酸脅迫對馬尾松種子萌發不同時期體內滲透調節物質和酶活性的影響

武欣怡， 陳順鈺， 朱晨璐， 黃偲祺， 李啟艷， 侯曉龍，2，3

(1.福建農林大學林學院，福建福州 350002； 2.南方紅壤區水土保持國家林業和草原局重點實驗室，福建福州 350002；3.海峽兩岸紅壤區水土保持協同創新中心，福建福州 350002)

土壤酸化是世界各國普遍關注的重要土地退化問題之一，我國南方紅壤土因土壤本身性質及強淋溶作用的影響，堿性鹽基離子不斷淋失，土壤不斷酸化。各類資源的開采，特別是一些金屬礦的開采，進一步加劇了土壤酸化問題，其中，福建省長汀縣離子型稀土礦開采和冶煉過程中投入過量過酸的浸取劑和沉淀劑，造成土壤酸化嚴重，一般植物無法正常生長。因此，長汀礦區廢棄地的生態修復成為當地急需解決的問題。

在前期開展長汀縣稀土礦廢棄地植被恢復的研究過程中發現，馬尾松可正常生長，在廢棄地植被恢復中發揮了重要作用，而且在恢復過程中出現天然更新的馬尾松幼苗(0<基徑≤5 mm)，說明馬尾松種子對稀土礦廢棄地的酸性土壤有一定耐受性，且可在酸脅迫逆境下完成繁殖更新，這對酸性土壤中植被恢復效果的維持具有十分重要的意義。研究發現，楓香()種子對酸化土壤有較強耐性，pH值5.5和pH值4.5處理有利于種子的萌發和幼苗的生長；pH值范圍在6.0～7.5最適合半夏()種子萌發、生長，不同的pH值(3.0、4.5、6.0、7.5、9.0)處理對半夏最終的萌發率無顯著影響。植物滲透調節物質和抗氧化酶活性在其適應逆境脅迫方面發揮了重要作用，夏枯草()幼苗對酸性環境有較強耐受性，根系APX抗氧化酶以及葉片中滲透調節物質含量的提高可減少酸脅迫的傷害；寬葉雀稗種子萌發初期的POD活性和萌發中期的CAT、SOD活性增加減小了酸脅迫對細胞的傷害，在其適應酸脅迫中發揮了重要作用；類蘆()種子體內POD和CAT活性在弱酸條件下(pH值5.6、5.0、4.5)增強，SOD活性在pH值3.5條件下有所增加，有利于類蘆適應酸脅迫環境；酸脅迫條件下，柑橘砧木體內脯氨酸含量增加，維持了其細胞質酸度，有效增強柑橘砧木對酸脅迫的耐性。但目前關于馬尾松種子萌發過程對酸脅迫的適應機制尚不清楚。

鑒于此，本研究以馬尾松種子作為試驗材料，設計不同的pH值(5.5、4.5、3.5)對馬尾松種子進行酸脅迫試驗，測定馬尾松種子萌發、生長、滲透調節物質含量、抗氧化酶活性等指標，分析馬尾松種子萌發對酸脅迫的適應機理，從而為土壤酸化離子型稀土礦廢棄地的植被恢復提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用馬尾松種子采購自江西省九江市廬山南麓，4 ℃冰箱儲存備用。挑選成熟飽滿且大小均勻的種子在濃度為0.3%的KMnO溶液中消毒30 min，去離子水反復沖洗干凈，并浸種24 h，將表面的雜質、劣質種子除去，剩下的優質種子用于試驗。

1.2 試驗設計

根據長汀縣離子型稀土礦廢棄地土壤實際的酸化水平，即土壤pH值基本處于4.05～5.83范圍內，設計不同水平的酸脅迫模擬實際土壤的酸污染程度，不同的pH值溶液采用CHCOOH調節配制，分別為對照(以去離子水為對照組)和pH值5.5、4.5、3.5，用CK、pH5.5、pH4.5、pH3.5表示。

