妊娠期糖尿病胎盤組織中SOCS3與IRS1、IRS1ser307水平的相關性研究

朱曉琴 蘇 敏

1 南通大學醫學院，江蘇省南通市 226001； 2 南通大學附屬醫院婦產科

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus, GDM)是一種在妊娠期首次發生或發現的不同程度糖代謝異常的內分泌代謝性疾病，在我國GDM發病率已達17.5%～18.9%[1]。GDM與巨大兒、胎兒生長受限、新生兒低血糖等多種不良妊娠結局相關，且GDM孕婦以后發生2型糖尿病的概率顯著增加。因而，在致力于良好控制孕期血糖的同時，探索GDM的發病機制對于早期預防GDM的發生具有重要的臨床價值。

胰島素受體底物1(Insulin receptor substrate 1,IRS1)是調節胰島素信號通路的關鍵分子，當IRS1表水平或其磷酸化水平異常時，都將影響胰島素在細胞內的水平，進而引起胰島素效能下降，誘發胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)[2]，而胰島素抵抗是2型糖尿病發病機制的核心。細胞因子信號轉導抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling-3，SOCS3)是少數具有降血糖作用的脂肪因子之一，同時被認為是胰島素信號傳導通路中的重要負性調節因子[3]。通過查閱文獻發現，目前關于SOCS3與妊娠期糖尿病及胰島素抵抗的相關性研究仍以傳統的胰島素靶器官為主，研究胎盤組織中SOCS3表達與胰島素抵抗的相關性未見報道。

本課題擬分別利用QRT-PCR、免疫組化檢測SOCS3、IRS1在胎盤組織中的表達及分布情況，通過Western blot檢測SOCS3、IRS1、IRS1ser307三種蛋白的表達量，并分析胎盤組織中SOCS3與IRS1、IRS1ser307蛋白表達的相關性；同時分析SOCS3與IRS1、IRS1ser307的相關性，從而探討妊娠期糖尿病胎盤組織中SOCS3對IRS1、IRS1ser307表達水平的影響。以探討GDM胎盤發生胰島素抵抗的分子機制，以及SOCS3作為靶分子在GDM治療中的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象:選取如皋市人民醫院2020年3月—2021年3月就診的單胎、首次妊娠、既往無內外科合并癥的孕婦作為研究對象。其中40例孕期產檢無異常，設為對照組；40例在孕24～28周行OGTT檢查提示GDM(血糖值依據現行GDM診斷標準)，設為妊娠期糖尿病組(GDM組)。所選孕婦均知情同意，并簽署知情同意書。兩組產婦年齡、分娩孕周、孕中期BMI、孕晚期BMI無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1兩組孕婦一般資料比較

1.1.2 主要試劑：SOCS3 Monoclonal Antibody(Proteintech，66797-1-lg)，Anti-IRS1 antibody(ABcam，ab40777)，Anti-IRS1 (phospho S307) antibody (ABcam，ab1194)，Rabbit anti-β actin antibody(Beyotime，AF0003)，Anti-mouse IgG,HRP-linked Antibody(Cell signaling，7076S)，Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody(Cell Signaling，7074S)，DAB顯色試劑盒(BOSTER，AR1022)，聚合HRP標記抗小鼠IgG(BOSTER，SV0001)，聚合HRP標記抗兔IgG(BOSTER，SV0002)，逆轉錄試劑盒(Vazyme，R223-01)，SYBR-Green Master PCR Mix(Vazyme，Q711-02/03)

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片：兩組孕婦足月剖宮產后，取胎盤組織常規方法制作石蠟切片：切片厚度4μm。

1.2.2 HE染色觀察胎盤組織病理變化：常規程序脫蠟染色，蘇木素染色3min，伊紅染色1s。

1.2.3 免疫組織化學染色觀察SOCS3、IRS1的表達定位：切片脫蠟至水。H2O2孵育10min，PBS洗滌5min×3次。枸櫞酸鹽抗原熱修復，PBS洗滌5min。5%BSA 37℃孵育30min。滴加一抗(SOCS3抗體1∶250稀釋， IRS1抗體1∶50稀釋)，4℃孵育過夜。PBS洗5min×3次，二抗37℃孵育30min。PBS洗5min×3次，DAB顯色，蒸餾水終止顯色。蘇木素復染3min。梯度脫水和透明，封片，隔天拍照。先低倍鏡觀察，選擇目標區域高倍鏡下，隨機觀察5個視野，陽性表達呈棕黃色。

