腎上腺髓質(zhì)素2在腎性高血壓大鼠腎臟中的表達(dá)變化

鄭如蓮 夏武杰 楊鵬麟

垂體中葉素（Intermedin，IMD）是由ROH等[1］證實(shí)的一種新的降鈣素（calcitonin，CT）/降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）家族。TAKEI等[2］發(fā)現(xiàn)CGRP家族的新成員腎上腺髓質(zhì)素2（adrenomedullin，ADM2），被認(rèn)為是同一種肽。IMD/ADM2在機(jī)體中作用廣泛，能降壓，改善心功能，減少外周血管阻力，增加心輸出量，在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)及高血壓、心肌缺血、心功能衰竭和腎功能衰竭等疾病過(guò)程中有重要的生理、病理學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠18只，體重（200±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。兔抗鼠IMD/ADM2由美國(guó)Phoenix Pharm Inc.提供，大鼠抗鼠α-tubulin由美國(guó)Santa Cruz. Inc提供。

1.2 方法 （1）“兩腎一夾”腎性高血壓大鼠模型的復(fù)制：大鼠隨機(jī)分為兩組，模型組大鼠，稱(chēng)重，麻醉，固定，消毒后，開(kāi)腹，暴露腎臟及腎動(dòng)靜脈，分離動(dòng)靜脈，用直徑0.3 mm的銀針貼近腎動(dòng)脈靠近腎臟處，用3號(hào)線(xiàn)打結(jié)固定后取走銀針；術(shù)畢，逐層縫合腹膜與皮膚，術(shù)后正常進(jìn)食與喂水。（2）大鼠平均頸動(dòng)脈壓（mCAP）、左心室舒張末壓（LVEDP）以及左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率測(cè)定：大鼠飼養(yǎng)8周后，稱(chēng)重，麻醉，固定，消毒后，頸正中切口，分離左頸總動(dòng)脈。行頸總動(dòng)脈插管，記錄SBP，DBP，mCAP；心臟舒縮時(shí)左心室內(nèi)的壓力變化圖和左心室內(nèi)壓最大上升/降速率，LVEDP。放血處死動(dòng)物，取出心臟，分別稱(chēng)取左心室加室間隔的重量（LVM），LVM/BW作為左心室肥大的指標(biāo)。（3）RT-PCR法檢測(cè)腎臟組織IMD/ADM2的mRNA的表達(dá)：用Trizol一步法提取組織總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)260 nm及280 nm處OD值，以檢測(cè)其濃度和純度；OD260/OD280比值應(yīng)為1.6～2.0。用DEPC水調(diào)整各樣本的濃度，使其終濃度為2 mg/mL；進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR擴(kuò)增：用于擴(kuò)增的PCR引物序列，擴(kuò)增條件為預(yù)變性（95℃ 5 min）→變性（94℃ 30 s）→退火（30 s）→延伸（72℃ 40 s）熱循環(huán)n次→72℃ 5 min。-20℃保存?zhèn)溆茫?jiàn)表1。產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)分析。（4）免疫組化法檢測(cè)腎臟組織IMD/ADM2定位及半定量：①標(biāo)本前固定處理：每組各隨機(jī)選取3只大鼠，大鼠右心耳剪個(gè)缺口，將含有1,000 U肝素0.9%氯化鈉溶液快速注入大鼠左心室內(nèi)，通過(guò)體循環(huán)從右心耳處流出。20 min后，換成500 mL 4%多聚甲醛繼續(xù)滴注，直到大鼠全身出現(xiàn)僵硬，遂可停止滴注。取出腎臟，將其環(huán)切之后標(biāo)本保存于4%多聚甲醛中，用于組織脫水、包埋、切片，待測(cè)IMD/ADM2蛋白水平。②用兩步法檢測(cè)腎臟IMD/ADM2免疫組化：腎臟組織石蠟切片烘片，脫蠟水化，高壓修復(fù)抗原，0.03%H2O2-甲醇去除過(guò)氧化物酶，封閉抗原，滴加IMD/ADM2一抗（1∶100），4℃過(guò)夜。次日37℃復(fù)溫45 min，滴加二抗（60μL），37℃ 30 min，PBS沖洗，DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片，讀取每個(gè)視野陽(yáng)性區(qū)域及累積光密度。

表1 IMD、CL、RAMPs、β－actin引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增條件

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠頸部有創(chuàng)血壓及左心室指數(shù)比較 模型組SBP，DBP，mCAP、LVEDP、LVM/WT和左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠頸部有創(chuàng)血壓及左心室指數(shù)比較（±s）

表2 兩組大鼠頸部有創(chuàng)血壓及左心室指數(shù)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

組別 n LVEDP（mmHg） 左心室內(nèi)壓最大上升速率（mmHg/s） 左心室內(nèi)壓最大下降速率（mmHg/s） SBP（mmHg） mCAP（mmHg） LVM/WT（mg/g）對(duì)照組 9 -9.68±7.14 7,173.17±299.12 6,115.94±274.97 137.13±2.87 119.15±2.68 1.85±0.32模型組 9 22.81±4.05** 13,010.25±2,030.88** 7,626.40±964.64** 178.92±10.30** 145.53±22.64** 2.06±0.14*

