EGFR、TSP1在賁門癌組織中的表達及臨床意義

王 田 左德宇 劉亞清

河南省商丘市第一人民醫院消化內科 476100

賁門癌(Adenocarcinoma of gastric cardia，AGC)又稱胃食管交界腺癌，指胃部和食管黏膜交界處線下3cm范圍內的惡性腫瘤，臨床上具有早期診斷滯后、預后差等特點[1-2]。近幾年發病率逐漸升高，已成為威脅人們健康的惡性腫瘤之一，因此研究AGC的發病機理和術后觀察具有重要意義。有研究表明，表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)的表達有助于腫瘤的發展、血管生成、轉移和浸潤，目前已成為腫瘤分子治療的靶點[3-4]。凝血酶敏感蛋白-1(Thrombin sensitive protein, TSP1)屬于內源性的血管生成抑制劑，可通過抑制血小板的聚集，降低細胞黏附性，減少血管生成來抑制腫瘤的發生與發展[5-6]。在正常的生理狀態下，促血管生成因子和抑血管生成因子保持著微妙的動態平衡，當機體發生癌變時，這種平衡狀態將會被打破，促血管生成因子增多或/和抑血管因子減少[7]。因此，在臨床上研究促血管生成因子與抑血管生成因子的表達水平具有重大的意義。但是關于AGC組織中EGFR、TSP1水平研究未見報道，本文采用免疫組化法探究二者在AGC患者體內的表達情況及與預后關系，以期為AGC發生發展的研究提供一定的參考指標。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2016年3月—2018年3月收治的AGC患者90例。所有患者均經手術治療，且均經臨床病理科證實為AGC患者。本組患者年齡24～82歲，平均年齡(48.27±5.47)歲；男59例，女31例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ期61例；有淋巴結轉移58例，無淋巴結轉移32例；病理類型：高分化腺癌21例、中分化腺癌32例，低分化腺癌37例。納入標準：(1)患者及家屬對本次研究知情；(2)患者經臨床病理診斷確診為AGC，術前均未接受放療或化療等治療手段。排除標準：(1)心臟病、高血壓、腎臟、肝臟等疾??；(2)合并有其他惡性腫瘤不可進行手術治療者。同時選取每例患者距離腫瘤邊緣5cm以上切緣正常的胃黏膜組織作為對照組。

1.2 試劑和儀器 鼠抗人EGFR，鼠抗人TSP1購于美國Neomarker公司(稀釋比例為1∶100)。

1.3 樣品收集和保存 (1)組織樣品：所有患者均在手術中取賁門處病灶組織6塊(體積約為1cm3，AGC組)和距離腫瘤邊緣5cm以上切緣正常的胃黏膜組織(對照組)，用無菌水沖洗3次后置于液氮罐中過夜，最后放置于-80℃冰箱中(所有操作在取樣10min內完成)。

1.4 實驗方法 采用免疫組化法測定受試者賁門組織中EGFR、TSP1表達情況，用已知陽性的病理切片、PBS代替一抗分別作為陽性和空白對照。操作步驟如下：將石蠟包埋的組織切成厚度3～5μm的切片，烘干、二甲苯脫蠟，脫水、修復后滴加鼠抗人EGFR、TSP1單克隆抗體，經過孵育、PBS沖洗后滴加二抗，隨后在經過孵育、復染等過程后固定，顯微鏡下觀察。

1.5 結果判定 實驗結果由三位專業人員共同進行評定，EGFR陽性主要表達于細胞膜或細胞質，TSP1陽性主要表達于細胞質。陽性強度評分為0、1、2、3分，分別代表無染色、淺黃色、黃色、棕黃色；任意選3個高倍視野計算陽性細胞所占比例，評分為0、1、2、3分，陽性細胞所占比例分別為<10%、10%～<30%、30%～<60%、≥60%。以染色強度與陽性細胞所占比例的評分乘積評估EGFR、TSP1表達情況，將評分劃分為4個等級，即0～1分、2～3分、4～6分、7～9分，分別表示陰性(-)、弱陽性(+)、中度陽性(++)、強陽性(+++)。其中-和+為EGFR、TSP1低表達，++和+++為EGFR、TSP1高表達。

1.6 統計學方法 用SPSS22.0軟件處理數據及繪圖，計數資料以[n(%)]表示，行χ2檢驗；計量資料以均數±標準差表示，行t檢驗。EGFR、TSP1水平與AGC患者生存率的關系以Kaplan-Meier生存曲線進行分析，并使用COX回歸模型分析影響AGC患者預后的危險因素。以P<0.05表示差異有統計學意義。

1.7 隨訪 患者治療后接受12～48個月的隨訪，隨訪形式為門診復查、上門或電話詢問，隨訪終點為患者死亡或隨訪至2018年4月30日，記錄患者的死亡時間和生存人數。

2 結果

2.1 AGC組織及正常組織EGFR、TSP1水平對比 AGC組織中EGFR陽性表達率顯著高于對照組(P<0.05)；TSP1陽性表達率明顯低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1兩組EGFR、TSP1表達水平對比[n(%)]