1.2.4 PCR檢測SOCS3、IRS1的基因表達水平：Trizol法提取總RNA。根據試劑盒說明書行逆轉錄反應和熒光定量PCR。引物序列見表2。

表2PCR引物序列

1.2.5 Western Blot檢測SOCS3、IRS1、 IRS1ser307蛋白表達水平:常規方法提取蛋白。配制分離膠及濃縮膠。蛋白上樣量為200μg。電泳先80V再120V。300mA 90min轉膜。室溫封閉2h。一抗(SOCS3、IRS1抗體1∶1 000稀釋， IRS1ser307抗體1∶250稀釋)4℃過夜，PBST洗10min×3次。二抗(1∶2000稀釋)室溫90min，PBST洗20min×3次。ECL顯色。

2 結果

2.1 HE染色觀察胎盤組織病理結構 對照組(見圖1a)胎盤組織無明顯異常；GDM組(見圖1b)胎盤血管分布紊亂，管壁增厚且管腔狹窄，血細胞減少，胎盤絨毛成熟不良且絨毛間質血管充盈，合體滋養層異常，細胞滋養層增生，基底膜變厚。

a b

2.2 免疫組織化學染色觀察SOCS3的表達定位 SOCS3主要特異性表達于細胞質中，SOCS3在對照組(見圖2a)中表達很弱，幾乎無表達；在GDM組(見圖2b)中表達升高，呈黃色，為陽性表達。

a b

2.3 免疫組織化學染色觀察IRS1的表達定位 IRS1主要特異性表達于細胞質中，IRS1在對照組(圖3a)中染色呈棕黃色，為強陽性表達，在GDM組(圖3b)中表達降低，幾乎不表達。

a b

2.4 PCR檢測SOCS3、IRS1的基因表達水平 應用熒光定量PCR技術分析SOCS3、IRS1在胎盤組織中的基因表達水平。與對照組相比，在GDM組胎盤中SOCS3(見圖4a)表達上調(P<0.01)，其表達量是對照組的5.39倍(5.39±4.17)；IRS1(見圖4b)則是表達下調(P<0.01)，其表達量僅有對照組的一半左右(0.48±0.31)。

圖4PCR檢測SOCS3、IRS1的基因表達水平

2.5 Western Blot檢測SOCS3、IRS1、 IRS1ser307的蛋白表達水平 應用Western Blot技術分析SOCS3、IRS1、 IRS1ser307在胎盤組織中的蛋白表達水平，與對照組相比，GDM組胎盤中SOCS3(圖5a、b)表達上調(P<0.01)，其表達量是對照組的3.06倍(3.06±0.46)；IRS1(圖5a、c)表達下調(P<0.01)，其表達量僅有對照組的2/3左右(0.67±0.13)；IRS1ser307(圖5a、d)表達上調(P<0.01)，其表達量是對照組的2.97倍(2.97±0.24)。

圖5Western Blot檢測SOCS3、IRS1、 IRS1ser307的蛋白表達水平

2.6 GDM胎盤組織中SOCS3與IRS1、IRS1ser307蛋白表達的相關性分析 為進一步研究SOCS3與IRS1、IRS1ser307蛋白表達的關系，采用Spearman 秩和相關性分析GDM胎盤組織中SOCS3與IRS1、SOCS3與IRS1ser307的相關性。經分析SOCS3與IRS1之間的相關性(r=-0.635 4，P<0.000 1)，SOCS3與IRS1ser307之間的相關性(r=0.902 8，P<0.000 1)均呈強相關，見圖6。

圖6SOCS3與IRS1、IRS1ser307蛋白表達的相關性分析

3 討論

妊娠期糖尿病(GDM)是一種常見的妊娠期合并癥，且屬于高危妊娠。雖然國內外對于GDM的研究已有40多年的時間，但GDM的發病機制至今仍未完全闡明。而機體局部和系統性胰島素抵抗(IR)是GDM的核心問題[4]。近年來多項研究認為，GDM的發生可能與胰島β細胞功能缺陷、激素水平、炎性因子、遺傳信息、日常飲食等因素有關。正常妊娠期間，孕婦對胰島素的敏感性及反應性降低，因此IR可能是造成葡萄糖的攝取及利用障礙，導致GDM的關鍵原因之一[5]。