2020年于福建農林大學田家炳實驗樓進行種子萌發和生理特性測定試驗，人工氣候箱設置溫度為25 ℃，空氣相對濕度70%，日光照14 h，光照度 10 000 lx，黑暗10 h。在每個玻璃培養皿中鋪設直徑9 cm的濾紙并高溫滅菌，然后加入酸脅迫液并放入50粒大小均勻的馬尾松種子。每個處理設置6個重復，其中3個重復用來測定馬尾松種子萌發的形態學和生物量指標，3個重復用來測定萌發過程的滲透調節物質含量，每天做好種子萌發情況記錄。以馬尾松種子形態變化為依據，將種子發芽分為露白期(胚根開始突破種皮的種子)、發芽期(胚根長度為1～2 cm的種子)以及未萌發(連續3天不發芽即萌發期結束，為未萌動的種子)3個階段。3個階段種子各取0.2 g用于抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的測定，0.1 g用于脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖含量的測定。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 種子萌發指標 在萌發結束后計算發芽相關指標，計算公式如下：發芽率=(萌發種子數/供試驗種子總數)×100%；發芽勢=(發芽高峰期發芽種子數/供試驗種子總數)×100%；發芽指數()=∑；活力指數()=×。式中：代表在第天的萌發數；代表相應的萌發天數，代表胚芽長+胚根長。

1.3.2 種子萌發生長指標 馬尾松種子萌發結束后，從每個玻璃培養皿中選取10株長勢基本一致的馬尾松，參照張愛敏等的方法測量出其胚根、胚芽長，快速用電子天平稱量馬尾松的胚根與胚芽鮮質量，然后將其放入烘箱中105 ℃殺青30 min，以 80 ℃ 烘干至恒質量，稱其干質量。

1.3.3 滲透調節物質含量 丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法；脯氨酸含量的測定采用茚三酮比色法；可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法，可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法。

1.3.4 抗氧化酶活性 抗氧化酶活性的測定參照梁俊的方法。其中，過氧化氫酶(CAT)活性采用過氧化氫紫外分光光度法測定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法測定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑光化還原法測定。

1.4 數據處理

試驗數據經過收集整理后，采用SPSS 21.0軟件對各指標利用單因子方差分析(One-way ANOVA)和多重比較法進行統計分析，并對數據進行差異顯著性分析(=0.05，Tukey-HSD法)。采用Origin 2017軟件作圖。

采用模糊數學隸屬函數法對馬尾松種子萌發及幼苗生長各個指標進行綜合評價，其計算公式如下：

當指標與抗逆性呈正相關時：′=(-)/(-)；

當指標與抗逆性呈負相關時：′=1-(-)/(-)；

=∑′。

式中：′代表馬尾松種子萌發和生長指標的隸屬函數值；代表馬尾松種子萌發及生長指標的測定值；代表馬尾松種子萌發及生長指標的最大值；代表馬尾松種子萌發及生長指標的最小值；代表各個測定指標的綜合隸屬函數值。

隸屬函數值越大，說明酸脅迫對馬尾松種子萌發及幼苗生長促進作用越強；數值越小，說明酸脅迫對馬尾松種子萌發和幼苗生長抑制作用越強。且本試驗測定的馬尾松種子萌發及幼苗生長指標只有MDA和脯氨酸與耐酸性呈負相關，其他指標與耐酸性均呈正相關。

2 結果與分析

2.1 酸脅迫對馬尾松種子萌發及生長的影響

2.1.1 酸脅迫對馬尾松種子萌發的影響 如圖1所示，馬尾松種子各萌發指標均隨pH值降低呈逐漸減小趨勢。pH值5.5時馬尾松種子發芽率和發芽指數顯著高于對照(<0.05)，其他2處理則與對照相比無顯著差異；不同酸脅迫處理對馬尾松種子發芽勢影響不顯著(>0.05)；僅pH值3.5時馬尾松種子活力指數顯著低于對照(<0.05)。由此可見，酸脅迫對馬尾松種子萌發無顯著抑制作用。

