mNGS在血液惡性腫瘤患者疑似血流感染診斷中應用價值

宋曉露 陳一瑞 彭也 楊浩 藍建平*

血流感染（blood stream infection，BSI）是敗血癥和菌血癥的總稱，病原微生物通過患者病灶部位侵入血流，釋放毒素和代謝產物，誘導細胞因子釋放，從而引起全身感染、中毒和全身炎癥反應，嚴重的患者可引起感染性休克、彌散性血管內凝血、全身多器官功能障礙綜合征等[1］。而臨床上疑似血流感染致病菌診斷的金標準是血培養，但該方法在實際臨床應用中有細菌培養周期長、培養菌無法定量、假陰性率高[2］等諸多缺點。宏基因組二代測序（mNGS）是一種快速、高效、無偏倚獲得核酸序列信息的技術，自2014年首次報道用mNGS診斷1例中樞神經系統鉤端螺旋體感染患者以來[3］，該技術迅速應用于新發或罕見病原體診斷、感染性疾病暴發監測和預防、病原體耐藥基因突變等方面[4-5］，對混合侵入性感染性樣本中多種病原菌的檢測鑒定有較好的應用[6］。但目前mNGS仍缺乏公認的判讀標準以及與傳統檢測方法對比驗證，因而該方法在臨床診斷應用中仍存在不少爭議。本文比較mNGS技術與血培養在血液惡性腫瘤患者疑似合并血流感染治療過程中的優效性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月至2021年7月本院血液惡性腫瘤疑似血流感染患者103例，納入標準：①臨床懷疑血流感染的患者，體溫≥38.0℃；②伴有以下其中一條：CRP≥20 mg/L或PCT≥0.5 ng/mL或血流動力學不穩定，③未發現明確感染病灶。排除住院期間已確診為BSI。最終納入74例患者，男40例，女34例；年齡9～69（41.45±14.89）歲。降鈣素原（PCT）（2.38±7.23）ng/mL，C-反應蛋白（CRP）（95.46±69.40）mg/L。造血干細胞移植患者61例，其中親緣半相合51例，親緣全相合7例，自體移植3例，化療患者13例。本項目經浙江省人民醫院倫理委員會批準。

1.2 方法 （1）標本采集：選用無菌一次性針管分2次抽取患者靜脈血共29 mL，雙瓶雙側，5 mL/瓶，20 mL用于血培養，5 mL用于mNGS檢測，2 mL用于CRP檢測，2 mL用于PCT檢測。①血培養：應用BD BACTECTMFX全自動細菌培養儀，BD生物公司采購配套的需氧微生物培養瓶及厭氧微生物培養瓶，常規培養5～7 d，如培養陰性，根據臨床實際情況再采集新鮮血液重新培養。②CRP檢測和PCT檢測：應用Roche全自動化生化分析儀P 800檢測hs-CRP。應用Roche全自動電化學發光級專用試劑進行PCT定量檢測，PCT＞0.5μg/L為陽性。③宏基因檢測：采用PDC-seqTM-DNA方法建庫，采用illumina測序平臺進行高通量測序，結合權威的微生物數據庫，進行生物信息分析，對微生物進行鑒定。

1.3 觀察指標 比較兩種方法學檢出時間、病原菌檢出率；分析患者CRP、PCT檢測數據以及臨床指導用藥后患者恢復程度。

1.4 統計學方法 采用IBM SPSS 26.0統計軟件。

2 結果

2.1 血培養和mNGS同步檢測病原菌分布mNGS檢測報告周期2.5 d，血培養檢測報告周期5 d。mNGS檢出44種病原菌，其中細菌25種，真菌10種，病毒9種。血培養檢出5種病原菌，其中細菌4種，真菌1種。見圖1。

圖1 同批樣本分別用mNGS和血培養檢測病原菌分布

2.2 單一病原體檢測 見表1。

表1 單一病原體檢測（n）

2.3 復合病原菌檢測 見表2。

表2 復合病原菌檢測（n）

2.4 mNGS陰性且血培養陰性結果分析 見表3。

表3 血培養和mNGS整體檢出情況比較（n）

2.5 mNGS陰性且血培養陽性結果分析 8例血培養陽性患者中，mNGS結果陰性患者2例，二者結果不一致占25%，血培養結果分別是大腸埃希菌和肺炎克雷伯桿菌。

2.6 mNGS陽性且血培養陰性結果分析 mNGS陽性且血培養陰性52例（78.79%），部分患者mNGS檢測結果與臨床癥狀匹配并獲得更適當的抗感染治療方案并從中獲益31例（57.69%）2.6 mNGS陽性且血培養陽性結果分析mNGS陽性同時血培養陽性8例，兩種檢測結果匹配一致占75%，6例結果一致患者中，給藥好轉占66.67%，給藥效果不佳比33.33%。

3 討論

本資料結果顯示，mNGS對于細菌、病毒、真菌、復合感染檢測具有良好的檢出率，得益于mNGS診斷病原體的非培養依賴性及無偏倚性。然而mNGS在某些肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌感染方面還存在一些缺陷，與部分臨床結果存在差異，這歸結于肺炎克雷伯桿菌等破壁困難，影響核酸提取，從而導致假陰性偏高。另外血培養陰性患者，mNGS檢測病原菌陽性患者更多，表明mNGS檢測病原菌能力較強，可以作為傳統檢測方式的有效補充，進一步提高病原體診斷率。

mNGS檢測報告周期2.5 d短于血培養檢測報告周期5 d，其快速結果反饋有助于臨床醫師診療策略的決斷。尤其在混合感染以及包含鏈球菌、厭氧菌在內的培養困難病原菌診斷方面有明顯的應用優勢。但目前mNGS在臨床應用中也存在一定的局限性，如背景核酸的干擾、易受到污染菌和正常定植菌的影響、微生物數據庫不完善、病原微生物耐藥數據庫不完善、RNA病原體及部分真菌檢出率低、無法確定檢出的病原菌是否死亡、缺乏有效性驗證以及統一標準等，這些因素使結果受到一定干擾，因此需將mNGS檢測數據和臨床更好的結合，從而能更準確鑒定致病菌及耐藥性。同時較高的檢測價格和技術門檻也是限制mNGS技術廣泛開展的重要因素。無論是血培養還是mNGS檢測病原菌，均可能存在假陽性或者假陰性結果，因此還要結合臨床患者具體情況多維度綜合分析獲得更精準的結果。

綜上所述，mNGS可以更加快速、高效的檢測血液惡性腫瘤術前或術后病原菌感染類別，輔助臨床診療，不僅可以減少抗菌藥物濫用，將經驗性治療轉為目標性治療，同時能快速甄別感染源提高患者治療效果及降低費用，產生良好的社會經濟效益。