菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族的鑒定及表達分析

馮獻君， 吳英華， 史 艷， 侯雷平， 李梅蘭

(山西農業大學園藝學院，山西太谷 030801)

菜心(L. ssp.var.Tsen et Lee)別稱菜薹，是十字花科蕓薹屬白菜亞種中的一個變種，在華南地區廣泛栽培，而在我國北方地區屬稀有蔬菜。近年來，隨著社會發展和人員的流動，菜心的栽培范圍逐漸擴大，栽培區域逐漸北移。菜心以幼嫩的薹莖和花蕾為可食用部位，而花薹的發育決定其產量和品質。目前關于花薹營養物質積累方面的研究較少，主要集中在花薹形成的調控機制中。蔗糖、葡萄糖和果糖等可溶性糖是菜心花薹中重要的營養物質，其中葡萄糖和果糖在菜心的甜度及口感方面起重要作用，它們在蔗糖轉化酶的水解作用下進一步轉化成己糖磷酸酯參與細胞代謝，因此蔗糖轉化酶在調節菜心各個器官的營養品質形成(尤其是糖的累積利用)中是必不可少的。

植物通過光合作用固定碳源，產生植物生長發育所需的營養物質，并從源器官運輸到庫器官中，而蔗糖是主要的產物之一。蔗糖在降解過程中的關鍵酶是蔗糖轉化酶和蔗糖合成酶，其中蔗糖轉化酶的作用不可逆。Barratt等研究表明，蔗糖轉化酶在植物生長發育和初級氮代謝中至關重要。根據亞細胞定位將蔗糖轉化酶分為細胞壁蔗糖轉化酶(CWINV)、液泡蔗糖轉化酶(VINV)和細胞質蔗糖轉化酶；根據最適pH值又可分為酸性蔗糖轉化酶和中性蔗糖轉化酶。前二者屬于酸性蔗糖轉化酶，后者屬于中性蔗糖轉化酶。中性轉化酶活性較低且不穩定，酸性蔗糖轉化酶屬于-呋喃果糖苷酶，是糖基水解酶家族 32(GH32)的成員之一，其在植物生長發育及蔗糖代謝中發揮關鍵作用。

近年來，酸性蔗糖轉化酶已在玉米、擬南芥、番茄等植物中廣泛研究，蔗糖轉化酶在菜心中的相關研究較少。因此，本研究對菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族成員進行鑒定，從理化性質、染色體定位、系統進化樹、蛋白質的二級結構以及保守基序進行分析，以期為進一步探索菜心酸性蔗糖轉化酶的多樣性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

本試驗于2021年7月在山西農業大學園藝學院實驗室完成。

1.2 菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族鑒定及蛋白質的理化性質分析

先從擬南芥信息資源網站(TAIR)(http：//www. Arabidopsis. Org)找到擬南芥中已鑒定的8個酸性蔗糖轉化酶家族基因及氨基酸序列，再根據筆者所在實驗室已有的轉錄組數據并結合大白菜全基因組數據庫(BRAD)進行同源搜索，初步篩選得到菜心蔗糖轉化酶基因家族成員。通過NCBI-CDD數據庫分別對所有基因序列進行保守結構域檢查，刪除不完整序列，最終獲得菜心酸性蔗糖轉化酶基因。利用相同的方法分別鑒定得到13個甘藍、9個水稻、8個黃瓜的酸性蔗糖轉化酶基因。對篩選得到的菜心酸性蔗糖轉化酶家族蛋白質序列，使用在線軟件ExPASy(http：//www.expasy.org/)進行理化性質的分析。

1.3 基因家族系統進化樹分析

使用MEGA 7.0軟件對菜心、擬南芥、甘藍、水稻和黃瓜酸性蔗糖轉化酶家族蛋白質序列進行比對，構建系統發育樹。利用在線軟件iTOL(http：//itol.embl.de/)修飾美化進化樹。

1.4 基因染色體定位

菜心酸性轉化酶基因染色體定位圖使用在線工具MG2C(http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)繪制。

1.5 蛋白質的二級結構預測及亞細胞定位

菜心酸性蔗糖轉化酶家族蛋白質二級結構的預測使用在線軟件SOPMA(http：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)進行。亞細胞定位通過在線工具CELLO(http：//cello.life.ntcu.edu.te/)進行。