2.1.2 酸脅迫對馬尾松種子胚根、胚芽生長的影響 如圖2-a所示，馬尾松胚芽質量在不同程度酸脅迫下均大于對照，但胚芽干質量相較于對照增加不顯著(>0.05)，說明酸脅迫對胚芽干質量的影響不明顯。胚芽鮮質量隨pH值的降低先增后減，pH值4.5時達到最大值；而胚芽干質量隨pH值的降低而增加，在pH值3.5時達到最大值。

如圖2-b所示，胚根鮮質量隨pH值降低逐漸減小，但pH值5.5和pH值4.5時胚根鮮質量顯著大于對照(<0.05)，pH值3.5時胚根鮮質量小于對照；不同程度酸脅迫影響下胚根干質量均小于對照，呈先增后減的變化，其中在pH值5.5和pH值3.5時胚根干質量顯著小于對照(<0.05)，在pH值3.5時顯著達到最小值(<0.05)。由此可見，pH值5.5和pH值4.5顯著促進了胚芽鮮質量的增加，pH值3.5則對胚芽鮮質量起抑制作用；不同程度酸脅迫對胚芽干質量均有不同程度抑制。

如圖3所示，隨pH值降低，馬尾松種子胚芽長呈減小趨勢，但僅在pH值3.5時與對照相比顯著減短20.8%(<0.05)；胚根長隨pH值降低呈先增后減的變化，3組不同酸脅迫處理間胚根長無明顯變化，但均顯著小于對照。由此可見，pH值3.5時對胚芽的生長具有顯著抑制作用，不同水平酸脅迫對根系的生長均有顯著抑制作用。

2.2 酸脅迫對馬尾松種子萌發滲透調節物質含量的影響

MDA是用來反映脂質過氧化程度強弱的重要指標，其含量越高，說明組織的保護能力越弱；而脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖等可保護蛋白質，對維持細胞膨壓以及促進植物體內ROS清除有重要作用，可提高植物在逆境脅迫下的耐性。如圖4所示，馬尾松種子露白期MDA和可溶性糖含量在pH值降低時呈先減后增的變化，其中pH值5.5和pH值3.5時與對照相比顯著增加；脯氨酸含量隨pH值降低呈遞增趨勢，pH值3.5時脯氨酸含量增量顯著，達79.2%，另外2組酸脅迫下脯氨酸含量與對照相比無明顯變化；可溶性蛋白含量隨pH值降低呈遞減趨勢，且不同酸脅迫下均顯著低于對照。說明露白期馬尾松種子體內各滲透調節物質對pH值3.5最敏感，其中MDA對種子萌發起顯著抑制作用，可溶性糖和脯氨酸對種子萌發起顯著促進作用。發芽期MDA和可溶性糖含量均隨pH值降低呈逐漸增加的趨勢，其中MDA含量在pH值5.5時顯著達到最小值(<0.05)，pH值3.5時顯著達到最大值(<0.05)，而可溶性糖含量在3組酸脅迫間差異不明顯；脯氨酸含量隨pH值降低先增后減，pH值4.5時與對照組相比顯著提高47.1%(<0.05)；酸脅迫下馬尾松種子體內可溶性蛋白含量無明顯變化。說明發芽期pH值5.5 和pH值3.5下的MDA及pH值4.5下的脯氨酸對酸脅迫處理更敏感。對于未萌發種子來說，脯氨酸和可溶性糖含量均隨pH值降低呈先減后增趨勢，其中脯氨酸含量在不同酸脅迫下與對照相比無明顯變化，可溶性糖含量在不同酸脅迫下與對照相比均顯著減少；可溶性蛋白含量隨pH值降低呈遞減趨勢，但對酸脅迫響應并不顯著(>0.05)；MDA含量隨pH值降低而增加，在pH值3.5下顯著達最大值(<0.05)。說明酸脅迫下可溶性糖含量顯著減少和pH值3.5下MDA含量顯著增加對種子萌發起顯著抑制作用。

