超臨界CO2 萃取化橘紅精油工藝研究

郭星潔，劉惠青，馬兆成*

（1.華中農業大學園藝林學學院，康養園藝研究院，湖北武漢 430070；2.化州市化橘紅研究所，廣東化州 525100）

化橘紅為蕓香科植物化州柚（Citrus grandis‘Tomentosa’）或柚（Citrus grandis(L.)Osbeck）未成熟或近成熟的干燥外層果皮，因其藥效獨特而被譽為“十大廣藥”之一，分布于我國廣東、廣西等地?！侗静菥V目拾遺》記載，“橘紅治痰涎、消油膩、消食、醒酒、寬中、解蟹毒”，具有理氣化痰、潤肺止咳的顯著藥用功效[1-2]?；偌t還具有獨特的香氣，可作為一種香氣濃郁的天然香料?；偌t精油中含量較高的揮發性萜類物質檸檬烯、月桂烯等成分，具有抗菌、助消化的藥理活性[3]，在醫藥、食品加工和日用化工等行業領域中具有非常重要的應用價值。

目前，化橘紅精油的提取通常采用水蒸氣蒸餾法[4]、無水乙醇超聲輔助提取法[5]和飽和水溶液提取法[6]，均需對樣品進行復雜的脫水處理，且提取物中雜質較多，耗時長，提取效率低。研究表明，超臨界CO2萃取是一種快速、簡單且環境友好的方法，可以有效解決蒸餾法的香氣成分受熱變質問題以及有機溶劑提取法的溶劑殘留問題，在精油提取方面具有廣闊的應用前景[7-8]。超臨界CO2萃?。╯upercritical carbon dioxide，SC-CO2）工藝是利用超臨界狀態的CO2作為溶劑直接將天然香料溶解抽取的提取方法[9]。CO2作為萃取劑具有無毒、無菌、無污染的特點，在高壓、密閉環境下選擇性萃取，使精油得率和資源利用率大大提高[10]。因此，本文通過響應面試驗優化超臨界CO2萃取化橘紅精油的工藝條件，選擇萃取溫度、萃取壓力、萃取時間3 個因素，將精油得率作為評價指標，進行Box-Behnken 中心組合設計[11]，得到三元二次方程來擬合響應面分析，發現并優選精油提取工藝條件，為進一步地發展和有效利用化橘紅提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

化橘紅鮮果，采自廣東省化州市平定積田大嶺村。

無水乙醇，分析純，上海滬試有限公司；CO2氣體，純度＞99.9%，武漢深冷有限公司；正己烷，色譜純，上海滬試有限公司；脫脂棉，南昌朝陽醫療保健有限公司；實驗用水由Milli-Q 超純水儀制備。

1.2 儀器與設備

超臨界CO2提取裝置，ASI SFE-2，美國Applied Separations（ASI）公司；電子天平，JY1002，上海精平有限公司；高速多功能粉碎機，800Y-7，永康市鉑歐五金制品有限公司；冷凍干燥機，SCIENTZ-10N，寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 化橘紅鮮果精油萃取工藝流程

化橘紅果皮→冷凍干燥→粉碎過篩→超臨界CO2萃取→化橘紅精油

1.3.2 操作要點

將化橘紅鮮果果皮削下，冷凍干燥48 h，粉碎過30目篩，稱取質量記為m1，放入萃取釜，并將萃取釜兩端塞入脫脂棉準備萃取。檢查所有閥門為關閉狀態后，開啟恒溫槽降溫，當溫度低于室溫10 ℃左右時，開啟CO2鋼瓶閥門和空壓機，待穩定后開啟萃取釜閥門，設置一定的溫度及壓力，待其恒定后調整流速并進行計時，保證萃取時間大于0.5 h，停機，開萃取器的出口閥，獲得化橘紅精油（m2）。

1.3.3 精油提取的單因素試驗

在固定萃取流量5 L/h、萃取壓力25 MPa、萃取時間60 min、萃取溫度45 ℃的基礎上，以化橘紅精油得率為指標，設置單因素試驗，分別考察萃取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、萃取壓力（10、15、20、25、30 MPa）和萃取溫度（30、35、40、45、50 ℃）對化橘紅精油得率的影響[12]。

1.3.4 超臨界CO2萃取工藝響應面優化

基于單因素試驗，按照Box-Behnken 試驗的要求使用Design-Expert 11，設計響應面試驗方案[13]。分別用A、B、C 來表示萃取壓力、萃取溫度及靜態萃取時間，并以-1、0、l 分別表示對應變量，以化橘紅精油提取率為響應值進行響應面分析，因素與水平見表1。

（1）教師對教學內容劃分出一級知識點和相對獨立的二級知識點，對每個二級知識點錄制10 分鐘左右的教學視頻。

表1 響應面試驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.4 指標測定

精油得率是影響生產成本的重要衡量標準，因此調整化橘紅超臨界CO2萃取工藝可以有效提高精油得率，為化橘紅精油質量與鮮皮質量之比[14]，見式（1）。

1.5 數據處理

采用Excel 2013 對試驗數據進行整理，依據Box-Behnken 中心組合試驗設計原則，使用Design-Expert 8.0.6 對響應面進行了統計分析，并利用SPSS 18.0 對其進行方差分析和顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 萃取溫度對精油得率的影響

