表達(dá)人源PD-L1的4T1細(xì)胞系的構(gòu)建

王 迪， 王潤(rùn)楊， 楊俊寒， 張 樂(lè)， 胡 翰， 汪 洋， 劉濱磊

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院， 湖北 武漢 430068)

PD-L1又稱(chēng)程序性死亡配體1，是共刺激分子B7家族成員之一，由CD274基因編碼。PD-L1分子不僅廣泛表達(dá)于活化T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等[1]，在許多腫瘤細(xì)胞中也高表達(dá)，如肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤細(xì)胞等[2-3]。PD-L1與PD-1(程序性死亡受體1)結(jié)合傳遞免疫抑制信號(hào)，抑制T、B細(xì)胞增殖分化和細(xì)胞因子等的產(chǎn)生[4]。PD-1/PD-L1途徑在誘導(dǎo)維持外周免疫耐受、自身免疫疾病、移植排斥反應(yīng)、腫瘤免疫疾病等中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PD-1/PD-L1免疫療法在針對(duì)晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌的部分臨床試驗(yàn)中顯示出了良好的療效[5]。但是PD-L1的過(guò)表達(dá)是否與乳腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)仍存在爭(zhēng)議[6]。為更好地了解PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的作用和機(jī)制，本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人源hPD-L1的單克隆細(xì)胞株，并將構(gòu)建成功的4T1-hPD-L1細(xì)胞系皮下植入BALB/c小鼠的右側(cè)背部，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。

1 實(shí)驗(yàn)材料

hPD-L1基因片段，金斯瑞生物科技股份有限公司；PBDP轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒，System Biosciences公司；小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞，北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞資源中心；細(xì)胞培養(yǎng)所用DME/F-12培養(yǎng)基，美國(guó)HyClone公司；胎牛血清，四季青；嘌呤霉素，德國(guó)Biofroxx公司；抗人源PD-L1鼠單克隆抗體，美國(guó)BD公司；Lipofactamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒，Thermo Fisher Scientific公司；質(zhì)粒小提試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司。BALB/c小鼠，湖北省疾病控制中心。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 4T1細(xì)胞嘌呤霉素敏感性實(shí)驗(yàn)

收集T-75cm2培養(yǎng)瓶中的4T1細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種在12孔板中，于37℃恒溫、5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2 天更換培養(yǎng)基，避光加入不同濃度梯度的嘌呤霉素。連續(xù)7 d觀察記錄細(xì)胞存活率，以4 d內(nèi)殺死孔板中所有細(xì)胞的最低嘌呤霉素濃度為最佳篩選濃度[7]。

2.2 質(zhì)粒提取

hPD-L1基因片段由金斯瑞公司合成。冰上解凍大腸桿菌感受態(tài)DH5α，加入2 μL質(zhì)粒，冰上靜置10 min，42℃水浴熱激90 s，冰上靜置5 min，涂LB-Amp平板，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。第2 天挑取單菌落，接種在LB液體培養(yǎng)基中(含Amp抗性)，置于37℃搖床200 r/min振蕩培養(yǎng)14 h。參照諾唯贊質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行質(zhì)粒提取。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1 d，將4T1細(xì)胞以2×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于12孔板。待細(xì)胞匯合度至85%，更換培養(yǎng)基。參照Lipofactamine3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。取兩個(gè)1.5 mL EP管，A管中加入95 μL DME/F-12培養(yǎng)基，5 μL P3000，20 μL PBDP-hPD-L1質(zhì)粒和5 μL PBDP轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒(質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒質(zhì)量比為4∶1)；B管中加入125 μL DME/F-12培養(yǎng)基和3.75 μL Lipofactamine3000[8]。A、B管溶液混合，室溫孵育10 min，加入細(xì)胞孔板中，置于37℃恒溫、5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞GFP表達(dá)情況，加入嘌呤霉素連續(xù)篩選7 d，每隔2～3 d更換培養(yǎng)基并補(bǔ)加嘌呤霉素。

2.4 單克隆細(xì)胞獲取

收集經(jīng)嘌呤霉素篩選后的細(xì)胞，稀釋至500個(gè)/mL。取96孔板，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的DME/F-12培養(yǎng)基)和2 μL細(xì)胞懸液，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃恒溫、5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7 d后，在倒置熒光顯微鏡下觀察并記錄只有單個(gè)細(xì)胞團(tuán)且發(fā)綠色熒光的孔。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%，消化，依次擴(kuò)大培養(yǎng)至12孔板、6孔板。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4T1-hPD-L1細(xì)胞純度

收集1×106個(gè)培養(yǎng)在6孔板中的4T1-hPD-L1細(xì)胞，取野生型4T1細(xì)胞作為空白對(duì)照，加1 mL PBS洗1次，加入5 μL偶聯(lián)APC熒光染料的抗人源PD-L1鼠單克隆抗體，室溫避光孵育25 min。加1 mL PBS洗2次，用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。用FlowJo V10軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

