種豐度變化的基礎上，從進化角度對樣本進行了兩兩比較，完成了基于Weighted Unifrac距離矩陣的聚類分析(圖4)。由圖4可知：竹林核心區J1與竹林邊緣區J3樣本細菌群落結構較為相似，合為一類，二者與非竹林區J2差異較大，說明竹林土壤微生物有相對獨立和獨特的微生物群落；排行前10的細菌菌門的OTUs總數表現為竹林核心區J1高于J3、J2，即土壤細菌豐度從竹林核心區向非竹林區逐漸遞減；從細菌群落結構來看，竹林核心區J1以放線菌門(Actinobacteria)占比最高，酸桿菌門(Acidobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)次之；竹林邊緣區J3以變形菌門占比最高，其次是放線菌門和酸桿菌門；非竹林區J2以酸桿菌門占比最高，其次是變形菌門和其他類。

圖4 門水平上的Weighted Unifrac距離矩陣聚類分析Fig.4 Cluster analysis of Weighted Unifrac distance matrix at the phylum level

2.3.2 屬或種水平上的物種分布分析

為了更為清晰地反映土壤樣品間細菌群落結構的微觀變化，以相同的方法分析了土壤微生物屬或種水平上細菌菌群的結構和豐度(表1)。研究結果顯示，竹林核心區J1主要以酸桿菌門酸棲熱菌屬為主，放線菌門的科維粟屬、嗜酸微生物屬、蓋萊萊屬也是其優勢菌群。竹林邊緣區J3的優勢菌群則包括變形菌門的鞘氨醇單胞菌屬、酸桿菌門苔蘚桿菌屬、芽單胞菌門金雀花屬、疣微菌門烏代桿菌屬及綠彎菌門綠彎菌屬。對非竹林區J2而言，各類菌群豐度均較低，酸桿菌門苔蘚桿菌屬成為其優勢菌群。隨著樣本從非竹林區逐漸接近竹林核心區，個別微生物菌群的豐度發生了顯著性變化。

表1 屬或種水平上排行前10的細菌豐度差異Table 1 The top 10 bacterial abundance differences at the genus or species level

2.3.3 屬水平上的物種進化樹分析

選擇屬水平上的Top 100代表序列進行物種進化樹分析(圖5)，所構建的系統發育樹的分支的顏色表示其對應的門，每種顏色代表一個門。結果顯示它們主要來自共有菌屬，即在屬水平上細菌群落多有著共同起源；其在群落多樣性和豐度上存在部分交叉，表明彼此間存在一定的進化相關性。

圖5 屬水平上Top100物種系統發生關系Fig.5 Phylogenetic relationship among Top100 species at the genus level

2.4 樣本內復雜度分析

為反映樣本內部細菌群落的豐富度、多樣性及組間差異，進行α群落多樣性分析(表2)。由表2可知，三個樣本Goods Coverage指數均接近于1，表明樣本測序深度非常合理，已基本覆蓋了所有物種；非竹林區J2的Shannon指數、Simpson指數均低于J3、J1，表明竹林邊緣區J3的群落多樣性、均勻性較高、J2較低；由Chao1指數、ACE指數可知，竹林邊緣區J3的物種豐富度、稀有物種數量遠高于J2、J1；OTUs數提示竹林邊緣區J3種群豐富，基于進化距離和物種豐度的PD譜系多樣性指數也顯示，J3有著更大的群落物種多樣性，群落內物種較為復雜。

表2 樣本內α群落多樣性分析Table 2 Analysis of α diversity within-community

2.5 樣本間比較分析

為分析不同樣本的細菌群落構成，根據樣本OTUs豐度信息，選用 Weighted Unifrac(加權距離)、Unweighted Unifrac(非加權距離)兩個距離指標來計算兩個樣本間的距離，并描述其組間差異(圖6)，方格中的數字是兩樣本間的相異系數，同一方格上下兩個值分別代表Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離。

由圖6可知，非竹林區J2與竹林核心區J1的變異系數最大(0.36)，其次是與竹林邊緣區J3的變異系數(0.265)，J1與J3之間變異系數最小，說明非竹林區與竹林邊緣區、竹林核心區在細菌群落結構方面存在的差異較大，竹林生態系統具有獨特的微生物群落結構。