由圖1 可知，隨著萃取溫度的升高，化橘紅精油得率先增加后減少，當溫度達到35 ℃時，精油得率達到峰值，可達4.5%，40 ℃時萃取得率較35 ℃時的萃取得率有所下降，但仍然大于30 ℃時的萃取得率。這是因為隨著溫度的升高，香氣成分不斷溢出，得率隨之升高，在40 ℃時萃取得率有所下降，可能是萃取釜中CO2物理形態的變化所造成的[15]。因此，萃取溫度選擇35 ℃。

2.1.2 萃取壓力對精油得率的影響

2.1.3 萃取時間對精油得率的影響

由圖3 可知，隨著萃取時間的延長，化橘紅精油得率呈現先上升后略微下降的趨勢；當萃取時間達到1.5 h時，精油得率最大，達4.3%；萃取2 h 時，精油得率變化不大，說明萃取時間的延長已經無法增加精油得率，而且萃取時間太長會將化橘紅中的黃酮類物質如柚皮苷提取出來，影響化橘紅精油的萃取[17]。因此萃取時間選擇1.5、2.0、2.5 h 進行響應面優化實驗。

2.2 響應面優化設計試驗

2.2.1 響應面試驗萃取參數設定

在單因素試驗分析的基礎上，選取對化橘紅精油萃取得率影響較大的因素進行響應面試驗，得到Box-Behnken 試驗因素水平編碼表。響應面試驗結果見表2（見下頁）。

表2 響應面試驗結果Table 2 Results of response surface experiments

2.2.2 建立數學模型及方差分析

根據表2 的試驗結果，采用Design-Expert 11 軟件對所得試驗數據進行回歸分析及回歸方差分析顯著性檢驗，結果見表3。由表3 可知，通過對試驗數據進行多元回歸分析，可以通過以下二階多項式方程的多元回歸得到預測的精油產率，所得回歸方程為Y=-63.704+2.355A+1.279B+8.983C+0.004AB-0.067AC+0.019BC-0.032A2-0.027B2-1.829C2。其中，A、B、C 分別為測試變量的編碼因子。由表3 可知，模型P＜0.000 1，小于0.05，差異極顯著，表明模型具統計學意義[18]；模型F=99.18，表明該模型具有顯著性，且由于噪聲只有0.01%的可能性會出現如此大的F值。失擬項P=0.053，表明不顯著，說明該模型失擬因素不存在；R2=0.992 2，表明該因素中有99.22%影響了響應值變化；預測的R2為0.895，與調整后的R2為0.982 2 相對差異不大，且均大于0.80，表明該模型擬合程度符合標準，因此回歸方程可用于對超臨界CO2萃取化橘紅精油條件進行預測[19]。

根據表3 中F值可知，化橘紅精油收率的影響因子從大到小為B 萃取壓力、A 萃取溫度、C 萃取時間。由P值可知，A、B、BC、A2、B2、C2極顯著影響化橘紅精油得率（P＜0.01），AC、AB、C 顯著影響化橘紅精油得率（P＜0.05）。

表3 二元多項式模型的預估回歸系數和方差數據分析（ANOVA）Table 3 Predicted regression coefficients for binary polynomial models and variance data analysis (ANOVA)

2.2.3 多因素間交互作用分析

根據回歸方程利用Design-Expert 11 軟件做不同因素的響應面分析，結果如圖4 所示，圖（a）～（f）表示萃取壓力、萃取溫度、萃取時間其中兩個變量交互作用對超臨界CO2萃取化橘紅精油提取效果的研究。響應曲面越曲折，交互作用越強。因此，圖4（a）為近圓形等高線，說明萃取壓力和萃取時間交互作用較弱；圖4（c）（e）等高線較陡，說明萃取時間和萃取溫度之間、萃取時間和萃取壓力之間交互作用明顯；圖4（b）為響應面弧度明顯，而圖4（d）（f）響應面較為平緩，說明萃取溫度和萃取壓力對化橘紅精油得率影響較大，而萃取時間對精油得率影響較小。綜上，交互作用顯著的是A 萃取溫度與B 萃取壓力，此結果與表3結果相同。

3 結論

本研究通過超臨界CO2萃取的方法提取化橘紅精油，分析萃取溫度、萃取壓力和萃取時間對化橘紅萃取率的影響，建立回歸方程模擬實驗并根據Box-Behnken響應面試驗設計結果進行驗證，在各因素的方差分析中表明：萃取壓力與萃取溫度對化橘紅精油得率影響達極顯著水平；在多因素交互分析中，萃取溫度與萃取時間的交互作用顯著，其他兩個變量兩兩交互作用都不顯著；使用Design-Expert 11 研究不同條件下化橘紅精油提取效果的最佳工藝為萃取溫度36.22 ℃，萃取壓力26.75 MPa，萃取時間1.92 h，化橘紅精油收率預測值為4.68‰。根據操作試驗的可行性，將實施條件修改為萃取溫度36 ℃，萃取壓力27 MPa，萃取時間1.9 h，并進行3次重復試驗，得到化橘紅精油的平均收率為4.53‰，與響應面預測結果一致[20]。

目前，超臨界CO2萃取得到的有效成分通常具有較高的藥理活性,但部分研究對象藥理活性與其較高的得率不成正比，因此需進一步純化解析化橘紅藥材香氣成分。在此基礎上，還需結合功效做相應的提取工藝研究和設備設計優化應用于生產，為今后綜合利用開發化橘紅超臨界萃取物提供科學依據。