2.2 腎臟組織IMD/ADM2的mRNA表達(dá)及免疫組化的累積光密度比較 模型組腎臟組織IMD/ADM2免疫組化的累積光密度比對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），且主要在腎小動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞及腎小管（近曲小管、遠(yuǎn)曲小管、集合管）細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)。見(jiàn)表3。

表3 腎臟IMD/ADM2的mRNA及蛋白表達(dá)變化（±s）

表3 腎臟IMD/ADM2的mRNA及蛋白表達(dá)變化（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；**P＜0.05

組別 mRNA表達(dá) 累積光密度對(duì)照組 1.55±0.65 1.59±1.85模型組 4.80±2.44** 26.89±14.08**

3 討論

降鈣素原（procalcitonin，PCT）已經(jīng)在臨床中廣泛使用，已證實(shí)對(duì)感染性疾病有一定的預(yù)測(cè)作用，PCT水平是ICU 30 d死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，PCT水平越高，死亡率越高，在無(wú)發(fā)熱、無(wú)器官衰竭或膿毒癥的低齡患者中更為有益[3］。

既往研究已經(jīng)證實(shí)，給大鼠靜脈注射合成的ADM2顯示出有力的、持久的降壓效應(yīng)，降低大鼠平均動(dòng)脈血壓，且呈劑量依賴(lài)性，其降壓效應(yīng)持續(xù)較心房利鈉肽持久[4-7］。然而正常離體大鼠心臟中，灌注ADM2后不影響心率，但能提高心臟功能和擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈。但ADM2 1-53干預(yù)能明顯改善由缺血/再灌注引起的心臟功能抑制和心動(dòng)過(guò)緩，并降低缺血再灌注心肌中乳酸脫氫酶活性和丙二醛的生成、血漿總蛋白及肌紅蛋白含量[8］。

原發(fā)性高血壓是一種多基因、多因素、復(fù)雜異質(zhì)性的疾病，降鈣素（CT）/CGRP家族肽和線(xiàn)粒體[8-10］在調(diào)節(jié)血管的各個(gè)方面起到關(guān)鍵的作用，為原發(fā)性高血壓的早期診斷和干預(yù)提供理論依據(jù)。在自發(fā)性高血壓大鼠和一氧化氮合酶[11］抑制劑左旋硝基精氨酸誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型中，IMD/ADM2在血漿和組織中含量均增加，表明在兩種高血壓動(dòng)物模型中，IMD/ADM2在高血壓伴心肌肥厚的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但“兩腎一夾”高血壓模型中是否有相同的改變?nèi)杂写M(jìn)一步研究。

TAKEI等[12］通過(guò)給大鼠靜脈注射ADM2，無(wú)論是正常WKY大鼠，還是自發(fā)性高血壓大鼠（SHRs），腎血流量均明顯增加而腎小球?yàn)V過(guò)率不變，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)分?jǐn)?shù)下降，膠體滲透壓降低，腎小管周?chē)?xì)血管內(nèi)蛋白濃度下降，近曲小管重吸收水、鈉受抑制，有利尿、促尿鈉排泄的作用，推測(cè)ADM2不僅通過(guò)擴(kuò)血管作用改善血供，且也通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟微循環(huán)發(fā)揮作用。FUJISAWA等[13］實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，在大鼠腎內(nèi)動(dòng)脈連續(xù)注入IMD后腎血流量增加，提示IMD有擴(kuò)張腎血管的作用。ADM能抑制腎間質(zhì)纖維化，有些研究推測(cè)IMD也有減輕單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）導(dǎo)致的腎臟纖維化的作用，其機(jī)制可能與抑制腎組織局部氧化應(yīng)激有關(guān)，IMD有可能成為腎臟疾病防治的新靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)中用逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法測(cè)定的腎臟的IMD/ADM2 mRNA水平發(fā)現(xiàn)模型組IMD/ADM2水平比對(duì)照組升高，提示IMD/ADM2轉(zhuǎn)錄水平增加可能是引起IMD/ADM2在心肌組織中含量蛋白增加的原因。同時(shí)用免疫組化的方法檢測(cè)IMD/ADM2在腎性高血壓時(shí)腎臟組織中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組IMD/ADM2蛋白含量比對(duì)照組明顯升高。且兩組大鼠IMD/ADM2腎臟含量的升高與兩組LVM/WT比呈顯著正相關(guān)，作者認(rèn)為這是IMD/ADM2在腎性高血壓的腎臟病變中起保護(hù)作用的體現(xiàn)。在高血壓狀態(tài)下，由于調(diào)節(jié)通路的障礙及機(jī)體的某種器官損傷導(dǎo)致機(jī)體代償性反應(yīng)處于失衡狀態(tài)，從而導(dǎo)致IMD/ADM2出現(xiàn)絕對(duì)或相對(duì)不足。

綜上所述，IMD/ADM2為預(yù)防和治療心血管疾病提供了新靶點(diǎn)，其生理和病理意義及其在高血壓的靶器官損害過(guò)程中的意義還需進(jìn)一步研究。