2.3 酸脅迫對馬尾松種子萌發酶活性的影響

如圖5所示，露白期馬尾松種子CAT和SOD活性隨pH值減小逐漸增強，其中CAT活性在pH值3.5時顯著大于對照(<0.05)，SOD活性在pH值4.5和pH值3.5時顯著大于對照(<0.05)；POD活性隨pH值減小先升后降，在pH值4.5時顯著達到最大(<0.05)。發芽期馬尾松種子CAT和POD活性均隨酸脅迫程度增加呈先降后升的變化，不同的是，CAT活性在pH值3.5時顯著大于對照(<0.05)；POD活性在不同程度酸脅迫下均小于對照，在pH值4.5和pH值3.5時達到顯著水平(<0.05)；SOD活性隨pH值減小逐漸增強，在pH值4.5和pH值3.5時顯著大于對照(<0.05)，pH值5.5時顯著小于對照(<0.05)。隨pH值減小，未萌發的馬尾松種子CAT活性逐漸降低，但均顯著大于對照(<0.05)；POD活性先升后降，相較于對照，只有pH值5.5下顯著抑制其活性(<0.05)；SOD活性與對照相比均無顯著差異。由此可見，不同程度酸脅迫對馬尾松種子CAT活性均有促進作用，對POD活性總體呈現抑制作用，而pH值3.5和pH值4.5顯著促進了露白期和發芽期SOD活性，pH值5.5處理顯著抑制了露白期和發芽期SOD活性。

2.4 種子萌發各指標的隸屬函數分析

如表4所示，馬尾松種子萌發各指標的綜合隸屬函數值總體表現為pH4.5>pH5.5>CK>pH 3.5，其中，pH值4.5是對照的1.20倍，pH值5.5是對照的1.07倍。在pH值4.5時，胚芽鮮質量、胚根鮮質量、 MDA含量和POD活性對綜合隸屬函數值的貢獻最大；在pH值5.5時，發芽率、發芽勢、發芽指數、胚根鮮質量對綜合隸屬函數值的貢獻最大。說明pH值4.5和pH值5.5處理有利于馬尾松種子萌發和生長，而pH值3.5時對馬尾松種子萌發和生長起抑制作用。

3 討論與結論

馬尾松種子能在長汀離子型稀土礦廢棄地萌發生長，說明其對酸脅迫環境有一定耐性，對其在酸脅迫環境下的萌發生長情況和適應機制進行研究發現，pH值5.5對馬尾松種子萌發具有促進作用；pH值3.5、4.5、5.5均對馬尾松種子活力指數起抑制作用，pH值3.5的馬尾松種子活力受抑制程度最明顯。歐陽玲研究發現，白三葉種子的胚根長、發芽指數、發芽率等指標均隨pH值減小呈現出先增加后減小的變化，且弱酸環境(pH值6.0)最有利白三葉種子萌發，本研究結果與之類似。本研究還發現，隨pH值降低，馬尾松胚根和胚芽出現越來越短小現象，且酸脅迫對胚根的影響大于胚芽。周娟等研究發現，土壤酸化對植物根系的毒害比芽嚴重，導致其無法正常生長，本研究結果亦與之一致。這可能是過多的H直接作用于植物根系，破壞了根系細胞壁結構穩定性，造成細胞死亡導致。

