阿霉素聯合腺嘌呤誘導大鼠病理性衰老模型的建立

張華琴 萬鳳 唐玥雯 楊汝春* 王洲婷

慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）發病率逐年增高，全球已有超過7億慢性腎病患者，死亡人數達120萬。我國以1.323億患者成為全球CKD患者最多的國家。因此，CKD可能也是引起病理性早衰的重要原因。模擬人類腎臟疾病的實驗動物模型對闡明機制及防治的研究具有重要意義，但目前腎臟損傷伴隨衰老的模型尚無報道。阿霉素和腺嘌呤分別通過誘導腎小球或腎小管損傷誘導腎臟損傷[1］，但兩者聯合對腎功能、腎病理及腎組織衰老的誘導作用研究較少。本研究觀察阿霉素與腺嘌呤聯合誘導大鼠腎損傷和腎衰老的作用。

1 材料與方法

1.1 動物 無特定病原菌雄性SD大鼠24只，體重115.7±4.7 g，購自浙江省醫學科學院實驗動物中心。1.2 主要試劑 D-半乳糖（源葉，S11050），阿霉素（浙江海正藥業股份有限公司，批號：040505），腺嘌呤（索萊寶，A8330），丙二醛（Malonic dialdehyde，MDA）試劑盒（碧云天，S0131S），兔抗p16INK4α多克隆抗體（碧云天，AF647），鼠抗GAPDH（ProteinTech，60,004-1-Ig），辣根過氧化物酶標記抗鼠、抗兔及抗羊IgG（H+L）、ABC（鏈霉素-卵白素）免疫組化檢測試劑盒（均購自北京中杉生物技術公司）；β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal）試劑盒（碧云天，C0602）。

1.3 方法 （1）大鼠造模與實驗分組：將大鼠隨機分為正常對照（NC）組6只和不同造模組各8只，D-半乳糖組（D組）腹腔注射D-半乳糖100 mg/（kg·d）；阿霉素+腺嘌呤組（A+X組）尾靜脈注射阿霉素5 mg/kg，3周后灌胃腺嘌呤100 mg/（kg·d）4周。模型組與正常對照組大鼠均常規飼養。（2）檢測指標與方法：實驗結束前在代謝籠中代謝，收集24 h尿，測量尿量，測定尿蛋白，計算24 h尿蛋白（urinary protein，UP）。試驗結束時稱取體重，腹主動脈取血，檢測血肌酐。取腎臟，稱取單腎重，計算腎重與體重指數。去腎包膜，取部分腎組織用于檢測MDA水平，用蛋白含量進行校正；部分腎組織4%多聚甲醛固定，行蘇木精-伊紅染色（HE）和Masson染色，觀察腎臟組織病理損傷和纖維化，采用ImagePro plus6.0圖像分析；免疫組化檢測腎組織p16INK4α蛋白原位表達；腎組織冷凍切片檢測SA-β-GAL活性；戊二醛固定腎組織，進行透射電鏡檢查，觀察腎組織超微觀病理改變。

1.4 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。計量資料用（±s）表示，多組間比較采用one-way ANOVA，組間兩兩比較用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體重、腎重以及腎重/體重比較 大鼠從造模到試驗結束共8周，D組實驗期間死亡1只，A+X組死亡2只。與NC組比較，D組和A+X組大鼠體重和腎重/體重指數均顯著增高，A+X組腎重/體重指數高于D組；A+X組腎重高于NC組和D組。見表1。

表1 各組大鼠體重、腎重以及單腎/體重指數比較（±s）

表1 各組大鼠體重、腎重以及單腎/體重指數比較（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與D組比較，#P＜0.05

組別 n 體重（g） 腎重（g） 腎重/體重×100 NC組 6 343.5±37.6 1.11±0.08 3.25±0.27 D組 7 261.4±60.4* 1.03±0.18 4.02±0.57*A+X組 6 283.3±25.0* 1.42±0.20*# 5.03±0.77*#F值 5.69 10.01 14.40 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 各組大鼠尿蛋白、血肌酐水平比較 A+X組血肌酐水平高于NC組和D組差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠尿蛋白、血肌酐水平比較（±s）

表2 各組大鼠尿蛋白、血肌酐水平比較（±s）

注：與NC組和D組比較，*P＜0.05

組別 n 24 h尿蛋白（g/μmoL） 血肌酐（μmol/L）NC組 6 6.39±1.41 31.90±1.95 D組 7 5.43±1.10 31.93±3.72 A+X組 6 23.29±17.35 41.35±8.03*F值 6.10 7.27 P值 ＞0.05 ＜0.05

2.3 大鼠腎組織病理改變 NC組大鼠腎組織切片光鏡下可見腎小管上皮細胞形態正常、排列整齊，腎小球結構清晰，毛細血管襻開放良好；D組與NC組相似；A+X組大鼠腎組織可見明顯的腎間質炎性細胞浸潤，有不同程度的間質纖維化，腎小管管腔擴張，部分管腔內有蛋白管型，腎小球系膜基質增生并呈彌漫性分布。A+X組總纖維化和腎小球硬化高于NC組和D組。見表3和圖1～2。

