環介導等溫擴增技術快速檢測糞便樣本艱難擬梭菌的 臨床應用

王詩淇， 李荷楠， 劉井波， 王占偉， 王知任， 遲大利， 王 輝

[1. 北京大學人民醫院檢驗科，北京 100044；2. 復星診斷科技（上海）有限公司參考檢測中心，上海 200444]

艱難擬梭菌是一種有芽孢、無莢膜、有鞭毛的革蘭陽性專性厭氧桿菌，廣泛存在于土壤、人類和其他動物的腸道中。隨著高毒力和多重耐藥艱難擬梭菌的出現，醫院感染暴發的風險增加?？焖贆z出艱難擬梭菌，將其從醫院環境中根除，同時隔離有癥狀的艱難擬梭菌感染患者是阻止艱難擬梭菌芽孢擴散、有效預防醫院感染的重要措施。目前，環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）因操作方便、反應時間短、無需額外購買特殊設備等優勢，已被應用于多種病原體感染的檢測中[1-3]。 本研究擬比較LAMP法與細菌培養法、艱難擬梭菌毒素法快速檢測糞便樣本中艱難擬梭菌的 差異。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2021年6—8月北京大學人民醫院住院患者臨床送檢剩余糞便樣本132例，其中54例血液科患者樣本。本研究經北京大學人民醫院倫理委員會審批通過（2019PHB063）。

1.2 方法

1.2.1 艱難擬梭菌毒素檢測 取200 μL液體糞便樣本或200 mg固體糞便樣本，加入1 000 μL樣本稀釋液（pH值7.2的Tris緩沖液、50%小牛血清、去污劑、防腐劑），用渦旋振蕩器徹底混勻，13 680×g離心5 min，分離上清液。取300 μL上清液，采用Mini VIDAS全自動熒光酶標免疫分析儀（法國生物梅里埃公司）及配套艱難擬梭菌毒素A/B檢測試劑盒（酶聯免疫熒光法）檢測。剩余樣本用于LAMP檢測。

1.2.2 艱難擬梭菌核酸提取 取蛋白酶K（北京索萊寶公司）20 μL，內參反應液[復興診斷科技（上海）有限公司] 5 μL，再加入300 μL制備好的糞便樣本稀釋上清液，采用TANBead E13200核酸提取儀（臺灣圓點奈米技術開發有限公司）提取艱難擬梭菌核酸。嚴格按照儀器和試劑說明書要求進行操作。

1.2.3 細菌培養及鑒定 （1）艱難擬梭菌培養。將糞便樣本分別接種于環絲氨酸頭孢西丁果糖瓊脂（cycloserine-cefoxitin-fructose agar，CCFA）平板（英國OXOID公司）和血平板（美國ThermoFisher Scientific公司），放入厭氧產氣袋（法國生物梅里埃公司），置于5% CO2培養箱中，35 ℃培養48 h，采用Autoflex speed質譜儀（德國布魯克公司）鑒定可疑菌落。（2） 沙門菌和志賀菌培養。 將糞便樣本分別接種于SS平板、麥康凱平板（美國ThermoFisher Scientific公司），置于5% CO2培養箱中，35 ℃環境下培養24～48 h后觀察菌落；分離、純化可疑菌落后，采用VITEK 2 Compact自動鑒定藥敏儀（法國生物梅里埃公司）進行菌種鑒定；同時進行多價血清凝集試驗（沙門菌屬和志賀菌屬診斷血清購自寧波天潤公司）。

1.2.4 L A M P法的建立 通過L A M P引物設計軟件Primer Explorer（http：//primerexplorer.jp/e/）設計引物，包括外引物F3（5'-GTGGGGAGCAAACAGGATT-3'）、B3（5'-TCTTCGCGTTGCTTCGAATT-3'），內引物FIP（5'-CGTTAGCTGCGGCACCGAAGAGTCCACGCTGTAAACGATG-3'）、BIP（5'-CCTGGGAAGTACGCTCGCAAACATGCTCCGCTACTTGTG-3'），環引物LF（5'-GGTAACCCCCGACACCTAGTAC-3'）、LB（5'-CTCAAAGGAATTGACGGGGAC-3'）。LAMP反應體系為25 μL，包括14 μL艱難擬梭菌反應液[復興診斷科技（上海）有限公司]、 1 μL Bst DNA聚合酶[復興診斷科技（上海）有限公司]、10 μL核酸提取液，反應溫度為 63 ℃[4]；反應時間為30 min。以無菌0.9%NaCl溶液為陰性對照，以循環閾值（cycle threshold，Ct）≤10.0為陽性。