表4 不同程度酸脅迫下馬尾松種子各萌發生長指標的隸屬函數值

MDA通常作為生物標志物來評價非生物脅迫下質膜和胞內細胞器的氧化損傷程度。本研究發現，馬尾松種子MDA含量在pH值3.5時顯著增加，體內產生大量活性氧(ROS)。羅良旭等發現，強酸環境(pH值≤3.5)紫萼玉簪的細胞質膜過氧化反應加劇，MDA含量增加，認為可能是ROS產生速率超出了細胞的清除能力，本研究結果與其基本一致。植物中脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖可保護蛋白質，對維持細胞膨壓以及促進植物體內ROS清除有重要作用，可提高植物在逆境脅迫下的耐性。本研究發現，露白期馬尾松種子體內脯氨酸隨pH值降低不斷積累，尤其在pH值3.5時脯氨酸含量顯著增加。研究表明，脯氨酸在維持細胞質酸度、調節線粒體功能、觸發特定基因的表達、提高馬尾松種子對逆境的耐性上發揮了重要作用，pH值3.5時脯氨酸含量提高有利于馬尾松種子正常萌發生長。王一鳴等發現，景天三七在輕度土壤酸脅迫(pH值5.6)時可通過增加脯氨酸維持細胞滲透壓平衡，以保護種子免受自由基影響。本研究發現，馬尾松種子在發芽期的脯氨酸積累量隨pH值降低呈先增后減的變化，在pH值4.5時顯著高于對照組，維持了細胞滲透壓平衡，這與前人研究結果一致。本研究還發現，露白期馬尾松種子的可溶性蛋白含量在酸脅迫下顯著低于對照組，與馬尾松胚芽和胚根在酸脅迫下的生長規律正相關，說明可溶性蛋白含量減小影響了胚芽和胚根的生長。王莉莉發現pH值5.5和pH值4.5處理下牡丹可溶性蛋白含量持續減小，本研究結果與其一致。這可能是由于酸脅迫抑制正常蛋白合成并加快其分解，或是酸脅迫下正常蛋白的分解速度遠大于合成速度，馬尾松種子體內代謝活動減慢，從而馬尾松種子萌發生長受到抑制。本研究結果顯示，可溶性糖含量在馬尾松種子露白期呈先降后升的變化，pH值3.5處理可溶性糖含量顯著增加。侯培軍等發現，藍杉幼樹在強酸(pH值4.0)條件下可溶性糖含量顯著增加，為幼樹在強酸下的生命活動提供能量來源，維持了藍杉正常生長，本研究結果與之一致。這可能是馬尾松種子為了抵御強酸脅迫，從而產生大量可溶性糖。本研究發現，酸脅迫條件下馬尾松種子露白期和發芽期脯氨酸、可溶性蛋白及可溶性糖含量均高于未萌發的種子，說明馬尾松種子能通過保護蛋白質、細胞膜等結構的完整性以及清除ROS來進行自我調節， 適應酸脅迫， 正常萌發生長。抗氧化酶活性是植物種子組織抵抗自由基和逆境脅迫的必要基礎，只有自由基的產生和消除達到平衡，才能防止植物種子被自由基毒害。其中，CAT是植物細胞的抗氧化防御酶，在植物受環境脅迫時通過清除體內HO來保護植物；POD通過催化由HO參與的氧化反應，使HO還原成水，從而達到保護細胞的作用；SOD可催化超氧化物歧化反應，使活性氧對植物種子細胞的毒害減輕。本研究發現，露白期馬尾松種子通過提高POD活性來分解HO，從而達到清除活性氧，減小MDA含量的目的；發芽期POD活性總體呈降低趨勢，但CAT和SOD活性均有不同程度的升高，保證了自由基的產生和消除達到平衡，減輕酸脅迫對馬尾松種子的毒害，有助于馬尾松種子在不同程度酸脅迫下萌發生長；而未萌發馬尾松種子體內抗氧化酶活性均有不同程度降低，MDA含量不斷升高，抑制了馬尾松種子的萌發。這一結果與王光濤等對冬小麥葉片在酸脅迫下SOD、CAT活性不斷降低的研究結果不同，可能是由于本研究選用的植物種類不同，且對植物的研究階段和部位不同，導致植物體內抗氧化酶活性變化情況不同，對酸脅迫的耐受度不同。

綜上，馬尾松種子萌發對酸脅迫具有較強耐性，pH值4.5和pH值5.5對馬尾松種子萌發和生長有促進作用，而pH值3.5時有抑制作用；酸脅迫對馬尾松種子萌發過程中胚根生長抑制性大于胚芽；脯氨酸和可溶性糖對酸脅迫下馬尾松種子萌發生長生理過程的調節上發揮了重要作用；POD在種子萌發露白期，CAT和SOD在發芽期清除體內HO減輕酸脅迫對其危害上發揮了重要作用。