表3 腎小管間質和腎小球總纖維化半定量分析比較（±s）

表3 腎小管間質和腎小球總纖維化半定量分析比較（±s）

注：與NC組和D組比較，*P＜0.05

組別 n 腎間質與腎小球總纖維化（OD） 腎小球硬化（OD）NC組 4 0.010±0.005 0.041±0.005 D組 4 0.016±0.006 0.043±0.008 A+X組 4 0.046±0.003* 0.074±0.009*F值 60.94 23.13 P值 ＜0.05 ＜0.05

圖1 大鼠腎組織石蠟切片HE染色

圖2 大鼠腎組織石蠟切片Masson染色

2.4 透射電鏡觀察大鼠腎小球超微觀結構 透射電鏡下NC組腎小球基底膜厚薄均勻，界限清楚，足細胞足突排列整齊，內皮細胞窗孔清晰；D組與NC組相似；A+X組腎小球基底膜部分增厚，界限不清，足細胞足突輕中度融合，內皮細胞窗孔部分消失。見圖3。

圖3 透射電鏡觀察各實驗組腎小球足細胞（×5,000）

2.5 大鼠腎組織SA-β-Gal及MDA比較 D組和A+X組腎組織MDA水平比NC組增高；D組和A+X組腎組織SA-β-Gal活性均高于NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4和圖4。

圖4 β-半乳糖苷酶活性檢測

表4 各組大鼠腎組織SA-β-Gal及MDA比較

2.6 免疫組化技術檢測大鼠腎組織p16INK4α蛋白原位表達水平比較 NC組大鼠腎組織p16INK4α在腎小管刷狀緣呈陽性表達，腎小管及腎小球p16INK4α陽性染色較弱；D組與A+X組大鼠腎組織中除腎小管刷狀緣外，腎小管及腎小球p16INK4α陽性染色均明顯增強，A+X組腎小球陽性染色增強。D組與A+X組大鼠腎間質及腎小球總p16INK4α積分光密度（IOD）均比NC組增強，A+X組腎小球p16INK4α比D組增強。見表5和圖5。

表5 各實驗組大鼠腎間質及腎小球總p16INK4α半定量分析[IOD，（±s）］

表5 各實驗組大鼠腎間質及腎小球總p16INK4α半定量分析[IOD，（±s）］

注：與NC組比較，*P＜0.05；與D組比較，#P＜0.05

組別 n 腎間質+腎小球總p16INK4α 腎小球p16INK4α NC組 4 137,783±22,771 3,513±665 D組 4 260,429±21,348* 13,964±3,881*A+X組 4 277,780±36,019* 30,421±4,690*#F值 30.76 27.3 P值 ＜0.05 ＜0.05

圖5 免疫組化技術檢測各組p16INK4α表達

3 討論

CKD可能是導致人體早衰的重要病理原因。有研究顯示，CKD患者存在著認知減退現象，腎小球濾過率嚴重下降與進展性的認知惡化密切相關[2］。CKD還會導致礦物骨病，并引起血管鈣化[3］。CKD患者性激素水平及性功能均隨腎小球濾過率降低而明顯下降，并影響正常生活[4］。CKD患者甲狀腺功能及促甲狀腺激素水平也受到影響，導致鈣磷等代謝紊亂[5］。

阿霉素可引起腎小球濾過膜通透性增加，破壞腎小球濾過膜的結構和功能[6］。阿霉素腎病模型主要表現為蛋白尿、足細胞損害、高血脂的腎病綜合征，隨著病情的發展出現腎小球硬化、腎臟纖維化，嚴重可導致腎功能衰竭。腺嘌呤誘導慢性腎功能衰竭大鼠模型主要是通過腺嘌呤引起腎小管梗阻，腎單位大量喪失，導致氮質血癥，毒素蓄積及電解質和氨基酸代謝紊亂，進而引起腎功能衰竭[7］。

本研究結果顯示，D組和A+X組大鼠腎重/體重指數均增高，提示兩組腎臟均發生病理改變；其中阿霉素聯合腺嘌呤組血肌酐水平增高，大鼠腎病理可見明顯的炎細胞浸潤和間質纖維化及足細胞出現輕中度融合，SA-β-GAL活性及p16INK4α表達增高，且腎小球p16INK4α表達水平較NC組和D-半乳糖組增高。D-半乳糖對大鼠血肌酐水平及腎臟病理損傷影響不明顯，但可增高腎組織MDA水平、SA-β-GAL活性與p16INK4α蛋白表達水平。D-半乳糖可增加腎組織MDA和SAβ-GAL活性方面，與以往文獻報道一致[8］。在前期研究中亦發現，2型糖尿病腎病患者中衰老標志分子SAβ-GAL和細胞周期抑制蛋白p16INK4α在腎小球和腎小管中表達均增加，提示腎臟疾病中存在細胞衰老現象[9］。p16INK4α基因是一種新型抗癌基因，在衰老的進程中發揮重要作用。FAMULSKI等[10］研究發現硬化腎小球的數量、間質纖維化及腎小管萎縮均與p16INK4α基因表達相關。總之，阿霉素聯合腺嘌呤可誘導CKD致病理性衰老模型。