1.2.5 LAMP法性能評價 （1）特異性評價。 將糞便樣本分別接種于血平板、SS平板和麥康凱平板，5% CO2培養箱中35 ℃培養24～48 h后觀察菌落，采用VITEK 2 Compac自動化鑒定藥敏儀和Autoflex speed質譜儀進行菌種鑒定，鑒定結果用于評價LAMP法的特異性。（2）靈敏度評價。①核酸提取。取3 mL經高壓處理后的無菌0.9%NaCl溶液，將艱難擬梭菌標準菌株（ATCC 9689，購自美國典型培養物保藏中心）制備成0.5麥氏濁度單位菌懸液，濃度相當于 108CFU/mL；取1 mL菌懸液，加入Eppendorf管中， 13 680×g離心5 min，棄上清液，加入300 μL無菌純水，充分混勻，用核酸提取試劑盒提取艱難擬梭菌標準菌株（ATCC 9689）核酸，具體操作步驟與糞便樣本艱難擬梭菌核酸提取相同。②稀釋。先在5個Eppendorf管中分別加入90 μL無菌純水，然后在第1個Eppendorf管中加入10 μL 0.5麥氏濁度菌液，充分混勻后取10 μL加入第2個Eppendorf管，用同樣的方法稀釋到第5管，稀釋后的5個Eppendorf管中的細菌濃度分別為107、106、105、104和103CFU/mL，用于LAMP法靈敏度評價。每個濃度進行8個平行測試。

2 結果

2.1 132份糞便樣本LAMP檢測結果

132份糞便樣本均進行了LAMP檢測。132份糞便樣本中，有110份進行了艱難擬梭菌毒素測定，其中10份（9.09%）艱難擬梭菌毒素檢測為陽性，8份（7.27%）為弱陽性；有99份糞便樣本進行了艱難擬梭菌培養，其中11份（11.11%）陽性；有113份糞便樣本進行了腸道致病菌沙門菌和志賀氏菌培養，僅1份樣本檢出腸炎沙門菌。54份血液科患者的糞便樣本一般細菌培養結果顯示，有43份樣本培養出至少1種細菌，6份樣本培養出真菌，3份樣本同時培養出細菌和真菌，2份樣本無細菌生長。

2.2 LAMP法特異性評價結果

對未培養出艱難擬梭菌、培養出其他種類細菌或真菌的37份糞便樣本進行LAMP檢測，結果顯示，有20份樣本分離出1種細菌，8份樣本分離出2種細菌，6份樣本分離出1種真菌，3份樣本同時分離出1種細菌和1種真菌；37份樣本共檢出48株菌，LAMP的Ct值均＞10.0。見表1。

表1 LAMP法特異性評價試驗結果

2.3 LAMP法靈敏度評價結果

以5個稀釋度的艱難擬梭菌標準菌株（ATCC 9689）為模板，進行LAMP法靈敏度試驗，8次重復試驗結果顯示，隨著核酸濃度的降低，擴增曲線的時間逐漸延長，當濃度降到 104CFU/mL時，平均Ct值為12.5，最終確定LAMP法靈敏度為105CFU/mL。

2.4 LAMP法與細菌培養法、艱難擬梭菌毒素法檢測結果的比較

132份糞便樣本中，LAMP 法檢測陽性18例，陰性114例，陽性檢出率為13.64%。LAMP法陽性檢出率高于培養法（11.11%）（χ2=18.74，P＜0.05）和艱難擬梭菌毒素法（9.09%）（χ2=35.94，P＜0.05）。艱難擬梭菌陽性樣本中，LAMP法與細菌培養法的一致率為63.64%；與艱難擬梭菌毒素法的一致率為60%。艱難擬梭菌毒法素弱陽性樣本中，LAMP法與艱難擬梭菌毒素法的一致率為50%。見表2、表3。