2.6 4T1-hPD-L1成瘤性實(shí)驗(yàn)

從湖北省疾控中心購(gòu)買(mǎi)3只6周齡雌性的BALB/c小鼠。將4T1-hPD-L1細(xì)胞稀釋至1×107個(gè)/mL，在每只BALB/c小鼠右側(cè)背部皮下注射1×106個(gè)4T1-hPD-L1細(xì)胞(100 μL)[9]。7 d后觀察成瘤性，連續(xù)觀察40 d。用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠腫瘤體積大小，計(jì)算公式為：V=1/2×長(zhǎng)徑×短徑×短徑。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 PBDP-hPD-L1質(zhì)粒構(gòu)建

PBDP-hPD-L1轉(zhuǎn)座子載體質(zhì)粒序列全長(zhǎng)8102 bp。人源hPD-L1序列在NCBI上查找獲得(Gene ID: 29126)。hPD-L1基因由CMV強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。CopGFP和PuroR基因由T2A肽連接。連接后的序列由EF-1α核心啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄(5’LTR包含增強(qiáng)子等調(diào)控原件)，二者共享同一個(gè)polyA信號(hào)，由此構(gòu)建PBDP-hPD-L1-GFP質(zhì)粒。

3.2 4T1細(xì)胞轉(zhuǎn)染

PBDP-hPD-L1質(zhì)粒和PBDP轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染4T1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，在倒置熒光顯微鏡下能觀察到細(xì)胞發(fā)綠色熒光。

圖1 PBDP-hPD-L1質(zhì)粒圖譜 圖 2 PBDP-hPD-L1轉(zhuǎn)染4T1 48h

3.3 4T1-hPD-L1細(xì)胞挑取單克隆、擴(kuò)培

將4T1-hPD-L1細(xì)胞稀釋至500個(gè)/mL，在96孔板中培養(yǎng)7 d后，可在倒置熒光顯微鏡下觀察到單個(gè)且?guī)в芯G色熒光的細(xì)胞團(tuán)。將細(xì)胞擴(kuò)培(圖3)。

圖3 4T1-hPD-L1單克隆細(xì)胞擴(kuò)培

3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4T1-hPD-L1單克隆細(xì)胞

流式檢測(cè)對(duì)照組4T1細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組4T1-hPD-L1細(xì)胞中GFP和PD-L1的表達(dá)量，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞雙陽(yáng)性率為97.0%(圖4)。

圖4 4T1-hPD-L1單克隆細(xì)胞GFP和PD-L1表達(dá)

3.5 4T1-hPD-L1腫瘤模型建立

將4T1-hPD-L1細(xì)胞皮下植入BALB /c小鼠右側(cè)背部，3只小鼠背部均長(zhǎng)出瘤塊，14 d后體積生長(zhǎng)至100 mm3，成瘤率達(dá)100%。繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(圖5)，腫瘤體積隨著時(shí)間增長(zhǎng)而增加。

圖5 BALB/c皮下腫瘤生長(zhǎng)曲線

4 結(jié)束語(yǔ)

PD-L1通過(guò)與PD-1結(jié)合抑制T細(xì)胞功能，從而使腫瘤發(fā)生免疫逃逸，阻斷PD-1/PD-L1通路成為目前免疫治療的研究熱點(diǎn)[10]。目前國(guó)內(nèi)外已有3種PD-L1單克隆抗體藥物被批準(zhǔn)上市，可用于治療非小細(xì)胞肺癌和尿路上皮癌等癌癥。但PD-L1抗體藥物并非對(duì)所有患者有效，原因可能和原發(fā)性耐藥、繼發(fā)性耐藥、腫瘤突變負(fù)荷、患者體內(nèi)PD-L1表達(dá)量不同等相關(guān)[11]。

轉(zhuǎn)座子是一段可插入宿主基因組內(nèi)并改變位置的DNA序列。通過(guò)將外源基因引入到特定的細(xì)胞、組織中，轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于基因敲除、誘導(dǎo)突變、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等實(shí)驗(yàn)研究中[12]。通過(guò)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建PD-L1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，可為研究PD-L1抗體藥物提供參考。

本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體將PBDP-hPD-L1質(zhì)粒和PBDP轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)入小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞中，在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率；經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選、有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞系；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中GFP和PD-L1雙陽(yáng)性率為97.0%，成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GFP和人源hPD-L1的鼠乳腺癌4T1-hPD-L1細(xì)胞系。將構(gòu)建成功的細(xì)胞系皮下植入BALB/c小鼠背部，建立乳腺癌皮下腫瘤模型。此模型的成功構(gòu)建為研究PD-L1抗體藥物提供了穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究PD-L1分子的功能提供參考。