2.2 EGFR、TSP1水平與AGC患者臨床病理指標的關系 EGFR、TSP1水平與AGC的分化程度、淋巴轉移、TNM分期密切相關(P<0.05);與AGC患者的年齡、性別沒有相關性(P>0.05)。見表2。

2.3 EGFR、TSP1水平與AGC患者生存率的關系 EGFR高表達者中位生存時間明顯短于EGFR低表達者(17.44個月VS 25.54個月，P<0.05)，見圖1；TSP1低表達者中位生存時間明顯短于TSP1高表達者(16.83個月VS 25.40個月，P<0.05)，見圖2。

2.4 影響AGC患者預后的危險因素分析 TNM分期(Ⅲ)、EGFR高表達、TSP1低表達是影響AGC患者不良預后的獨立危險因素(P均<0.05)，見表3。

3 討論

AGC過去一般被認為是胃癌或者食管癌的一種，但是隨著醫學技術的進步，通過胃鏡檢查和病理學診斷將其獨立出來進行研究。到目前為止AGC的發生發展原因尚不清楚，學術界大多認為AGC的發生發展是多階段病理改變的過程，是環境因素和遺傳因素共同作用的結果。近幾年AGC患者呈年輕化的趨勢發展，并且AGC患者死亡率高、醫療花費高，因而給患者及家屬帶來巨大的精神和經濟壓力，因此研究與AGC發生發展相關的生物標志物用于AGC的早期診斷或術后觀察已成為目前研究的熱點內容。

表2EGFR、TSP1與AGC患者臨床病理指標的關系[n(%)]

圖1EGFR水平與AGC患者生存率的關系

圖2TSP1水平AGC患者生存率的關系

表3影響AGC患者預后的危險因素分析

腫瘤的發生是局部組織細胞發生無控增殖的現象，腫瘤的生成需要血管輸送大量營養物質，因此阻斷血管生成切斷腫瘤營養補給線是治療腫瘤的新途徑。EGFR是硌氨酸激酶家族中的一員，在胃癌、肺腺癌、乳腺癌、結腸癌等組織中可高表達。蔣龍翔等[8]研究發現EGFR在肺腺癌患者的胸腔積液和腺癌組織中具有較高的陽性表達率，可作為肺腺癌靶向治療的臨床指標。姜明明等[9]研究表明EGFR在肺腺癌患者基因突變率顯著提高，為臨床肺腺癌的診治提供了理論依據。本文結果表明，與對照組相比，AGC組EGFR陽性率升高，說明EGFR與AGC相關。此外發現，EGFR水平與AGC的分化程度、淋巴轉移、TNM分期密切相關，提示EGFR可能發揮促血管生成作用參與AGC的發生發展過程。生存分析表明EGFR高表達AGC患者中位生存時間短于EGFR低表達患者，COX多因素分析說明EGFR高表達是影響AGC患者不良預后的危險因素，提示EGFR高表達AGC患者預后差，此類患者應注重術后恢復，以免復發。

TSP1是一種細胞外糖基質蛋白，是血管生成抑制因子之一，作為候選抑癌基因被廣泛研究報道。田生平等[10]研究發現在腎上腺皮質腫瘤組織中，mTOR信號通路過度激活能夠上調VEGF表達水平，下調TSP1表達水平，從而促進細胞侵襲和血管生成。Lopez-Ramirez等[11]研究表明下調TSP1表達水平有助于小鼠腦微血管內皮細胞增殖，導致腦海綿狀畸形，使用血管生成抑制劑可緩解病癥。本文發現，與對照組相比，AGC患者組織中的TSP1陽性率明顯降低，提示TSP1與賁門癌相關。此外發現，TSP1水平與AGC的分化程度、淋巴轉移、TNM分期密切相關，說明TSP1低表達不能有效抑制癌變組織血管的生成，從而參與AGC的發生發展過程。生存分析表明TSP1低表達AGC患者中位生存時間短于TSP1高表達患者，COX多因素分析說明TSP1低表達是影響AGC患者不良預后的危險因素，提示TSP1低表達AGC患者預后差，此類患者應定期復查。在賁門癌中，TSP1甲基化導致機體正常生理條件下血管生成平衡，可能導致具有促血管生成和免疫抑制的TGF-β升高[12]。隨后有研究發現，TGF-β通過典型的Smad3和ERK/Sp1信號傳導途徑使EGFR活化并促進乳腺癌的遷移和侵襲[13]。說明二者可能通過某種機制共同參與AGC的發生與發展，可能TSP1低表達，使得機體血管生成平衡打破，導致EGFR高表達。但具體作用機制未見相關報道，后續二者相互作用的機制研究是以后工作的重點。

綜上所述，EGFR在AGC患者組織中呈高表達，TSP1呈低表達，與AGC的分化程度、淋巴轉移、TNM分期密切相關，是影響AGC患者不良預后的危險因素。但是由于本研究納入樣本量較少，關于二者在AGC發生發展中的具體機制還有待進一步深入分析。