1.6 基因家族結構及蛋白質保守基序分析

菜心酸性蔗糖轉化酶基因結構的分析使用在線軟件GSDS(http：//gsds.gao-lab.org/index.php)進行。使用在線軟件MEME(https：//meme-suite.org/meme/tools/meme)和TBtools軟件繪制蛋白質保守基序圖。

1.7 酸性蔗糖轉化酶基因表達分析

根據菜心不同器官的轉錄組數據，分析酸性蔗糖轉化酶家族基因在各個器官中的表達情況。

2 結果與分析

2.1 菜心酸性蔗糖轉化酶基因的染色體定位分析

為了探討菜心酸性蔗糖轉化酶基因在染色體上的分布，使用在線軟件MG2C信息可視化網站分析，可知菜心的13個酸性蔗糖轉化酶基因分布在A01、A03、A04、A05、A06、A09和A10號染色體上(圖1)。這13個酸性蔗糖轉化酶基因不均勻地分布在7條染色體上。其中定位在A09號染色體上的基因最多，有3個。A01和A10號染色體上定位的基因最少，均為1個，其余4條染色體上均定位到2個基因。

2.2 菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族的系統進化樹分析

為了進一步探究菜心酸性蔗糖轉化酶基因的進化關系，使用MEGA 7.0軟件選用甘藍、水稻、黃瓜和擬南芥的酸性蔗糖轉化酶家族基因為參考序列構建系統發育樹。結果(圖2)顯示51個蔗糖轉化酶基因分為2類，分別為液泡蔗糖轉化酶基因()、細胞壁蔗糖轉化酶基因()。其中擬南芥有2個液泡蔗糖轉化酶基因，6個細胞壁蔗糖轉化酶基因；菜心有4個VINV，9個CWINV；甘藍有3個VINV，10個CWINV；水稻有6個CWINV，3個VINV；黃瓜僅有1個VINV。從系統發育樹中可以看出擬南芥已知的酸性蔗糖轉化酶基因及其對應的菜心基因均聚在一個分支上，說明它們的進化關系較近，結構和功能相似或相同。

2.3 菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白質的理化性質

通過對菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白質進行理化性質分析，發現其氨基酸數量、分子量、等電點、原子總數、不穩定系數、脂肪系數及親水性均不一(表1)。菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族成員編碼的氨基酸殘基為418～800個，其中大部分都集中在500～650個之間。分子量為47.49～90.38 ku，與氨基酸數量變化趨勢一致。等電點(pI)為4.96～9.19，其中液泡蔗糖轉化酶基因家族蛋白的pI均小于7.5，說明液泡蔗糖轉化酶基因家族蛋白均屬于酸性蛋白。當蛋白質的不穩定系數大于40時，容易降解。菜心酸性轉化酶家族蛋白的不穩定系數只有1個大于40，其余均小于40，為穩定蛋白。脂肪系數在69.19～82.31之間。親水性均為負值，說明所有蛋白質都是親水性蛋白。

2.4 菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白質的二級結構預測及亞細胞定位分析

菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白質是由 α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規則卷曲構成(表2)，主要為無規則卷曲和延伸鏈。各蛋白質的二級結構均表現為無規則卷曲>延伸鏈>α-螺旋>β-轉角。無規則卷曲占比在49.90%～56.75%之間，α-螺旋占比在12.75%～19.94%之間，延伸鏈占比在21.25%～28.80%之間，β-轉角占比在4.60%～6.46%之間(表2)。

表1 菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白質理化性質

表2 菜心酸性蔗糖轉化酶家族蛋白二級結構預測及亞細胞定位分析

菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白質亞細胞定位預測結果(表2)表明，液泡蔗糖轉化酶基因家族蛋白和細胞壁蔗糖轉化酶基因家族蛋白質定位于細胞壁、周質及外膜上，推測菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白在這3個地方發揮作用。

2.5 菜心酸性蔗糖轉化酶家族基因的結構分析

參考大白菜基因組數據庫得到菜心蔗糖轉化酶蛋白質序列對應的基因序列及蛋白質編碼區(CDS)序列，并確定了其內含子和外顯子的組成，構建了菜心酸性蔗糖轉化酶家族基因的基因結構(圖3)，圖中黃色為菜心酸性蔗糖轉化酶基因的CDS。從圖3可以看出，菜心酸性蔗糖轉化酶家族基因所含的CDS為3～9個，其中含有6、7個CDS的基因均有4個。含有9個CDS，和含有5個CDS，含有4個CDS，僅含有3個CDS。CDS數量有差異，表明菜心酸性蔗糖轉化酶基因結構存在多樣性。