表2 LAMP法與細菌培養法的比較 例

表3 LAMP法與艱難擬梭菌毒素法的比較 例

2.5 LAMP法檢測艱難擬梭菌的效能

以細菌培養法為金標準，ROC曲線分析結果顯示，LAMP法判斷艱難擬梭菌陽性的曲線下面積（95%可信區間）為0.737（0.596～0.878），最佳臨界值（Ct值）為10.0。見圖1。

圖1 LAMP法檢測艱難擬梭菌的ROC曲線

3 討論

本研究結果顯示，LAMP法檢測艱難擬梭菌的陽性率（13.64%）高于細菌培養法（11.11%），提示采用LAMP法檢測糞便樣本可提高病原體的檢出率。LAMP法根據不同菌種的高度保守區多個位點設計引物，靈敏度較高[5]。LAMP法檢測原理與細菌培養法不同，LAMP法通過擴增來檢測病原菌靶基因，如果病原體的基因數達到檢測限度，無論病原體是否為活體，結果都是陽性；而培養法要求病原菌必須是活菌，只有優勢菌群才能被培養出 來[6]。另外，消化道樣本具有復雜性，艱難擬梭菌對培養條件的要求高，也是導致培養分離率低的原因之一。有研究結果顯示，10份培養法陰性LAMP法陽性樣本中，艱難擬梭菌毒素法陽性有5份、弱陽性有2份，提示細菌培養可能會漏檢艱難擬梭菌，如果樣本未能及時接種，培養結果可能會出現假陰性[7]；另外，如患者入院前使用了抗菌藥物，也會導致細菌培養陰 性[8]。有研究發現，在核酸提取過程中，可能會受到細胞壁和芽孢的影響，艱難擬梭菌屬于革蘭陽性專性厭氧芽孢桿菌，革蘭陽性菌細胞壁較厚，含15～50層肽聚糖；此外，芽孢對熱力、干燥、輻射、化學消毒劑等因素均有強大的抵抗力，艱難擬梭菌核酸的提取可能會受到以上因素的影響，提取效率有所減低[9]。如果樣本中病原體核酸濃度低，達不到最低檢測限，也會導致LAMP法檢測結果和培養法結果不同。雖然分子技術被認為是臨床診斷艱難擬梭菌感染敏感的方法之一，但在使用這種方法時，似乎不可避免地會漏掉一些培養陽性的病例。有研究發現，2 308份樣本中，有50份培養法陽性，而聚合酶鏈反應結果為陰性，原因可能是樣本中艱難擬梭菌的核酸水平低于聚合酶鏈反應的檢測下限所致，提示檢測限可能影響分子生物學方法檢測艱難擬梭菌的結果[10]。目前，臨床檢測艱難擬梭菌主要依靠細菌培養法和毒素免疫學檢測，這些方法耗時長、成本高，對檢測人員的要求高，而LAMP法可快速篩查出糞便樣本中的艱難擬梭菌。

本研究也存在一定的局限性，即LAMP法不能檢測病原菌的毒性，不能區分攜帶者和感染者。只有攜帶了含有艱難擬梭菌腸毒素TcdA和/ 或細胞毒素TcdB的艱難擬梭菌才能引起感 染[11]。但有研究發現，無癥狀攜帶者是艱難擬梭菌在社區和醫院環境中的重要感染源[12-13]，因非產毒株可在人體內定植，所以單純檢測病原體的方法與毒素檢測方法相結合，才能更好地評估艱難擬梭菌狀態。另外，本研究納入的艱難擬梭菌陽性樣本較少，后續將收集不同等級醫院更多數量的陽性樣本，進一步對LAMP法檢測艱難擬梭菌的性能進行評價。

綜上所述，艱難擬梭菌的3種檢測方法（厭氧培養、毒素法、LAMP）比較，LAMP法特異性強，反應時間短，10 min即可判讀結果，且操作簡單，無需特殊設備，成本低，適合現場快速檢測，可用于醫療資源相對匱乏的基層機構，也可應用于醫院感染控制和艱難擬梭菌的早期篩查[14]。采用LAMP法快速檢測糞便中的艱難擬梭菌，可有效監測艱難擬梭菌感染，在重癥患者和血液病患者感染預警中有一定的價值。

致謝：感謝河北燕達醫院對第一作者王詩淇的支持。