圖6 β多樣性指數熱圖Fig.6 Heat map of β diversity index

3 討論

3.1 酸桿菌的分布及影響因子

酸桿菌門在土壤中的數量占細菌總量的20%左右[13]，在16SrRNA 基因庫中比例高達30%～50%，僅次于變形菌門[14]，有的甚至高達 65%[15]。本文研究也發現，釀酒環境的竹林核心區J1中放線菌門數量最多，但酸桿菌門的酸棲熱菌屬才是其優勢菌屬，豐度達到39.26%。相關研究顯示，杉木林、馬尾松林等森林土壤細菌中酸桿菌門也是優勢菌群(32.68%～49.17%)[16]，且中、老林的平均豐度明顯高于幼林[17]。酸桿菌的多樣性及其分布與土壤類型也有一定關系，不同的酸桿菌屬在不同林地類型土壤中相對豐度也不同。對7種常見樹林根際土壤的研究發現，其細菌多樣性較高，常綠樹根際土和落葉樹根際土酸桿菌亞群分布存在差異[18]。當土地利用類型改變，如原始森林轉變為農田后，酸桿菌相對含量由28%降到16%[19]。對農田的研究顯示，酸桿菌門平均相對豐度為24.11%，是僅次于變形菌門(29.93%)的土壤第二大細菌類群[20]。總體上，酸桿菌門細菌對不同環境有很強適應能力，在自然環境中廣泛分布，其影響因子主要包括pH[21-22]、土壤有機碳含量、土壤 C/N[27]、地表植被類型、海拔高度[23]、大氣二氧化碳含量和土壤含氮量等[24]，在不同生境之間以及同一生態環境不同區域之間其群落結構都存在顯著性差異[12，25]，可能在各生態系統中均具有獨特的驅動作用及生態功能[25]。

3.2 特殊竹林土壤與其他竹林土壤細菌群落結構比較

從門水平上看，竹林土壤細菌群落的優勢菌門具有高度一致性[6]，優勢菌群的構成比例差異不明顯。本文研究中竹林核心區J1竹林種類為毛竹，因此其與自然生長毛竹林[1，11，26]和其他竹林[7]的土壤細菌優勢菌門豐度相比(表3)，放線菌門占比較高，而其他竹林土壤變形菌門占比較高。

表3 特殊竹林土壤與自然生長竹林土壤細菌優勢菌門豐度比較Table 3 Comparison of abundance of dominant bacteria in special bamboo forest soil and natural bamboo forest soil

從屬水平上看，本研究中竹林核心區J1主要以酸桿菌門酸棲熱菌屬為主，放線菌門的科維粟屬、嗜酸微生物屬、蓋萊萊屬也是其優勢菌群；竹林邊緣區J3的優勢菌群則包括變形菌門的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、酸桿菌門苔蘚桿菌屬(Bryobacter)、芽單胞菌門金雀花屬(Gemmatimonas)、疣微菌門烏代桿菌屬(CandidatusUdaeobacter)及綠彎菌門綠彎菌屬(Chloroflexi)；而自然生長的毛竹林地土壤細菌優勢菌群[12]主要包括不動桿菌屬(Acinetobacter)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、酸熱菌屬(Acidoth-ermus)、羅爾斯通菌屬(Ralstonia)和慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)。上述研究表明活竹酒釀酒環境對竹林土壤產生了一定的影響，導致土壤細菌群落結構發生較大改變。

竹林與其他林地土壤細菌群落種類相差較小，豐度最高的前三優勢菌門均為變形菌門、放線菌門和酸桿菌門(表4)，但綠彎菌門是竹林特有優勢菌門[6]。對油茶林土壤微生物多樣性的研究發現，油茶土壤酸桿菌門、變形菌門、放線菌門和綠彎菌門相對豐度之和超過80%[27]。白樺、樟子松、興安落葉松和偃松的根圍土壤中，變形菌門、酸桿菌門和放線菌門為主要優勢菌門，相對豐度之和均高于 75.0%[28]。本文研究中處于釀酒環境的竹林核心區J1土壤4種菌門相對豐度之和達81.6%，除綠彎菌門以外的3種菌門相對豐度之和為70.8%，放線菌門相對豐度高于其他植被類型，而變形菌門相對豐度相對較低。

表4 特殊竹林土壤與其他森林土壤細菌優勢菌門豐度比較Table 4 Comparison of bacterial dominant phyla abundance between special bamboo forest soil and other forest soil

4 結論

(1)綠彎菌門是竹林特有優勢菌門，活竹酒釀造環境使得竹林土壤放線菌門而非變形菌門數量最多。竹林核心區土壤細菌數量低于非竹林區、竹林邊緣區，或與竹林單一生境有關。

(2)竹林核心區酸桿菌門的酸棲熱菌屬數量最多，其豐度達到39.26%。竹林與非竹林區之間的交界區域群落物種豐富度、稀有物種數量較高，群落內物種較為復雜，優勢菌主要來自變形菌門和綠彎菌門，但其細菌群落結構仍與竹林土壤相似。

(3)非竹林區的各類菌群豐度均較低，以酸桿菌門苔蘚桿菌屬為主，與竹林核心區、竹林邊緣區在細菌群落結構方面存在的差異較大，活竹酒釀造使得竹林生態系統具有獨特的微生物群落結構，對揭示竹酒釀造區土壤微生物的響應機制具有一定意義。