2.6 菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白質的保守基序分析

為了進一步研究菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白質的結構特征及蛋白多樣性，使用在線軟件MEME對菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白保守基序進行分析，確定了10個保守基序(motif1～motif10)類型。由圖4可知，13個菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白質均含有motif 1、motif 2、motif 4、motif 5、motif 8和motif 10。有8個蛋白質含有所有的保守基序，說明菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白保守性較高。、和不含有motif 9，和不含有motif 6，不含有motif 3、motif 6 和motif 7。4個液泡蔗糖轉化酶基因家族蛋白中有3個均含有10個保守基序，9個細胞壁蔗糖轉化酶基因家族蛋白中有5個均含有10個保守基序，表明液泡蔗糖轉化酶基因家族蛋白的保守性要高于細胞壁蔗糖轉化酶基因家族蛋白。成員的保守基序排布不同，構成了蛋白質的多樣性。

2.7 酸性蔗糖轉化酶家族基因表達模式分析

利用菜心不同器官轉錄組數據分析酸性蔗糖轉化酶家族基因在葉片、薹莖和花蕾中的表達特征，結果(圖5)表明，13個基因均至少在1個器官中表達，其中有10個基因在各個組織中均有表達，和在薹莖中有很高的表達量，在花蕾中有很高的表達量，說明這些基因在菜心薹莖和花蕾營養物質積累中具有重要作用。此外，部分基因在不同部位中存在特異性表達，如和在花蕾中特異性表達。

3 討論與結論

近年來，眾多的研究表明，酸性蔗糖轉化酶在植物生長發育、營養物質分配及表達調控方面發揮著關鍵作用，進而提高植物的產量及品質，這為人們研究植物中酸性蔗糖轉化酶基因奠定了基礎。植物中糖的代謝和積累與其產量和品質密切相關，蔗糖是高等植物光合作用的主要產物之一。本研究通過對比擬南芥酸性蔗糖轉化酶基因家族，在菜心中鑒定出13個酸性蔗糖轉化酶基因家族成員，數量上與擬南芥、番茄相近。

通過生物信息學分析軟件對菜心酸性轉化酶家族基因進行理化性質分析，發現13個菜心酸性轉化酶基因家族蛋白質成員的氨基酸數量為418～800個，其中的為418個，少于其他的基因。酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白的氨基酸數量有很大差異，主要是由于外顯子和內含子數量不同導致的，植物中該基因的典型結構包括7個外顯子和6個內含子。因此、這2個細胞壁蔗糖轉化酶基因蛋白氨基酸數量少是由于有4個外顯子，有3個外顯子。與其他酸性蔗糖轉化酶差異明顯，說明CWINV4()和CWINV5()存在外顯子丟失情況。從酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白序列的保守基序來看，大部分基因中都包含10個保守基序且排序一致，說明菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白質具有高度保守性。通過分析酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白的理化性質發現液泡蔗糖轉化酶的等電點低于細胞壁蔗糖轉化酶。相關研究表明，高等植物中低等電點的酶為液泡蔗糖轉化酶，高等電點的酶為細胞壁蔗糖轉化酶，且分別定位到液泡和細胞壁，本研究中通過亞細胞定位將菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族蛋白質定位在細胞壁、外膜和周質上，表明這些基因在細胞壁、外膜和周質中發揮作用。

本研究利用擬南芥8個酸性蔗糖轉化酶家族基因作為參考序列，根據筆者所在課題組已有的菜心轉錄組數據結合大白菜全基因組數據庫對菜心所有酸性蔗糖轉化酶家族基因進行鑒定，識別出了13個菜心酸性蔗糖轉化酶基因家族成員，它們的氨基酸數量大部分為500～650個，分子量變化與氨基酸數量變化趨勢一致。其蛋白質二級結構無規則卷曲所占比例最高。13個基因中有8個基因均含有10個保守基序。系統發育分析結果顯示，這些基因分為2類，其中菜心細胞壁蔗糖轉化酶基因()9個，液泡蔗糖轉化酶基因()4個，它們不均勻地分布在7條染色體上，其家族中大部分基因均含有6個或7個外顯子。13個酸性蔗糖轉化酶基因在菜心薹莖和花蕾中高表達的成員較多。這些結果有助于理解酸性蔗糖轉化酶基因在菜心蔗糖代謝調控中的作用，同時也為探究酸性蔗糖轉化酶基因多樣性提供了數據基礎。