機體內糖脂的代謝依賴于胰島素，胰島素則需要與細胞膜表面的胰島素受體結合，激活胰島素受體底物1(IRS1)，活化的IRS1進一步啟動下游信號轉導途徑。IRS1是胰島素信號通路中連接細胞內外的信號蛋白，是關鍵性分子，其表達量和活化水平極大地影響著胰島素生理效應[6]。而IRS1不同位點的磷酸化，由于蛋白激酶的影響，對胰島素信號傳導進行正性或負性調控[7]，如絲氨酸位點Ser307、Ser612、Ser1101活化抑制信號傳導，而酪氨酸位點Tyr 989活化則是促進信號傳導。在正常生理條件下，胰島素與細胞表面受體結合前，IRS1以絲氨酸磷酸化為主，以關閉信號通路；當胰島素結合受體后，IRS1酪氨酸位點磷酸化，競爭性抑制絲氨酸位點的磷酸化，同時啟動下游信號通路，從而發揮生理效應[8]；但IR發生時，由于高糖等狀態的存在，胰島素與受體結合后，IRS1酪氨酸位點的磷酸化減弱，絲氨酸磷酸化作用增強，抑制了胰島素信號向下游傳導，進一步加重IR、高糖狀態[9-10]。研究表明，IRS1表達量減少以及過度的絲氨酸磷酸化可導致胰島素信號傳導紊亂[11-12]。Hu等[13]在人肝細胞癌(HepG2)中發現，橙皮苷通過下調TLR4，上調IRS1的表達，來改善HepG2細胞中的IR。Zhang等[14]也發現WEE(Edgeworthia gardneri)在HepG2細胞中可能通過IRS1/GSK3β/FoxO1信號通路的調控來發揮抗IR作用，WEE通過上調IRS1，以及IRS1酪氨酸磷酸化的表達來降低IR作用。本實驗在GDM組中，IRS1表達降低，IRS1ser307表達升高，這與文獻研究一致。

SOCS3在機體內分布廣泛，與人體脂質代謝、免疫、炎癥、妊娠等密切相關。SOCS3可負調控生長激素、瘦素、泌乳素等細胞因子的信號傳遞，還與多種受體如促紅細胞受體、胰島素受體、瘦素受體等連接發揮對多種因子的調節作用。SOCS3 可競爭性地與胰島素受體及活化的IRS 相結合，阻礙正常的IRS/PI3K/PKB 信號轉導途徑，而抵抗素可上調 SOCS3 的表達，誘導 IR 的發生。在 IR 狀態下，IRS 的絲氨酸磷酸化水平升高，并抑制酪氨酸磷酸化水平，從而降低IRS 的活性、加速 IRS 的降解，繼而影響胰島素信號的傳遞。Jorgensen等[15]的研究發現特異性敲除小鼠骨骼肌中SOCS3基因后，IRS1 的表達水平和Akt的磷酸化明顯升高，從而抑制了高胰島素血癥和胰島素抵抗的發展。Li等[16]研究發現miR-152可以通過下調SOCS3的表達來抑制GDM小鼠的肝臟IR。Xu等[17]則在2型糖尿病(T2DM)中研究發現，Angptl7通過上調SOCS3的表達，導致IRS1在蛋白酶體中的降解，進而促進IR和T2DM。Chen等[18]在HepG2 和 C2C12細胞中研究發現黑果樹花青素通過下調SOCS3表達，提高IRS1水平，降低IRS1ser307表達，來減弱IR作用，增強HepG2 和 C2C12 細胞中的胰島素敏感性和糖原合成。本實驗在GDM組中，SOCS3表達水平升高，這與文獻研究結果一致。

本研究實驗數據還顯示GDM產婦胎盤組織中SOCS3蛋白表達水平與IRS1表達水平呈負相關，與IRS1ser307表達水平呈正相關。提示SOCS3可能在GDM的IR發展中起一定作用，SOCS3有望成為GDM治療的新方向、新靶點。